引用本文： 杨炼, 陆小军, 叶远馨, 周易, 王雪梅, 应斌武. 四川大学华西医院 8 944 例健康体检女性 HPV 感染情况分析. 中国循证医学杂志, 2017, 17(6): 634-639. doi: 10.7507/1672-2531.201611038 复制
人乳头瘤病毒（HPV）是一组特异性感染人类黏膜及皮肤上皮的小型双链环状 DNA 病毒。目前已鉴定的 HPV 型别超过了 100 多种，其中>40 种可引起肛门生殖道区域及泌尿系统感染；大多数 HPV 感染是无症状或亚临床感染，以无症状感染最为常见。HPV 根据感染后致癌性可分为低危型和高危型两类。低危型 HPV（如 HPV6 和 11）感染为非致癌性，与增生性病变相关，是生殖器疣和复发性呼吸道乳头瘤的病因。而大量流行病学及病原学研究发现，目前有 10 余种高危型 HPV（如 HPV16、18、52 和 58 等）在 96.6% 的侵袭性宫颈癌的发展中起到了关键的作用[1]。因此，HPV 基因检测对于宫颈癌及癌前病变的筛查和诊断具有重要意义。
宫颈疾病对于中国女性来说是一个重要的公共卫生问题。本研究通过对健康体检女性宫颈脱落细胞进行 HPV 基因分型检测，探讨 HPV 感染情况、基因型分布及其相关因素，以期为 HPV 疫苗筛选和宫颈癌防治提供理论依据。
1 对象与方法
1.1 研究对象
纳入 2016 年 1 月 1 日至 2016 年 9 月 30 日在四川大学华西医院健康检查中心接受 HPV 检测的 8 944 例体检女性，且剔除二次复查数据。
1.2 仪器与试剂
采用仪器为 Eppendorf Mastercylcer Gradient 基因扩增仪和 Luminex 200 多功能流式点阵仪（配套使用透景 HPV 专用分析软件）。试剂为上海透景人乳头状瘤病毒核酸分型检测试剂盒（流式荧光杂交法，货号：LG01002H1；读数模板编码：LG010021C；批号：16A001）。
1.3 实验方法
1.3.1 样本采集和处理 在非月经期取样，取样前 72 h 避免性生活，且未用药物冲洗阴道或使用阴道内药物。医护人员以扩阴器暴露宫颈口，先用棉拭子擦去宫颈口的分泌物，将专用宫颈刷伸入宫颈口处，紧贴宫颈口黏膜顺时针轻柔转动 4～5 周，慢慢抽出宫颈刷，将其放入装有细胞保存液的洗脱管，在管口除沿刷柄折痕将宫颈刷折断，宫颈刷头留在洗脱管中，旋紧管盖，直立放置常温或 4℃ 保存，72 h 以内完成检测。
1.3.2 样本 DNA 提取 轻微振荡悬浮保存液中的脱落细胞，取 200 μL样本保存液于 1.5 mL 离心管中，12 000 r/min 离心 5 min，弃上清。加入摇匀的核酸提取剂 200 μL，振荡混匀，放入 100℃ 金属浴 15 min 后，12 000 r/min 离心 5 min，保留上清以备检测。
1.3.3 PCR 扩增 按比例（预混液 10 μL/人份+引物混合液 5 μL/人份+聚合酶 0.8 μL/人份）充分混匀制成 PCR 反应试剂，瞬时离心，按 15 μL/孔加入 PCR 反应板反应孔中，再取上清样本 DNA 模板、30 和 70 号阳性质控、90 号阴性质控 5 μL 加入相应反应孔，混匀瞬离后放入 PCR 仪进行扩增。扩增条件：95℃ 5 min，1 个循环；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，5 个循环；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35 个循环；72℃ 3 min。
1.3.4 荧光素微球杂交 在反应板杂交孔中分别加入微球杂交液 22 μL 和样本 PCR 扩增产物 3 μL 混匀，封板后放入 PCR 仪中运行杂交。95℃ 变性 5 min；48℃ 杂交 30 min；每孔快速加入荧光标记的链霉亲和素-藻红蛋白 75 μL，重新用封口膜封住反应板，继续 48℃ 孵育 15 min。
