胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是一种常见的胃肠道疾病，其特点是胃、十二指肠酸性内容物异常反流至食管，引起食管黏膜损伤和反流症状[1]。据统计，目前13%的全球人口和20%的成年人患有GERD，胃食管反流与反流性食管炎、食管狭窄、巴雷特食管和食管腺癌的风险增加有关[2,3]。近年来，GERD被认为是阻塞性睡眠呼吸暂停（obstructive sleep apnea，OSA）的一个重要诱因[4,5]。OSA是指睡眠期间反复发生上呼吸道塌陷，导致反复发作的呼吸暂停或低通气[6]，具体可表现为夜间反复觉醒、打鼾、白天嗜睡、慢性疲劳、晨起头痛、注意力和记忆力减退、情绪低落等[7]。研究表明，OSA可直接引起间歇性缺氧和高碳酸血症，继而诱发交感神经激活、氧化应激和全身炎症等反应，长此以往可增加心脑血管疾病、高血压和糖尿病等的发病风险[8]。全球大约有10亿30至69岁的成年人患有OSA，其中有40%至60%的OSA患者同时合并有GERD[9-11]。肥胖、吸烟和饮酒等OSA发展因素同时也被确定为GERD的危险因素[12,13]，观察性研究也发现GERD与OSA存在相关性[14,15]。尽管GERD与OSA的临床相关性在观察性研究中已被多次强调，然而他们之间是否存在因果关系尚不明确。
众所周知，观察性研究容易受到混杂偏倚因素的影响。孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）是近年来新起的利用基因型来推断表型与疾病之间关联的研究方法，主要是将单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）作为遗传变异工具变量（instrumental variable，IV），借此评估暴露因素与结果事件之间关联的因果效应[16]。由于这些遗传基因变异源于母代并且在受孕时随机分配，因此它满足时间顺序的合理性又更不容易受到反向因果关系和混淆因素的影响[17]，是目前除了随机对照试验（randomized controlled trial，RCT）以外证据质量较高的临床科研方法。因此，本研究通过一项多变量双样本孟德尔随机化（two-sample Mendelian randomization，TSMR）方法进一步探究GERD与OSA及其典型症状之间的因果关系。
1 资料与方法
1.1 研究设计
本研究全程参照STROBE-MR条目清单进行设计与实施，以确保MR分析的规范性与准确性[18]。根据Bownden等[19]的说法，TSMR分析需满足以下三个假设：① 关联性假设：从数据集中选择的遗传IV与暴露因素强相关；② 独立性假设：遗传IV与任何潜在混杂因素无关；③ 排他性假设：遗传IV只能通过暴露因素影响结局因素。本研究以GRED作为暴露因素，OSA及其典型症状（打鼾、白天嗜睡）作为结局因素，采用MR方法评估GERD与OSA之间的因果关系，MR分析研究流程图见附件图1。本研究所选择暴露和结果队列研究都仅限于欧洲血统的受试者，以减少人群分层的偏倚[20]。本研究中使用的所有数据均来自相关受试者同意和伦理认可的研究，因此不需要额外机构审查委员会的伦理批准。
图1
GERD与OSA关系的孟德尔分析
a. 散点图；b. 漏斗图；c. 森林图；d. 留一法敏感性分析图。
1.2 数据来源
从IEU open GWAS数据库中选择最大最新的GERD数据[21]。GERD病例诊断通过自我报告的GERD症状、国际疾病分类诊断和使用抗GERD相关药物综合评估[21]。OSA的数据来自FinnGen最近发表的全基因组关联研究[22]。OSA根据国际疾病统计分类（ICD）代码（ICD-10：G47.3，ICD-9：3472A）诊断，该代码基于主观症状、临床检查和呼吸暂停低通气指数（apnea hypopnea index，AHI）≥5进行综合评估。打鼾与白天嗜睡的数据均来源于英国生物样本库（UK Biobank，UKBB）GWAS数据库[23]。所有数据来源特征信息见表1。
