miR-499a-5p 靶向 MMP-16 通过 Nrf2 信号通路减轻急性呼吸窘迫综合征大鼠的肺损伤_《中国呼吸与危重监护杂志》

作者：

段凌霄 ¹ , 李芹 ² ,  伍长学 ¹

1. 西南医科大学附属医院重症医学科（四川泸州 646000）;
2. 西南医科大学附属医院药学部（四川泸州 646000）;

关键词：

急性呼吸窘迫综合征 miR-499a-5p 基质金属蛋白酶-16 Nrf2 信号通路

DOI：

10.7507/1671-6205.201907059

视频：

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摘要 全文 图表 视频 参考文献 施引文献 补充材料

目的探讨 miR-499a-5p 高表达靶向基质金属蛋白酶-16（MMP-16）对急性呼吸窘迫综合征（ARDS）大鼠肺损伤的影响。方法实验设置假手术组、模型组、miR-499a-5p 模拟物组、MMP-16 组、miR-499a-5p 模拟物+MMP-16 组、Nrf2 信号通路抑制剂 D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB）组、miR-499a-5p 模拟物+DRB 组。利用盲肠穿刺的方法构建急性呼吸窘迫综合征大鼠模型，术前 1 h，用微型注射器将 50 μL 的转染复合物注入气管，术前 30 min，腹腔注射 DRB（5 mg/kg）。RT-qPCR 检测肺组织中 miR-499 和 MMP-16 表达水平；双荧光素酶报告基因验证靶向关系；分离模型组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞，MMP-16 3’UTR WT 和 MUT 荧光素酶报告质粒分别与 miR-499 共转染肺泡Ⅱ型上皮细胞，验证 miR-499 和 MMP-16 靶向关系；苏木素–伊红染色观察肺损伤；酶联免疫吸附试验检测支气管肺泡灌洗液中炎症因子和肺组织中氧化应激水平；蛋白印迹法分析肺组织中还原型辅酶/醌氧化还原酶（NQO1）、血红素加氧酶（HO）-1、核因子 E2 相关因子 2（Nrf2）蛋白表达水平。结果 miR-499 在 ARDS 模型大鼠的肺中低表达（P<0.01），而 MMP-16 高表达（P<0.01）；miR-499a-5p 与 MMP-16 3’UTR 区存在结合位点，且 miR-499a-5p 直接靶向负调控 MMP-16 表达（P<0.01）；miR-499a-5p 过表达能够明显降低 ARDS 大鼠的肺湿干重比（P<0.05），减轻肺组织损伤（P<0.01），降低支气管肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α、白细胞介素（IL）-1β 和 IL-6 含量（P<0.01），降低肺组织中丙二醛和髓过氧化物酶水平，提高总抗氧化能力（P<0.01），上调肺组织中 NQO1、HO-1、Nrf2 蛋白表达（P<0.01）。而加入 MMP-16 和 DRB 后都能够明显逆转该现象。结论 miR-499a-5p 过表达靶向负调控 MMP-16，通过激活 Nrf2 信号通路来减轻急性呼吸窘迫综合征大鼠的肺损伤。

引用本文： 段凌霄, 李芹, 伍长学. miR-499a-5p 靶向 MMP-16 通过 Nrf2 信号通路减轻急性呼吸窘迫综合征大鼠的肺损伤. 中国呼吸与危重监护杂志, 2021, 20(7): 487-494. doi: 10.7507/1671-6205.201907059 复制

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是指各种肺内和肺外致病因素所导致的急性弥漫性肺损伤和进而发展的急性呼吸衰竭^[1]。其特征是肺微血管通透性增高、肺水肿、低氧血症，以及局部或全身肺部炎症程度明显增加^[2]。尽管 ARDS 的治疗策略已经取得了进步，但 ARDS 在重症患者死亡中仍然占有相当大的比例^[3]。越来越多的证据表明，β2 受体激动剂（沙美特罗、福莫特罗）等药物虽可用于治疗 ARDS，但会导致包括毒性肝脏和应激障碍、偏执和抑郁等不良反应，且临床药物治疗基本无效^[4]。近年来，微小 RNA（miRNA，miR）被认为是 ARDS 的诊断生物标志物或治疗靶点^[5]。miR-499a-5p 可作为肺癌的治疗靶点，且能够保护心肌免受缺血损伤^[6-7]。虽有报道称 miR-499 在 ARDS 患者血清中低表达，但对其在 ARDS 的作用及机制尚不清楚^[8]。基质金属蛋白酶-16（MMP-16）蛋白能够激活基质金属蛋白酶-2（MMP-2），而已有研究表明 MMP-2 在 ARDS 中高表达，下调 MMP-2 能够抑制 ARDS 引起的损伤^[9]。众多研究表明激活核因子 E2 相关因子 2（Nrf2）信号通路能够预防急性肺损伤^[10]。基于上述文献，本研究主要通过 MMP-16 和 Nrf2 信号通路两方面来研究 miR-499a-5p 对 ARDS 大鼠的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料

