Homophile Interaktion von CADASIL-mutiertem Notch3

Einleitung und Fragestellung: Mutationen in NOTCH3 sind die Ursache von CADASIL, der häufigsten monogenen Schlaganfall-Erkrankung. Der Pathomechanismus der Erkrankung ist bisher weitgehend ungeklärt. Als Schlüsselereignis in der Pathologie der Erkrankung gilt die Degeneration glatter Gefäßmuskelzellen. Der Transmembranrezeptor Notch3 wird vorwiegend in diesen Zellen exprimiert. Biochemische Daten weisen auf eine Akkumulation und mögliche Multimerisierung der extrazellulären Domäne des mutierten Rezeptors in den Gefäßwänden. Ziel der vorliegenden Untersuchungen war die Charakterisierung homophiler Interaktionen bei Wildtyp und CADASIL-mutiertem Notch3 in vitro.

Methoden und Ergebnisse: Der Volllängenrezeptor (N3FL) bzw. dessen Extrazellulärdomäne (N3EC) wurden mit unterschiedlichen Epitoptags versehen. Mittels Co-Immunopräzipitation aus Zell-Lysat von transfizierten HEK293-Zellen wird die Interaktion und somit Multimerisierung unter Wildtyp-Proteinen, CADASIL-mutierten Proteinen und zwischen beiden Spezies nachgewiesen. Untersuchungen aus Zell-Lysaten (für N3FL und N3EC) und an aufgereinigten Proteinfragmenten unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen (Western Blot) belegen die Bildung von Multimeren aller Konstrukte in vitro. Cysteinspezifische Alkylierungs- und Vernetzungsexperimente zeigen, dass die Multimerisierung über Disulfidbrückenbildung erfolgt.

Schlussfolgerungen: Unsere Untersuchungen weisen auf homophile Interaktionen und eine Multimerisierung des Notch3-Rezeptors als mögliche Grundlage der für CADASIL charakteristischen Ablagerungen. Der Nachweis von Aggregaten in vitro eröffnet Ansätze für antiaggregatorische Strategien.