1.3.5 上机检测 将孵育好的杂交板快速转移至预热好的 Luminex 200 多功能流式点阵仪上进行检测和结果分析，具体操作流程和结果判读严格按试剂、仪器说明书进行。本研究检测 27 种 HPV 基因型，包括 17 种高危型（HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV82）和 10 种低危型（HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV55、HPV61、HPV81、HPV83）。
1.4 统计分析
采用 Excel 2007 录入数据，SPSS 17.0 进行统计分析，计算 HPV 的总体和特定类型的感染率。同时，统计单一和多重感染的所有基因型，并分别按年龄（20～25 岁、26～30 岁、31～35 岁、36～40 岁、41～45 岁、46～50 岁、51～55 岁、56～60 岁、61～65 岁及 66 岁及以上）统计分析。
2 结果
2.1 健康体检女性 HPV 感染的一般情况
共纳入 8 944 例健康体检女性，年龄为 20 岁～85 岁，平均年龄 43.8±10.3 岁。其中共检出 HPV 感染 1 291 例（平均年龄 44.5±10.4 岁），感染率为 14.4%（1 291/8 944）。高风险 HPV（hrHPV）感染率为 10.5%（939/8 944），低风险 HPV（lrHPV）感染率为 5.5%（490/8 944）。1 291 例 HPV 感染者中，单一感染为 1 025 例占 79.4%（1 025/1 291）；多重感染有 266 例占 HPV 感染者的 20.6%（266/1 291）（表 1）。
表1
8 944 例健康体检女性 HPV 感染情况分布（例）
2.2 HPV 基因型分布
在 1 025 例单一感染者中，hrHPV 占 68.2%（699/1 025）。四种最常见的 hrHPV 是 HPV52、53、16 和 58，感染率分别为 1.69%（151/8 944）、1.13%（101/8 944）、0.83%（74/8944）和 0.81%（72/8 944）。此外，lrHPV 中 HPV61、81、55、43 和 44 的感染率也较高，分别为 0.7%（62/8 944）、0.6%（56/8 944）、0.6%（50/8 944）、0.6%（49/8 944）和 0.5%（46/8 944）（表 2）。
表2
单一感染的 HPV 基因型分布情况（例）
在 266 例 HPV 多重感染者中，双重感染占 71.1%（205/266），三重感染占 15.0%（40/266），四重感染占 5.6%（15/266），五重感染占 2.3%（6/266）。四种最常见的 hrHPV 类型分别为 HPV52、53、58 和 16，感染率分别为 0.8%（67/8 944）、0.6%（49/8 944）、0.5%（40/8 944）和 0.4%（39/8 944）。此外，lrHPV 中 HPV81、43、61、44 和 55 的感染率较高，分别为 0.4%（38/8 944）、0.4%（37/8 944）、0.4%（36/8 944）、0.4%（35/8 944）和 0.3%（26/8 944）（表 3）。
表3
多重感染的 HPV 基因型分布情况（例）
2.3 HPV 感染在不同年龄段中的分布
20～25 岁和 66 岁及以上年龄段在单一及多重感染中的感染率均较其他年龄段高。单一感染在 41～45 岁和 51～55 岁组也较高（图 1）。单一感染中感染率最高的 HPV52 在 31～35 岁和 61～65 岁年龄段较高（图 2）。多重感染中，20～25 岁年龄段的 HPV52 和 HPV16 感染率较其他年龄段高（图 3）。