健康雄性 SD 大鼠 84 只，清洁级（8～9 周龄），体重 240～280 g，购自四川夏派森医药科技有限公司［许可证：SYXK（川）2017-203］。所有大鼠均于 24 ℃、相对湿度 50%、无特异性病原体环境中饲养，光照和黑暗交替 12 h。该研究经西南医科大学附属医院伦理委员会审查并批准［批准号 XNYKDXFSYY-2019012］。

miR-499a-5p 模拟物序列及 MMP-16 过表达质粒及各引物均由上海基因制药有限公司设计并合成。D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB；美国 Sigma 公司)，QIAzol 裂解试剂（北京鸿跃创新科技有限公司），cDNA 逆转录试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司），SYBR-Green PCR 试剂盒（赛默飞世尔科技公司），脱氧核糖核酶Ⅰ（DNase Ⅰ，北京鼎国生物技术），DMEM 培养基、胰蛋白酶和胎牛血清（美国 Gibco 公司），溶液Ⅰ配制（NaCl 140 mmol/L、KCl 5 mmol/L、Na₂HPO₄ 2.5 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、葡萄糖 6 mmol/L、pH 7.4)，溶液Ⅱ配制（NaCl 140 mmol/L、KCl 5 mmol/L、CaCl₂ 2 mmol/L、MgSO₄ 1.3 mmol/L、Na₂HPO₄ 2.5 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、葡萄糖 6 mmol/L、pH 7.4），双荧光素酶报告基因检测试剂盒（北京原平皓生物技术有限公司），RIPA 裂解缓冲液（南京海克尔生物科技有限公司），二辛可酸（BCA）试剂盒（上海易色医疗科技有限公司），Nrf2 抗体（上海艾博抗生物科技有限公司），还原型辅酶/醌氧化还原酶（NQO1）抗体（上海艾博抗生物科技有限公司），血红素加氧酶（HO）-1 抗体（上海艾博抗生物科技有限公司），白细胞介素（IL）-6、IL-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（上海联硕生物刻科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 试验动物分组、模型建立及处理^[11]

将大鼠随机分为 7 组（n=12）：假手术组（Sham 组）、模型组（Model 组）、miR-499a-5p 模拟物组、MMP-16 组、miR-499a-5p 模拟物+MMP-16 组、Nrf2 信号通路抑制剂 DRB 组、miR-499a-5p 模拟物+DRB 组。所有大鼠术前禁食 12 h。大鼠麻醉后，固定在手术台上，然后去除腹部毛发；切开大鼠腹部，取出 Sham 组大鼠盲肠缝合，暴露于大鼠腹部，其余组大鼠盲肠中央用丝线结扎；用穿刺针从肠系膜一侧穿刺盲肠至另一侧；取出适量的肠内容物，缝合盲肠。术前 1 h，将大鼠麻醉后固定于手术台上，颈部除毛；用微型注射器将 50 μL的转染复合物（miR-499a-5p 模拟物、MMP-16 过表达质粒）注入气管；转染后，将大鼠直立旋转，使转染复合物均匀分布于肺内。DRB 组和 miR-494 模拟物+DRB 组大鼠在模型建立前 30 min 腹腔注射 DRB（5 mg/kg）。术后 24 h 处死大鼠，开胸结扎大鼠肺。肺灌洗后收集支气管肺泡灌洗液（BALF）。将肺左叶部分–80 ℃ 保存，提取总蛋白和 RNA，将肺左叶部分浸泡在 10% 甲醛中，进行组织学检测。切除右肺中叶，称湿重。然后在恒温箱中 56 ℃ 干燥 72 h，再次称重，记为干重。计算湿干重比（W/D）。

1.2.2 RT-qPCR 检测肺组织中 miR-499a-5p 和 MMP-16 表达水平

用 Trizol 试剂盒从左肺组织中提取总 RNA。采用分光光度计测定 RNA 中 D260/D280 的比例和 RNA 的浓度。D260/D280 范围 1.8～2.0 为提取 RNA 的高纯度，用于进一步检测。按照 cDNA 逆转录试剂盒和 qPCR 试剂盒的说明书分别将 RNA 逆转录成 cDNA 并制备 qPCR 体系。反应采用实时 PCR 仪进行。反应条件：95 ℃ 预变性 15 min，95 ℃ 预变性 10 s，40 个循环，65 ℃ 退火延伸 30 s。引物序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列如下：GAPDH 的上游引物序列：5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'；GAPDH 的下游引物序列：5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'。miR-499a-5p 的上游引物序列：5'-ACTGCTTAAGACTTGGAGTGA-3'；miR-499a-5p 的下游引物序列：5'-TACATTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3'。MMP-16 的上游引物序列：5'-TGGCCAATCCGGGCCATGACCT-3'；MMP-16 的下游引物序列：5'-TGGCCTCTAAGGCCTTATTTA-3'。