表1
两样本孟德尔随机化研究GWAS数据特征
1.3 IV筛选
首先，从GERD的GWAS中选择符合全基因组显著性标准（P<5×10−8）的SNPs，并使用Clump函数去除连锁不平衡（r2<0.001，kb=10 000）[24]。其次，为了避免弱IV导致偏倚，计算每个SNP的F统计量，F统计量>10被认为足以抵消弱工具偏差[25]，F值<10的SNP被剔除，计算公式如下[26]：F=β2exposure/SE2exposure，β为暴露的等位基因效应值，SE为暴露的标准误。最后，还进行了MR多效残差和离群值检验（Mendelian randomization pleiotropy residual sum and outlier，MR-PRESSO），若检测出异常值则将其剔除，对剩余SNPs进行MR分析。IV筛选流程见附件图1。
1.4 统计分析
本研究主要采用逆方差加权法（inverse variance-weighted，IVW）、MR-Egger、加权中位数法（weighted median，WM）、加权模型（weighted mode）和简单模型（simple mode）等进行MR分析[16]。由于IVW法比其他方法检验效能更高，可以在存在异质性的条件下获得更稳健的结果，因此以IVW法分析结果作为主效应分析结果[27]。使用Cochran’s Q统计量评估异质性，P<0.05提示存在异质性。采用留一法进行敏感性分析，评估是否存在由于单个SNP对MR结果产生独立影响结果而存在偏倚情况[27]。通过MR-Egger回归法观察截距项评估基因多效性，当P<0.05时表示存在多效性[28]。同时进行MR-PRESSO异常值检验，识别和去除异常值对水平多效性进行校正[29]。所有数据分析均使用R 4.1.2软件的Two Sample MR 0.5.6包和MR-PRESSO 1.0包进行[30]。
2 结果
2.1 GERD与OSA的MR分析结果
MR结果显示GERD与OSA之间存在正相关的因果关系［IVW：OR=1.528，95%CI（1.374，1.699），P=5.315E‒15］，5种方法分析结果一致（表2）。异质性检验显示不存在异质性（P=0.099），敏感性试验未发现多效性（P=0.133）（表3）。漏斗图中IVW线左右两边的散点基本对称，说明结果不存在潜在偏倚，留一法分析未发现单个对因果关联影响较大的SNP，确保了因果效应估计的可靠性。GERD对OSA的MR分析的散点图、漏斗图、森林图、留一法分析图如图1所示。
表2
5种方法的MR分析结果
表3
异质性与多效性分析结果
2.2 GERD与打鼾、白天嗜睡的MR分析结果
Cochran’s Q检验结果显示，GERD与打鼾、白天嗜睡的MR分析存在异质性（P<0.05）（表3），故采用随机效应IVW法进行MR分析。结果显示GERD是打鼾［IVW：OR=0.959，95%CI（0.949，0.969），P=1.507E‒15］、白天嗜睡［IVW：OR=1.024，95%CI（1.021，1.036），P=4.580E‒5］的强相关因素（表2），敏感性分析结果未发现多效性（表3），说明SNPs并不通过GERD以外的途径显著影响打鼾与白天嗜睡。留一法检验提示结果稳定，没有单个SNP对MR结果造成显著影响。漏斗图中IVW线的左右两边的点大致对称，提示本研究结果稳定。GERD对打鼾、白天嗜睡的MR分析的漏斗图、散点图、森林图、留一法分析图分别如图2、图3所示。
图2
GERD与打鼾关系的孟德尔分析
a. 散点图；b. 漏斗图；c. 森林图；d. 留一法敏感性分析图。
图3
GERD与白天嗜睡关系的孟德尔分析
