Введение

Амеба рода Acanthamoeba — это повсеместно встречающееся простейшее, живущее в воздушной и водной среде, а также в почве. Жизненный цикл Acanthamoeba представлен двумя стадиями — активной стадией (трофозоит) и стадией покоя (циста). Показатели заболеваемости акантамебным кератитом (АК) зависят от географических факторов, способов диагностики и соблюдения правил гигиены при использовании контактных линз.

Широкое применение контактной коррекции привело к росту заболеваемости АК [1]. Так, например, в Нидерландах отмечен рост заболеваемости АК с 2009 по 2015 г. в 3 раза — до 1 случая на 20 тыс. человек, использующих мягкие контактные линзы (МКЛ), в год [2]. Среди населения в целом распространенность АК остается небольшой. К примеру, в Великобритании в 2019 г. АК составил 4,2% от общего количества случаев инфекционных кератитов; последние выявлялись у 32,4—37,1 человека на 100 тыс. населения за год [3].

Внедрение Acanthamoeba в роговицу приводит к тяжелому кератиту с выраженным болевым синдромом, а в ряде случаев — к слепоте [4, 5].

Считается, что ранняя диагностика улучшает прогноз [4, 5]. Однако установление диагноза в повседневной практике часто затруднено в связи с тем, что ранние клинические проявления АК не являются специфическими.

Лабораторная диагностика основана на световой микроскопии ткани роговицы — соскоба эпителия, биоптата стромы и роговичных дисков, удаленных в ходе кератопластики, а также на микробиологическом методе — культивировании [6, 7]. Культивирование требует времени (от 2 дней до 2 нед), чувствительность метода варьирует в пределах от 0 до 68% [8]. Для подтверждения диагноза также применяется полимеразная цепная реакция (ПЦР) [9—11], которую можно считать перспективной альтернативой, ее технология постоянно совершенствуется, чувствительность и специфичность приближаются к 80—100% [9], однако данный метод доступен далеко не всем клиникам [12]. Более того, в далеко зашедших случаях АК, когда паразиты проникают в строму роговицы, соскоб может не дать результата и приходится выполнять биопсию. Создается впечатление, что в настоящее время трудности представляет не столько обнаружение акантамеб, сколько забор материала, в котором содержится пригодный для идентификации возбудитель [13]. Следовательно, офтальмологи нуждаются в надежных и неинвазивных методах диагностики АК.

Диагностика инфекционного кератита — одна из важнейших областей применения конфокальной микроскопии роговицы (КМР) in vivo. В 2004 г. Американская академия офтальмологии (AAO) провела анализ доступной литературы применения КМР в диагностике инфекционного кератита и сочла этот метод эффективным дополнительным методом диагностики АК [14].

Принцип конфокальной микроскопии впервые описан Марвином Мински в 1955 г., когда он проводил исследования на клетках паренхимы головного мозга. Сузив область исследования и сфокусировав источник света в одной точке, он смог исключить отраженный свет вне точки фокуса, что привело к повышению контрастности и разрешения [15].

К настоящему времени применяются 2 технологии конфокальной микроскопии — лазерная и световая. Прибор HRT работает по принципу излучения лазерной системой когерентного света, который проходит через одну, а затем через другую апертуру, являющуюся сопряженной фокальной плоскостью. Лазерный луч, преломляемый дихроичным зеркалом, проходит вдоль образца в заданной фокальной плоскости. Конфокальная микроскопия дает возможность в режиме in vivo без предварительной подготовки визуализировать цисты акантамебы.

Конфокальный микроскоп ConfoScan создает четкое изображение структуры роговицы, которое при использовании обычного микроскопа представляется размытым. Работа его также основана на аналогичном принципе, однако в отличие от прибора HRT в нем используется некогерентный источник света. Поэтому оптическое разрешение прибора значительно уступает HRT. Сравнительные характеристики приборов представлены в таблице.

Сравнительная характеристика конфокальных микроскопов HRT III с роговичным модулем и ConfoScan 4

Параметр	HRT III с роговичным модулем (Heidelberg, Германия)	ConfoScan 4 (Nidek, Япония)
Оптическое разрешение, пкс/мкм	10	1,2
Размер изображения, пкс	384×384	384×576
Глубина цвета, бит/пкс	8	16
Время сканирования, мс	24	4
Базовая длина волны, нм	670 (диодный лазер)	540—580 (широкополосный ксеноновый источник)

КМР позволяет получить изображения всех слоев роговицы: поверхностного эпителия, базального эпителия, стромы и эндотелия. КМР in vivo используется для исследования структуры роговицы как в норме, так и при многочисленных патологических процессах [16—22]. Зачастую при глубоком расположении акантамеб в ткани роговицы результаты микробиологического исследования могут быть отрицательными, в то время как КМР позволяет обнаружить их [8].