图1
HPV 单一和多重感染率在各年龄段的分布情况
图2
单一感染中 4 种常见 HPV 感染率在各年龄段分布情况
图3
多重感染中 4 种常见 HPV 感染率在各年龄段分布情况
3 讨论
不同人群中 HPV 类型的分布具有差异较大。基于 WHO 数据，宫颈癌患者中 4 个最常见的 hrHPV 类型是 HPV16、18、33 和 45，而正常女性中最常见的类型是 HPV16、18、31 和 58[2]。在中国，宫颈癌患者中4个最常见的 hrHPV 类型分别是 HPV16、18、58 和 33；而在正常女性人群中最常见的类型为 HPV16、52、18 和 51[2]。本研究显示我院健康体检女性以 hrHPV 感染为主，最常见的基因型是 HPV52、53、16 和 58，这与赵丽等[6]的研究结果基本一致，但与冯余宽等[7]的研究结果不同，这可能与纳入人群的差异有关。
当前美国已有 3 种 HPV 疫苗注册，分别是二价疫苗（HPV16 和 18）、四价疫苗（HPV6、11、16 和 18）和九价疫苗（HPV6、11、16、18、31、33、45、52 和 58）。接种二价或四价疫苗能明显有效降低宫颈癌的风险[8]。中国国家食品药品监督管理局于 2016 年 7 月 12 日批准了 HPV16 和 18 型二价疫苗的进口注册申请。但宫颈癌并不只 HPV16/18 有关，还有 10%～20% 与其他 HPV 类型有关，如 HPV31、45、52 和 58[1]。本研究结果显示体检者 HPV 感染最常见为 HPV52、53、16 和 58，这非现有的二价和四价疫苗所能涵盖。虽然有研究提示 HPV 疫苗对 HPV 类型有交叉保护性[9, 10]，但由于 HPV 诱导产生的中和抗体具有型别特异性，交叉保护率可能较低[11]。此外，由于 HPV 的病毒自限性及宿主机体的免疫清除作用，HPV 筛查阳性并不能提示其一定患宫颈癌。即使筛查阴性，也有可能存在感染，发生不良结局。此外 2015 年，美国疾病控制中心性传播疾病的诊断和治疗指南也建议对已接种 HPV 疫苗的≥21 岁女性仍需继续进行常规宫颈癌的筛查[12]。
疫苗接种前 HPV 分型检测对评价疫苗具有重要价值，也可为研制新型疫苗提供依据[13]。对不同类型 HPV 疫苗进行成本效益分析，HPV 感染分布、疫苗对未覆盖亚型的有效性、防治技术的有效性和特异性、筛查和疫苗接种的覆盖率等因素均会影响其成本效益[14-17]。虽然国外已有不少研究评价了 HPV 疫苗的成本效益，但中国的研究较少，本研究的结果可在一定程度上为成本效益分析提供研究基础。
本研究结果显示，20～25 岁和 66 岁及以上体检者在单一及多重感染中的感染率均较高，这与 Wang 等[18]研究结果类似。年轻女性生殖道相对免疫保护系统尚不够成熟，抗感染能力弱，宫颈鳞状上皮细胞较敏感，易受 HPV 感染[19]。而随着年龄的增长，机体免疫能力逐渐降低，HPV 感染风险增高。41～45 岁和 51～55 岁年龄段在单一感染中也较高，这可能与围绝经期激素波动引起生理及免疫失调有关。因此，建议不同年龄段的女性均有必要进行 HPV 分型检测。
本研究中，HPV 感染阳性妇女中多重感染所占比例为 20.6%，低于上海（36.6%）、北京（27.7%）和山西（24.3%），但略高于河南（19.8%）、云南（18.0%）、湖南（17.7%）、新疆（15.5%）[3, 5, 21]。这体现了一定的地区特异性。
本研究的局限性：本研究仅纳入四川大学华西医院的健康体检者，也未收集体检者的细胞学数据，将来应开展基于总体人群的研究，探讨 HPV 分型的关系。