a. 散点图；b. 漏斗图；c. 森林图；d. 留一法敏感性分析图。
3 讨论
GERD是否是OSA的危险因素一直存在争议，一项来自韩国的队列研究[14]表明经内窥镜证实的GERD与更严重的OSA相关，GERD更常见于OSA患者中[14,31]。然而也有研究表明OSA与非OSA患者的GERD患病率没有差异[32]，GERD和OSA具有相似的危险因素，他们之间的关联可能仅仅是共同风险因素的反映[33]。本研究旨在通过两样本MR分析探讨GERD与OSA及其典型症状之间的因果关系，这是第一个通过对大规模GWAS数据进行MR分析来探讨GERD与OSA之间的因果关系的研究，丰富了以往相关研究的结果。
本研究发现GERD和OSA之间存在因果关系，基因水平上的GERD与OSA风险呈正相关，与观察性研究的结果一致[34]。有调查发现，在诊断为GERD的22 677 620例患者中，同时诊断为OSA的患者占比12.21%，未诊断为GERD的患者OSA患病率为4.79%[34]，GERD患者的OSA患病率明显高于非GERD患者。Gilani等[35]的研究也发现，在匹配了年龄、性别、种族、肥胖、鼻窦和喉部疾病、哮喘及其它肺部疾病等可能的混杂因素后，GERD仍与OSA独立相关。GERD夜间反流症状可导致睡眠觉醒次数增加、睡眠剥夺和喉头水肿，从而加重上呼吸道阻塞，引起或加重OSA[10,11]。研究发现AHI与弱胃酸反流有关[36]，夜间胃反流激活自主神经系统，增加迷走神经刺激，引起支气管收缩，进而导致AHI值增加，引起睡眠障碍[4]。也有研究观察到治疗GERD可以改善睡眠障碍[4]，质子泵抑制剂的使用改善了与睡眠障碍相关的生活质量并可改善OSA患者的呼吸暂停指数[37,38]。奥美拉唑治疗GERD已被证明可减少呼吸暂停发作[39]。然而，一项旨在评估质子泵抑制剂治疗GERD与改善OSA的Meta分析，发现这种方式可能改善夜间睡眠质量，但对AHI没有影响[40]，GERD和OSA关联的确切机制仍有待进一步研究。
打鼾是一种非常普遍的睡眠状况，是OSA的主要症状之一，但大多数打鼾者并不符合OSA的诊断标准，打鼾应该被视为一个独立的实体疾病，而不仅仅是OSA的症状。据统计，高达78%成年男性和59%成年女性伴有打鼾[41]。白天嗜睡是指白天无法控制的打盹和困倦，容易造成个体注意力不集中、焦虑抑郁等，白天嗜睡在人群中的发生率约为12%～16%[42]。一项大型前瞻性队列研究发现胃食管反流症状与打鼾、白天嗜睡之间有很强的相关性[43]。Emilsson等[44]研究发现在GERD受试者中观察到的自我报告的打鼾比没有GERD的受试者更多，并且在调整BMI后，音频测量的打鼾（>65dB）仍与GERD显著相关。瑞典一项研究[45]也发现，有持续性夜间胃食管返流症状的女性白天嗜睡的患病率明显高于无夜间胃食管返流症状的女性。夜间发生胃食管反流可加重OSA患者白天嗜睡。也有研究发现，在排除OSA导致的白天嗜睡外，白天嗜睡相关的2个参数（斯坦福嗜睡量表、Epworth嗜睡量表）也与GERD相关[46]。本研究也证实了GERD与打鼾、白天嗜睡之间存在因果关系。
本研究的局限：① 所有纳入的参与者都是欧洲人群，这减少了人口分层偏差，但种族似乎会影响OSA患者的颅面解剖特征和肥胖倾向，这大约占OSA风险的40%[47,48]，因此本研究结果对其他人群的推广可能有限。② 在GERD与打鼾、白天瞌睡的分析中存在异质性，这可能与原始研究样本量和研究人群有关，故采用随机效应IVW法进行分析，未来应通过扩大样本量、增加分层数据等方法减少异质性。③ 不能完全排除本研究结果受到弱IV偏差影响的可能性，尽管计算的F统计量均>10，并未表明弱IV。
综上所述，这项MR研究发现GERD与OSA风险及其典型症状（打鼾、白天嗜睡）之间存在因果关系，进一步证实了GERD是OSA的独立危险因素。这些发现对GERD与OSA患者的临床管理具有重要的指导意义。