1.2.3 大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离^[12]

取模型组大鼠肺组织，经肺动脉用溶液Ⅱ灌洗肺，气管通气 8 次，经气管插管用溶液 Ι 灌洗肺 8 次，再用溶液Ⅱ灌洗 3 次，用胰蛋白酶注入肺，快速取出肺，37 ℃ 水浴 30 min，去除大气道，在含有 DNase Ⅰ 的小烧杯中剪碎肺，用胎牛血清灭活胰蛋白酶，补足溶液Ⅱ倒入烧杯中，37 ℃ 水浴振荡 5 min，200 目滤网过滤 800 r/min 离心 10 min，弃上清，用 DMEM 重悬细胞，即获得肺泡Ⅱ型上皮细胞。

1.2.4 双荧光素酶报告基因验证靶向关系

利用生物预测网站（http://www.targetscan.org）预测 miR-499a-5p 与 MMP-16 的靶点关系，以及 miR-499a-5p 与 MMP-16 3’UTR 的结合位点，并通过双荧光素酶报告基因检测进行鉴定。合成含有 miR-499a-5p 结合位点的 MMP-16 3'UTR 启动子序列，构建 MMP-16 3'UTR 野生型（WT）质粒。在此质粒的基础上，构建突变型（MUT）MMP-16 3’UTR 质粒，结合位点发生突变。上述质粒由苏州金唯智生物科技有限公司合成，根据质粒提取试剂盒进行操作。将 MMP-16 3’UTR WT 和 MUT 荧光素酶报告质粒分别与 miR-499a-5p 共转染肺泡Ⅱ型上皮细胞。48 h 后收集细胞进行裂解，荧光素酶活性测定采用荧光测定试剂盒。采用 Glomax 20/20 发光计测定荧光素酶活性。实验重复 3 次。

1.2.5 苏木素–伊红染色观察肺损伤

将左肺组织块固定 24 h 后，用二甲苯脱水，石蜡包埋，切片，干燥，脱蜡。随后，切片进行苏木素–伊红（HE）染色，苏木素染色 5 min 后蒸馏水冲洗，乙醇盐酸显色，然后用伊红染色 2 min，脱水、清除、干燥、裱装。用光学显微镜观察组织学变化并拍照。

1.2.6 ELISA 法检测 BALF 中炎症因子水平和肺组织中氧化应激水平

收集各组 BALF，离心 10 min。收集上清液，使用 IL-1β、IL-6、TNF-α 酶联免疫试剂盒检测 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。每个样品重复 3 次。收集大鼠的肺，裂解肺组织，使用酶联免疫试剂盒测定丙二醛（MDA）、髓过氧化物酶（MPO）、总抗氧化（TAOC）的水平。

1.2.7 蛋白印迹法分析肺组织中 NQO1、HO-1 和 Nrf2 蛋白表达水平

取各组大鼠左肺组织提取蛋白，采用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度。将 30 μg 提取的蛋白质 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳电压分离后，样品湿法转移到聚偏氟乙烯膜上，然后在 10% 脱脂牛奶中室温封膜 1 h。样本与抗体 I（NQO1 1∶1 000、HO-1 1∶500、Nrf2 1∶1 000），在 4 ℃ 孵育过夜。TBST 冲洗 3 次，然后加入用辣根过氧化物酶标记的二级抗体 IgG 山羊抗兔多克隆抗体，在 37 ℃ 孵育 2 h。TBST 冲洗 3 次，用二氨基苯并苯胺制备了膜。GAPDH 作为内参，薄膜由 Bio-rad 凝胶 Doc EZ 成像仪拍摄，利用 Image J 软件分析目标蛋白带的灰度值比值。

1.3 统计学方法

采用 SPSS 21.0 统计软件。采用非配对 t 检验比较两组数据的正态分布和方差齐性，呈正态分布的测量数据用均数±标准差（±s）表示。两组间比较采用 LSD-t 检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-499a-5p 和 MMP-16 在 ARDS 模型大鼠肺中的表达

如图 1 所示，与 Sham 组相比，模型组大鼠肺组织中 miR-499a-5p 表达明显下调（P<0.01），MMP-16 mRNA 表达明显上调（P<0.01），说明 miR-499a-5p 在 ARDS 模型大鼠的肺中低表达，而 MMP-16 高表达。与 Model 组相比，miR-499a-5p 模拟物组 miR-499a-5p 表达明显上调（P<0.01），MMP-16 mRNA 表达明显下调（P<0.01），MMP-16 组 miR-499a-5p 表达明显下调（P<0.01），MMP-16 mRNA 表达明显上调（P<0.01），说明转染成功。

图1 RT-qPCR 检测肺组织中 miR-499a-5p 和 MMP-16 mRNA 表达水平（n=3，

）　

与 Sham 组比较，^&P<0.01；与 Model 组比较，^*P<0.01；与 miR-499a-5p 模拟物组比较，^#P<0.01。

图选项

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