КМР in vivo дает возможность выявить 2 определяющих признака АК: цисты и трофозоиты акантамебы. Помимо этого, при АК отмечаются проявления кератоневрита: прерывистость, четкообразность, изменение диаметра, извитость нервных волокон. На поздних стадиях заболевания визуализируются интрастромальные полости, напоминающие соты [23, 24]. Поскольку КМР — неинвазивный метод, исследование может проводиться неоднократно в ходе лечения пациентов с АК [25, 26].

В отличие от вирусов и бактерий цисты и трофозоиты Acanthamoeba достаточно велики, чтобы их можно было уверенно визуализировать при помощи КМР (типичные размеры трофозоитов варьируют от 25 до 40 мкм; цист — от 10 до 30 мкм, но могут достигать и 100 мкм) [23].

Цисты Acanthamoeba — наиболее характерный признак АК. Они выглядят при КМР как сферические, круглые, яйцевидные или грушевидные гиперрефлективные образования, иногда с двойной стенкой [27, 28].

Цисты локализуются в эпителии, субэпителиальных слоях и строме, имеют двойную стенку, что соответствует внешней эктоцисте и внутренней эндоцисте. Двойная стенка не всегда видна на снимках, что может быть связано с прохождением плоскости изображения не через их центр. В этом случае бывает сложно отличить цисты от лейкоцитов, лимфоцитов и продуктов клеточного распада. Однако высокая отражательная способность и контрастность цист акантамебы может помочь дифференцировать их от окружающих клеток [23, 29].

КМР позволяет также визуализировать трофозоиты, однако их труднее отличить от других гиперрефлективных структур; B. Cho и E. Holland описали трофозоиты как гиперотражающие структуры размером 15—50 мкм, окруженные гипорефлективным отеком. Типичные трофозоиты Acanthamoeba наблюдаются в виде аморфных, неправильных или клиновидных структур [27, 29]. D. Parmar и соавторы описывают их в виде продолговатых веретенообразных структур [8]. Наличие псевдоподий может быть признаком отличия трофозоитов от других клеток, обнаруживаемых в роговице [23].

Радиальный кератоневрит многими исследователями расценивается как характерный признак АК. Его развитие связывают как с адгезией трофозоитов акантамебы к нервным волокнам роговицы, так и с реактивным воспалением нервных волокон под влиянием провоспалительных цитокинов. Сами нервные волокна при этом подвергаются значительным изменениям — появлению четкообразности, в ряде случаев извитости. При АК исследователи отмечают выраженное снижение количества нервных волокон роговицы. Предположительно, это может быть обусловлено прямым повреждающим действием трофозоитов акантамебы на них, индукцией апоптоза, действием провоспалительных цитокинов (особенно интерлейкина-1) [30].

В литературе также описаны изменения роговичной стромы при АК, которые включают в себя гипорефлективные полости, напоминающие соты [23, 24].

Описаны также обширное рубцевание и отек стромы, инфильтрация гиперрефлективными воспалительными клетками. В строме обнаруживаются активированные кератоциты, имеющие повышенную рефлективность по сравнению с нормальными, однако эти изменения могут наблюдаться и при других воспалительных заболеваниях роговицы. Активированные кератоциты имеют яркие ядра, иногда с визуализируемыми цитоплазматическими отростками [24].

С 2004 г. вклад КМР в диагностику АК изучался несколькими группами исследователей. В ретроспективном исследовании D. Parmar и соавторов КМР позволила подтвердить диагноз АК в 61 из 63 случаев [8]. M. Kanavi и соавторы исследовали 133 глаза с инфекционным кератитом, прибегая к КМР и микробиологическому методу (посев соскобов с роговицы и контактных линз). В их исследовании чувствительность и специфичность КМР in vivo в диагностике АК составили 100% и 84% соответственно [31]. E. Tu и соавторы в своей работе провели многократную КМР у 125 пациентов, сравнивая ее результаты с исследованиями биоптата роговицы морфологическим и культуральным методами. При этом чувствительность КМР составила 90,6—92,9%, а специфичность — 77,3—100% [32]. Аналогичное сравнение проведено с ПЦР и культивированием акантамеб, также показавшее высокие показатели чувствительности и специфичности метода [9]. КМР перспективна не только в отношении диагностики, но и с точки зрения мониторинга лечения. Y. Matsumoto и соавторы неоднократно проводили КМР в ходе лечения АК и обнаружили, что трофозоиты и цисты исчезают через 4—6 нед после начала терапии [28]. K. Babu и K. Murthy использовали КМР in vivo для оценки эффективности лечения у пациентов с сочетанным поражением — акантамебным и грибковым кератитом [33]. Некоторые исследователи применяют КМР in vivo для обнаружения цист перед трансплантацией роговицы у пациентов, перенесших АК [12].