总之，基于本院健康体检者 HPV 感染情况，建议将 HPV52、53 和 58 纳入到 HPV 疫苗筛选评估中，为 HPV 感染及宫颈癌预防提供理论依据。
人乳头瘤病毒（HPV）是一组特异性感染人类黏膜及皮肤上皮的小型双链环状 DNA 病毒。目前已鉴定的 HPV 型别超过了 100 多种，其中>40 种可引起肛门生殖道区域及泌尿系统感染；大多数 HPV 感染是无症状或亚临床感染，以无症状感染最为常见。HPV 根据感染后致癌性可分为低危型和高危型两类。低危型 HPV（如 HPV6 和 11）感染为非致癌性，与增生性病变相关，是生殖器疣和复发性呼吸道乳头瘤的病因。而大量流行病学及病原学研究发现，目前有 10 余种高危型 HPV（如 HPV16、18、52 和 58 等）在 96.6% 的侵袭性宫颈癌的发展中起到了关键的作用[1]。因此，HPV 基因检测对于宫颈癌及癌前病变的筛查和诊断具有重要意义。
宫颈疾病对于中国女性来说是一个重要的公共卫生问题。本研究通过对健康体检女性宫颈脱落细胞进行 HPV 基因分型检测，探讨 HPV 感染情况、基因型分布及其相关因素，以期为 HPV 疫苗筛选和宫颈癌防治提供理论依据。
1 对象与方法
1.1 研究对象
纳入 2016 年 1 月 1 日至 2016 年 9 月 30 日在四川大学华西医院健康检查中心接受 HPV 检测的 8 944 例体检女性，且剔除二次复查数据。
1.2 仪器与试剂
采用仪器为 Eppendorf Mastercylcer Gradient 基因扩增仪和 Luminex 200 多功能流式点阵仪（配套使用透景 HPV 专用分析软件）。试剂为上海透景人乳头状瘤病毒核酸分型检测试剂盒（流式荧光杂交法，货号：LG01002H1；读数模板编码：LG010021C；批号：16A001）。
1.3 实验方法
1.3.1 样本采集和处理 在非月经期取样，取样前 72 h 避免性生活，且未用药物冲洗阴道或使用阴道内药物。医护人员以扩阴器暴露宫颈口，先用棉拭子擦去宫颈口的分泌物，将专用宫颈刷伸入宫颈口处，紧贴宫颈口黏膜顺时针轻柔转动 4～5 周，慢慢抽出宫颈刷，将其放入装有细胞保存液的洗脱管，在管口除沿刷柄折痕将宫颈刷折断，宫颈刷头留在洗脱管中，旋紧管盖，直立放置常温或 4℃ 保存，72 h 以内完成检测。
1.3.2 样本 DNA 提取 轻微振荡悬浮保存液中的脱落细胞，取 200 μL样本保存液于 1.5 mL 离心管中，12 000 r/min 离心 5 min，弃上清。加入摇匀的核酸提取剂 200 μL，振荡混匀，放入 100℃ 金属浴 15 min 后，12 000 r/min 离心 5 min，保留上清以备检测。
1.3.3 PCR 扩增 按比例（预混液 10 μL/人份+引物混合液 5 μL/人份+聚合酶 0.8 μL/人份）充分混匀制成 PCR 反应试剂，瞬时离心，按 15 μL/孔加入 PCR 反应板反应孔中，再取上清样本 DNA 模板、30 和 70 号阳性质控、90 号阴性质控 5 μL 加入相应反应孔，混匀瞬离后放入 PCR 仪进行扩增。扩增条件：95℃ 5 min，1 个循环；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，5 个循环；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35 个循环；72℃ 3 min。
1.3.4 荧光素微球杂交 在反应板杂交孔中分别加入微球杂交液 22 μL 和样本 PCR 扩增产物 3 μL 混匀，封板后放入 PCR 仪中运行杂交。95℃ 变性 5 min；48℃ 杂交 30 min；每孔快速加入荧光标记的链霉亲和素-藻红蛋白 75 μL，重新用封口膜封住反应板，继续 48℃ 孵育 15 min。