胃食管反流病（gastroesophageal reflux disease，GERD）是一种常见的胃肠道疾病，其特点是胃、十二指肠酸性内容物异常反流至食管，引起食管黏膜损伤和反流症状[1]。据统计，目前13%的全球人口和20%的成年人患有GERD，胃食管反流与反流性食管炎、食管狭窄、巴雷特食管和食管腺癌的风险增加有关[2,3]。近年来，GERD被认为是阻塞性睡眠呼吸暂停（obstructive sleep apnea，OSA）的一个重要诱因[4,5]。OSA是指睡眠期间反复发生上呼吸道塌陷，导致反复发作的呼吸暂停或低通气[6]，具体可表现为夜间反复觉醒、打鼾、白天嗜睡、慢性疲劳、晨起头痛、注意力和记忆力减退、情绪低落等[7]。研究表明，OSA可直接引起间歇性缺氧和高碳酸血症，继而诱发交感神经激活、氧化应激和全身炎症等反应，长此以往可增加心脑血管疾病、高血压和糖尿病等的发病风险[8]。全球大约有10亿30至69岁的成年人患有OSA，其中有40%至60%的OSA患者同时合并有GERD[9-11]。肥胖、吸烟和饮酒等OSA发展因素同时也被确定为GERD的危险因素[12,13]，观察性研究也发现GERD与OSA存在相关性[14,15]。尽管GERD与OSA的临床相关性在观察性研究中已被多次强调，然而他们之间是否存在因果关系尚不明确。
众所周知，观察性研究容易受到混杂偏倚因素的影响。孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）是近年来新起的利用基因型来推断表型与疾病之间关联的研究方法，主要是将单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）作为遗传变异工具变量（instrumental variable，IV），借此评估暴露因素与结果事件之间关联的因果效应[16]。由于这些遗传基因变异源于母代并且在受孕时随机分配，因此它满足时间顺序的合理性又更不容易受到反向因果关系和混淆因素的影响[17]，是目前除了随机对照试验（randomized controlled trial，RCT）以外证据质量较高的临床科研方法。因此，本研究通过一项多变量双样本孟德尔随机化（two-sample Mendelian randomization，TSMR）方法进一步探究GERD与OSA及其典型症状之间的因果关系。
1 资料与方法
1.1 研究设计
本研究全程参照STROBE-MR条目清单进行设计与实施，以确保MR分析的规范性与准确性[18]。根据Bownden等[19]的说法，TSMR分析需满足以下三个假设：① 关联性假设：从数据集中选择的遗传IV与暴露因素强相关；② 独立性假设：遗传IV与任何潜在混杂因素无关；③ 排他性假设：遗传IV只能通过暴露因素影响结局因素。本研究以GRED作为暴露因素，OSA及其典型症状（打鼾、白天嗜睡）作为结局因素，采用MR方法评估GERD与OSA之间的因果关系，MR分析研究流程图见附件图1。本研究所选择暴露和结果队列研究都仅限于欧洲血统的受试者，以减少人群分层的偏倚[20]。本研究中使用的所有数据均来自相关受试者同意和伦理认可的研究，因此不需要额外机构审查委员会的伦理批准。
图1
GERD与OSA关系的孟德尔分析
a. 散点图；b. 漏斗图；c. 森林图；d. 留一法敏感性分析图。
1.2 数据来源
从IEU open GWAS数据库中选择最大最新的GERD数据[21]。GERD病例诊断通过自我报告的GERD症状、国际疾病分类诊断和使用抗GERD相关药物综合评估[21]。OSA的数据来自FinnGen最近发表的全基因组关联研究[22]。OSA根据国际疾病统计分类（ICD）代码（ICD-10：G47.3，ICD-9：3472A）诊断，该代码基于主观症状、临床检查和呼吸暂停低通气指数（apnea hypopnea index，AHI）≥5进行综合评估。打鼾与白天嗜睡的数据均来源于英国生物样本库（UK Biobank，UKBB）GWAS数据库[23]。所有数据来源特征信息见表1。