Цель исследования — оценить возможности световой и лазерной прижизненной конфокальной микроскопии роговицы в обнаружении морфологических маркеров АК.

Материал и методы

При помощи светового (ConfoScan) и лазерного (HRT) конфокальных микроскопов обследованы 33 пациента (35 глаз) с подозрением на АК, среди них 19 женщин и 14 мужчин. Возраст пациентов составил от 18 до 47 лет.

После инстилляции анестетика (0,5% раствор пропаракаина) пациентам проводили исследование в течение нескольких минут. При этом получали послойную съемку роговой оболочки, прикасаясь специальным наконечником прибора через прослойку иммерсионного геля к поверхности роговицы.

Заподозрить АК позволяют следующие клинико-анамнестические данные: ношение контактных линз, выраженный болевой синдром в начале заболевания, наличие точечной эпителиопатии, псевдодревовидных фигур, кератоневрита — линейных инфильтратов в виде лучей. Одним из наиболее весомых доводов в пользу АК служит обнаружение кольцевидного инфильтрата роговицы. Косвенным признаком АК является отсутствие заметного эффекта от ранее проведенной в других клиниках противовирусной, антибактериальной и кортикостероидной противовоспалительной терапии.

При подозрении на смешанный кератит (АК+ герпетический кератит) дополнительно выполняли исследование соскоба с конъюнктивы и мазка крови методом флюоресцирующих антител (МФА) для выявления активации вируса простого герпеса I и II типов.

У 14 пациентов (14 глаз) наблюдались поверхностные эпителиально-стромальные поражения, у 19 пациентов (21 глаз) — глубокие стромальные формы АК, включая смешанные кератиты.

Все пациенты, кроме одного, пользовались контактными линзами различных типов. Длительность заболевания составляла от нескольких дней до 8 мес. При этом в 18 (51,4%) случаях кератит был представлен смешанными формами — АК сочетался с гнойной инфекцией на 15 (42,9%) глазах, в 3 (8,6%) случаях — с герпетическим кератитом. При АК, осложненном гнойной инфекцией, в большинстве случаев (12 глаз) КМР была невозможна в связи с непрозрачностью гнойно-инфильтрированной стромы роговицы. Таким образом, КМР оказалась технически выполнимой в 23 (65,7%) из 35 случаев.

Результаты

Результаты исследований, которые выполнены при помощи светового (ConfoScan) и лазерного (HRT) конфокальных микроскопов, представлены на рис. 1—11.

Рис. 1. Циста акантамебы (HRT).

Рис. 2. Округлые гиперрефлектирующие образования (цисты) в базальном слое эпителия (указаны желтыми стрелками), одно из которых имеет плотную внешнюю оболочку (обозначено синей стрелкой) (ConfoScan).

Рис. 3. Гиперрефлекторные округлые структуры (цисты) в эпителии (обозначены стрелками) (ConfoScan).

Рис. 4. Гиперрефлекторное образование (циста) в строме (указано синей стрелкой), сотообразные гипорефлективные полости (обозначены желтыми стрелками) (ConfoScan).

Рис. 5. Средние слои стромы роговицы. Большое количество свободно лежащих трофозоитов (обозначены стрелками) (HRT).

Рис. 6. Нервные волокна роговицы и воспалительные клетки Лангерганса (HRT).

Отмечается четкообразность нервов, количество нервных волокон роговицы значительно уменьшено. Число воспалительных клеток Лангерганса увеличено. Звездочками обозначены нервные волокна, стрелками — клетки Лангерганса.

Рис. 7. Тонкие фрагментированные роговичные нервы (обозначены стрелками) (ConfoScan).

Рис. 8. Типичные макрофагальные клетки Лангерганса (обозначены стрелками) (ConfoScan).

Рис. 9. Строма роговицы. Сотовидные гипорефлективные зоны, характерные для акантамебного кератита (HRT).

Рис. 10. Трофозоиты (обозначены красными стрелками), адгезированные к нервному волокну роговицы (обозначены желтыми стрелками) (HRT).