1.3.5 上机检测 将孵育好的杂交板快速转移至预热好的 Luminex 200 多功能流式点阵仪上进行检测和结果分析，具体操作流程和结果判读严格按试剂、仪器说明书进行。本研究检测 27 种 HPV 基因型，包括 17 种高危型（HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV82）和 10 种低危型（HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV55、HPV61、HPV81、HPV83）。
1.4 统计分析
采用 Excel 2007 录入数据，SPSS 17.0 进行统计分析，计算 HPV 的总体和特定类型的感染率。同时，统计单一和多重感染的所有基因型，并分别按年龄（20～25 岁、26～30 岁、31～35 岁、36～40 岁、41～45 岁、46～50 岁、51～55 岁、56～60 岁、61～65 岁及 66 岁及以上）统计分析。
2 结果
2.1 健康体检女性 HPV 感染的一般情况
共纳入 8 944 例健康体检女性，年龄为 20 岁～85 岁，平均年龄 43.8±10.3 岁。其中共检出 HPV 感染 1 291 例（平均年龄 44.5±10.4 岁），感染率为 14.4%（1 291/8 944）。高风险 HPV（hrHPV）感染率为 10.5%（939/8 944），低风险 HPV（lrHPV）感染率为 5.5%（490/8 944）。1 291 例 HPV 感染者中，单一感染为 1 025 例占 79.4%（1 025/1 291）；多重感染有 266 例占 HPV 感染者的 20.6%（266/1 291）（表 1）。
表1
8 944 例健康体检女性 HPV 感染情况分布（例）
2.2 HPV 基因型分布
在 1 025 例单一感染者中，hrHPV 占 68.2%（699/1 025）。四种最常见的 hrHPV 是 HPV52、53、16 和 58，感染率分别为 1.69%（151/8 944）、1.13%（101/8 944）、0.83%（74/8944）和 0.81%（72/8 944）。此外，lrHPV 中 HPV61、81、55、43 和 44 的感染率也较高，分别为 0.7%（62/8 944）、0.6%（56/8 944）、0.6%（50/8 944）、0.6%（49/8 944）和 0.5%（46/8 944）（表 2）。
表2
单一感染的 HPV 基因型分布情况（例）
在 266 例 HPV 多重感染者中，双重感染占 71.1%（205/266），三重感染占 15.0%（40/266），四重感染占 5.6%（15/266），五重感染占 2.3%（6/266）。四种最常见的 hrHPV 类型分别为 HPV52、53、58 和 16，感染率分别为 0.8%（67/8 944）、0.6%（49/8 944）、0.5%（40/8 944）和 0.4%（39/8 944）。此外，lrHPV 中 HPV81、43、61、44 和 55 的感染率较高，分别为 0.4%（38/8 944）、0.4%（37/8 944）、0.4%（36/8 944）、0.4%（35/8 944）和 0.3%（26/8 944）（表 3）。
表3
多重感染的 HPV 基因型分布情况（例）
2.3 HPV 感染在不同年龄段中的分布
20～25 岁和 66 岁及以上年龄段在单一及多重感染中的感染率均较其他年龄段高。单一感染在 41～45 岁和 51～55 岁组也较高（图 1）。单一感染中感染率最高的 HPV52 在 31～35 岁和 61～65 岁年龄段较高（图 2）。多重感染中，20～25 岁年龄段的 HPV52 和 HPV16 感染率较其他年龄段高（图 3）。