表1
两样本孟德尔随机化研究GWAS数据特征
1.3 IV筛选
首先，从GERD的GWAS中选择符合全基因组显著性标准（P<5×10−8）的SNPs，并使用Clump函数去除连锁不平衡（r2<0.001，kb=10 000）[24]。其次，为了避免弱IV导致偏倚，计算每个SNP的F统计量，F统计量>10被认为足以抵消弱工具偏差[25]，F值<10的SNP被剔除，计算公式如下[26]：F=β2exposure/SE2exposure，β为暴露的等位基因效应值，SE为暴露的标准误。最后，还进行了MR多效残差和离群值检验（Mendelian randomization pleiotropy residual sum and outlier，MR-PRESSO），若检测出异常值则将其剔除，对剩余SNPs进行MR分析。IV筛选流程见附件图1。
1.4 统计分析
本研究主要采用逆方差加权法（inverse variance-weighted，IVW）、MR-Egger、加权中位数法（weighted median，WM）、加权模型（weighted mode）和简单模型（simple mode）等进行MR分析[16]。由于IVW法比其他方法检验效能更高，可以在存在异质性的条件下获得更稳健的结果，因此以IVW法分析结果作为主效应分析结果[27]。使用Cochran’s Q统计量评估异质性，P<0.05提示存在异质性。采用留一法进行敏感性分析，评估是否存在由于单个SNP对MR结果产生独立影响结果而存在偏倚情况[27]。通过MR-Egger回归法观察截距项评估基因多效性，当P<0.05时表示存在多效性[28]。同时进行MR-PRESSO异常值检验，识别和去除异常值对水平多效性进行校正[29]。所有数据分析均使用R 4.1.2软件的Two Sample MR 0.5.6包和MR-PRESSO 1.0包进行[30]。
2 结果
2.1 GERD与OSA的MR分析结果
MR结果显示GERD与OSA之间存在正相关的因果关系［IVW：OR=1.528，95%CI（1.374，1.699），P=5.315E‒15］，5种方法分析结果一致（表2）。异质性检验显示不存在异质性（P=0.099），敏感性试验未发现多效性（P=0.133）（表3）。漏斗图中IVW线左右两边的散点基本对称，说明结果不存在潜在偏倚，留一法分析未发现单个对因果关联影响较大的SNP，确保了因果效应估计的可靠性。GERD对OSA的MR分析的散点图、漏斗图、森林图、留一法分析图如图1所示。
表2
5种方法的MR分析结果
表3
异质性与多效性分析结果
2.2 GERD与打鼾、白天嗜睡的MR分析结果
Cochran’s Q检验结果显示，GERD与打鼾、白天嗜睡的MR分析存在异质性（P<0.05）（表3），故采用随机效应IVW法进行MR分析。结果显示GERD是打鼾［IVW：OR=0.959，95%CI（0.949，0.969），P=1.507E‒15］、白天嗜睡［IVW：OR=1.024，95%CI（1.021，1.036），P=4.580E‒5］的强相关因素（表2），敏感性分析结果未发现多效性（表3），说明SNPs并不通过GERD以外的途径显著影响打鼾与白天嗜睡。留一法检验提示结果稳定，没有单个SNP对MR结果造成显著影响。漏斗图中IVW线的左右两边的点大致对称，提示本研究结果稳定。GERD对打鼾、白天嗜睡的MR分析的漏斗图、散点图、森林图、留一法分析图分别如图2、图3所示。
图2
GERD与打鼾关系的孟德尔分析
a. 散点图；b. 漏斗图；c. 森林图；d. 留一法敏感性分析图。
图3
GERD与白天嗜睡关系的孟德尔分析