Рис. 11. Стрии глубоких слоев стромы роговицы (обозначены стрелками) (HRT).

С помощью КМР, проведенной 23 пациентам, цисты акантамебы обнаружены в 16 (69,6%) случаях (см. рис. 1—4). В единичных случаях (4 глаза, 17,4%) визуализировали трофозоиты, в том числе адгезированные к нервным волокнам (см. рис. 5, 10). Признаки кератоневрита, такие как изменение диаметра, хода и структуры нервов роговицы (истончение, прерывистость, четкообразность), выявлены на 12 (52,2%) глазах (см. рис. 6, 7).

Сотообразные гипорефлективные полости в строме наблюдались в 7 (30,4%) случаях (см. рис. 9). В 9 (39,1%) случаях мы обнаруживали стрии (складки) — чередующиеся темные полосы, локализованные в глубоких слоях стромы непосредственно перед десцеметовой мембраной (см. рис. 11). Такие изменения ранее многократно описаны другими исследователями при кератоконусе (стрии Фогта) [34], эндотелиальной дистрофии Фукса [35]. Однако упоминаний об их обнаружении при АК мы не встретили. В отличие от вертикальных стрий Фогта при кератоконусе стрии при АК, обнаруженные нами, имели извитой ход и произвольное направление, а также бóльшую выраженность.

У 11 (47,8%) пациентов выявлены активированные кератоциты («стрессовые клетки») (см. рис. 11). Клетки Лангерганса (активированные макрофаги) определяли в 19 (82,6%) случаях. Их наличие косвенно может говорить об активной воспалительной реакции в ответ на внедрение акантамебы в строму роговицы (см. рис. 6, 8).

При КМР, выполненной через 6 мес после клинического выздоровления (18 глаз), специфические признаки АК (цисты, трофозоиты) не обнаруживали; из указанных случаев в 4 случаях при выраженных центральных помутнениях роговицы потребовалось выполнение оптической кератопластики. Ни в одном случае рецидива АК не наблюдалось.

Обсуждение

Разнообразные морфологические изменения стромы роговицы, наблюдаемые в ходе КМР при АК, можно условно разделить на 2 группы: 1) специфические маркеры — цисты и/или трофозоиты акантамебы; 2) неспецифические изменения — явления кератоневрита, стрии, сотовидные гипорефлективные полости, активированные кератоциты, клетки Лангерганса. Интерпретация данных КМР во многом зависит от опыта исследователя.

С помощью КМР in vivo в роговице пациентов с АК цисты обнаружены в 69,6% случаев, трофозоиты — в 17,4% случаев. Относительно низкую частоту обнаружения трофозоитов в наших исследованиях можно объяснить тем, что их сложно отличить от макрофагов, видоизмененных кератоцитов и других патологических изменений в строме. Возможно уменьшение их доли вследствие поздней обращаемости пациентов или действия терапии.

Стрии, которые обнаружены нами в 39,1% случаев, имели извитой ход и произвольное направление. Можно предположить, что их формирование — результат гиперпродукции коллагена кератоцитами, клеточной пролиферации, а также отека стромы. При этом происходит потеря коллагеновых связей между кератоцитами и деформация стромы.

Качество изображений, полученных при КМР, выполненных на HRT, характеризуется по сравнению с ConfoScan более высокой разрешающей способностью. Однако при этом HRT не дает возможности дополнительно увеличить изображения. Тем не менее оба прибора пригодны для обнаружения характерных признаков АК.

Выводы

1. Основную диагностическую ценность представляет обнаружение при конфокальной микроскопии прямых маркеров акантамебного кератита — цист и трофозоитов акантамебы. Как световая, так и лазерная методики пригодны для диагностики акантамебного кератита, однако разрешающая способность лазерной конфокальной микроскопии выше.

2. Неинвазивный характер конфокальной микроскопии роговицы, возможность многократных исследований позволяют верифицировать диагноз акантамебного кератита и осуществлять мониторинг лечения.

3. Метод также позволяет исключать наличие цист акантамебы в строме роговицы перед выполнением оптической кератопластики для снижения риска рецидива акантамебного кератита.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Каспарова Е.А., Марченко Н.Р.

Сбор и обработка материала: Каспарова Е.А., Марченко Н.Р., Сурнина З.В., Митичкина Т.С.

Написание текста: Каспарова Е.А., Марченко Н.Р., Сурнина З.В., Митичкина Т.С.

Редактирование: Каспарова Е.А., Марченко Н.Р., Сурнина З.В., Митичкина Т.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.