图1
HPV 单一和多重感染率在各年龄段的分布情况
图2
单一感染中 4 种常见 HPV 感染率在各年龄段分布情况
图3
多重感染中 4 种常见 HPV 感染率在各年龄段分布情况
3 讨论
不同人群中 HPV 类型的分布具有差异较大。基于 WHO 数据，宫颈癌患者中 4 个最常见的 hrHPV 类型是 HPV16、18、33 和 45，而正常女性中最常见的类型是 HPV16、18、31 和 58[2]。在中国，宫颈癌患者中4个最常见的 hrHPV 类型分别是 HPV16、18、58 和 33；而在正常女性人群中最常见的类型为 HPV16、52、18 和 51[2]。本研究显示我院健康体检女性以 hrHPV 感染为主，最常见的基因型是 HPV52、53、16 和 58，这与赵丽等[6]的研究结果基本一致，但与冯余宽等[7]的研究结果不同，这可能与纳入人群的差异有关。
当前美国已有 3 种 HPV 疫苗注册，分别是二价疫苗（HPV16 和 18）、四价疫苗（HPV6、11、16 和 18）和九价疫苗（HPV6、11、16、18、31、33、45、52 和 58）。接种二价或四价疫苗能明显有效降低宫颈癌的风险[8]。中国国家食品药品监督管理局于 2016 年 7 月 12 日批准了 HPV16 和 18 型二价疫苗的进口注册申请。但宫颈癌并不只 HPV16/18 有关，还有 10%～20% 与其他 HPV 类型有关，如 HPV31、45、52 和 58[1]。本研究结果显示体检者 HPV 感染最常见为 HPV52、53、16 和 58，这非现有的二价和四价疫苗所能涵盖。虽然有研究提示 HPV 疫苗对 HPV 类型有交叉保护性[9, 10]，但由于 HPV 诱导产生的中和抗体具有型别特异性，交叉保护率可能较低[11]。此外，由于 HPV 的病毒自限性及宿主机体的免疫清除作用，HPV 筛查阳性并不能提示其一定患宫颈癌。即使筛查阴性，也有可能存在感染，发生不良结局。此外 2015 年，美国疾病控制中心性传播疾病的诊断和治疗指南也建议对已接种 HPV 疫苗的≥21 岁女性仍需继续进行常规宫颈癌的筛查[12]。
疫苗接种前 HPV 分型检测对评价疫苗具有重要价值，也可为研制新型疫苗提供依据[13]。对不同类型 HPV 疫苗进行成本效益分析，HPV 感染分布、疫苗对未覆盖亚型的有效性、防治技术的有效性和特异性、筛查和疫苗接种的覆盖率等因素均会影响其成本效益[14-17]。虽然国外已有不少研究评价了 HPV 疫苗的成本效益，但中国的研究较少，本研究的结果可在一定程度上为成本效益分析提供研究基础。
本研究结果显示，20～25 岁和 66 岁及以上体检者在单一及多重感染中的感染率均较高，这与 Wang 等[18]研究结果类似。年轻女性生殖道相对免疫保护系统尚不够成熟，抗感染能力弱，宫颈鳞状上皮细胞较敏感，易受 HPV 感染[19]。而随着年龄的增长，机体免疫能力逐渐降低，HPV 感染风险增高。41～45 岁和 51～55 岁年龄段在单一感染中也较高，这可能与围绝经期激素波动引起生理及免疫失调有关。因此，建议不同年龄段的女性均有必要进行 HPV 分型检测。
本研究中，HPV 感染阳性妇女中多重感染所占比例为 20.6%，低于上海（36.6%）、北京（27.7%）和山西（24.3%），但略高于河南（19.8%）、云南（18.0%）、湖南（17.7%）、新疆（15.5%）[3, 5, 21]。这体现了一定的地区特异性。
本研究的局限性：本研究仅纳入四川大学华西医院的健康体检者，也未收集体检者的细胞学数据，将来应开展基于总体人群的研究，探讨 HPV 分型的关系。
总之，基于本院健康体检者 HPV 感染情况，建议将 HPV52、53 和 58 纳入到 HPV 疫苗筛选评估中，为 HPV 感染及宫颈癌预防提供理论依据。