a. 散点图；b. 漏斗图；c. 森林图；d. 留一法敏感性分析图。
3 讨论
GERD是否是OSA的危险因素一直存在争议，一项来自韩国的队列研究[14]表明经内窥镜证实的GERD与更严重的OSA相关，GERD更常见于OSA患者中[14,31]。然而也有研究表明OSA与非OSA患者的GERD患病率没有差异[32]，GERD和OSA具有相似的危险因素，他们之间的关联可能仅仅是共同风险因素的反映[33]。本研究旨在通过两样本MR分析探讨GERD与OSA及其典型症状之间的因果关系，这是第一个通过对大规模GWAS数据进行MR分析来探讨GERD与OSA之间的因果关系的研究，丰富了以往相关研究的结果。
本研究发现GERD和OSA之间存在因果关系，基因水平上的GERD与OSA风险呈正相关，与观察性研究的结果一致[34]。有调查发现，在诊断为GERD的22 677 620例患者中，同时诊断为OSA的患者占比12.21%，未诊断为GERD的患者OSA患病率为4.79%[34]，GERD患者的OSA患病率明显高于非GERD患者。Gilani等[35]的研究也发现，在匹配了年龄、性别、种族、肥胖、鼻窦和喉部疾病、哮喘及其它肺部疾病等可能的混杂因素后，GERD仍与OSA独立相关。GERD夜间反流症状可导致睡眠觉醒次数增加、睡眠剥夺和喉头水肿，从而加重上呼吸道阻塞，引起或加重OSA[10,11]。研究发现AHI与弱胃酸反流有关[36]，夜间胃反流激活自主神经系统，增加迷走神经刺激，引起支气管收缩，进而导致AHI值增加，引起睡眠障碍[4]。也有研究观察到治疗GERD可以改善睡眠障碍[4]，质子泵抑制剂的使用改善了与睡眠障碍相关的生活质量并可改善OSA患者的呼吸暂停指数[37,38]。奥美拉唑治疗GERD已被证明可减少呼吸暂停发作[39]。然而，一项旨在评估质子泵抑制剂治疗GERD与改善OSA的Meta分析，发现这种方式可能改善夜间睡眠质量，但对AHI没有影响[40]，GERD和OSA关联的确切机制仍有待进一步研究。
打鼾是一种非常普遍的睡眠状况，是OSA的主要症状之一，但大多数打鼾者并不符合OSA的诊断标准，打鼾应该被视为一个独立的实体疾病，而不仅仅是OSA的症状。据统计，高达78%成年男性和59%成年女性伴有打鼾[41]。白天嗜睡是指白天无法控制的打盹和困倦，容易造成个体注意力不集中、焦虑抑郁等，白天嗜睡在人群中的发生率约为12%～16%[42]。一项大型前瞻性队列研究发现胃食管反流症状与打鼾、白天嗜睡之间有很强的相关性[43]。Emilsson等[44]研究发现在GERD受试者中观察到的自我报告的打鼾比没有GERD的受试者更多，并且在调整BMI后，音频测量的打鼾（>65dB）仍与GERD显著相关。瑞典一项研究[45]也发现，有持续性夜间胃食管返流症状的女性白天嗜睡的患病率明显高于无夜间胃食管返流症状的女性。夜间发生胃食管反流可加重OSA患者白天嗜睡。也有研究发现，在排除OSA导致的白天嗜睡外，白天嗜睡相关的2个参数（斯坦福嗜睡量表、Epworth嗜睡量表）也与GERD相关[46]。本研究也证实了GERD与打鼾、白天嗜睡之间存在因果关系。
本研究的局限：① 所有纳入的参与者都是欧洲人群，这减少了人口分层偏差，但种族似乎会影响OSA患者的颅面解剖特征和肥胖倾向，这大约占OSA风险的40%[47,48]，因此本研究结果对其他人群的推广可能有限。② 在GERD与打鼾、白天瞌睡的分析中存在异质性，这可能与原始研究样本量和研究人群有关，故采用随机效应IVW法进行分析，未来应通过扩大样本量、增加分层数据等方法减少异质性。③ 不能完全排除本研究结果受到弱IV偏差影响的可能性，尽管计算的F统计量均>10，并未表明弱IV。
综上所述，这项MR研究发现GERD与OSA风险及其典型症状（打鼾、白天嗜睡）之间存在因果关系，进一步证实了GERD是OSA的独立危险因素。这些发现对GERD与OSA患者的临床管理具有重要的指导意义。
