引用本文： 刘硕, 朱丽慧, 廖天一, 张翔, 蔡辉. 基于双硫死亡相关基因的胃癌预后预测模型的构建及验证. 中国普外基础与临床杂志, 2023, 30(11): 1333-1340. doi: 10.7507/1007-9424.202307041 复制
胃癌（gastric cancer）是世界上最常见的癌症之一，其进展快、治疗效果不理想、死亡率高，已对人类的生命安全构成严重威胁[1]。尽管随着医学的不断发展，胃癌的治疗手段有了长足的进步，但其生存率仍无法令人满意[2]。如何进一步改善胃癌患者的预后，提高生活质量，是一个亟待解决的健康问题。因此，开发出一些有效的肿瘤标志物用来指导胃癌患者的早期诊断和预后评价意义重大[3]。双硫死亡（disulfidptosis）是一种最新发现的程序性死亡（programmed cell death，PCD）形式，研究[4]表明，细胞内二硫化物的异常积累，如胱氨酸，会诱导二硫化物应激，并对细胞产生高度毒性。在高表达SLC7A11的肿瘤细胞中，氧化还原状态被改变，二硫化物积累破坏细胞组蛋白骨架间二硫键的正常结合，使其从细胞质膜上剥离，最终导致细胞死亡。因此，双硫死亡与癌症之间存在着密切的联系。许多癌细胞通过氧化应激，导致二硫化物代谢紊乱，从而影响癌细胞的生存和增殖[5-6]。除此之外，双硫死亡作为一种新的PCD模式，可能与肿瘤免疫反应有一定的相关性。双硫死亡产生的细胞死亡信号能够被肿瘤免疫细胞识别，从而激活肿瘤特异性T细胞的免疫反应，增强体液免疫和细胞免疫的有效性，最终提高肿瘤的治疗效果[7]。在本研究中，笔者利用生物信息学的方法，建立了一个双硫死亡相关的预后评分模型，以期为临床免疫治疗和预后评估提供新的思路。
1 方法
1.1 数据收集和处理
胃癌患者的转录组数据和临床信息分别来自于TCGA（412例胃癌组织和36例正常对照）和GEO（483例胃癌组织）数据库。TCGA数据库选择TCGA-STAD数据集中的mRNA表达数据，数据类型选择FPKM；GEO数据库选择GSE84437数据集。数据库样本中的37%甲醛溶液浸泡样本和转移样本被剔除，临床病理数据缺失的个体在分析过程中也被排除。使用R软件中的“SVA”包对数据去除批次效应。
1.2 双硫死亡相关基因（disulfidptosis-related genes，DRGs）的表达与预后
从最近发表的一篇文献[4]中获得了24个DRGs用于后续的分析研究，分别为：SLC7A11、SLC3A2、RPN1、NCKAP1、NUBPL、NDUFA11、LRPPRC、OXSM、NDUFS1、GYS1、FLNA、FLNB、MYH9、TLN1、ACTB、MYL6、MYH10、CAPZB、DSTN、IQGAP1、ACTN4、PDLIM1、CD2AP和INF2。使用R软件中的“ggpubr”包分析TCGA-STAD数据集并绘制DRGs表达箱线图。之后，将上述2个数据集与生存数据合并，以供后续分析。其中总生存期（overall survival，OS）不明的样本被剔除，此时TCGA-STAD和GSE84437数据集中剩余的样本数分别为404例和433例，共计 837例样本。R软件中的“survival”包用于分析DRGs与OS之间的关系。根据Cox比例风险回归计算其风险比（hazard ratio，HR）及其95%可信区间（confidence interval，95%CI）。本研究检验水准α=0.05。
1.3 样本聚类分析
使用R软件中的“Consensus Cluster Plus”包对24个DRGs表达进行无监督聚类分析，以识别不同的DRGs相关聚类[8]。应用“K-Means”算法，并使用“欧几里得”作为距离单位，同时对80%的项目进行重新采样和1 000次复制[9]。根据模糊聚类比例（proportion of ambiguous clustering，PAC）确定最佳k值（本研究为 2）。对两个DRGs簇进行主成分分析（principal component analysis，PCA），以确定聚类结果的可靠性。使用对数秩检验比较两类间OS的差异。
1.4 DRGs相关差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）的筛选和富集分析
采用R软件的“limma”包用于探索两个DRGs集群之间的DEGs，使用|log2 FC|>1 ［FC为差异倍数（fold change）］和FDR<0.05 ［FDR为错误发现率（false discovery rate）］ 作为截止值[10]。使用“clusterProfiler”和“annotation”包对DRGs相关的DEGs进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析[11]。
1.5 预后模型的建立
将整体集随机平均分组为训练集（n=419）和验证集（n=418）。首先，在训练集中使用R软件中的“glmnet”包进行LASSO-Cox回归分析，以缩小并选择最理想的双硫死亡相关的预后特征（disulfidptosis-related prognostic signature，DRPS）基因。根据模型中关键基因的表达谱，使用模型方程计算双硫死亡风险评分。模型公式：风险评分=
（expi为基因表达，coef为基因风险系数）。之后，根据训练集的中位风险评分将所有参与研究的胃癌样本分为高风险组和低风险组，并采用Cox比例风险回归比较高低风险组的OS差异。
1.6 预测价值的验证
在整体集、训练集和验证集中验证预测模型的准确度。将所有样本按照风险评分进行升序排列，并绘制生存状况散点图，以观察风险评分与生存状态的关系。分别绘制整体集、训练集和验证集的OS曲线和受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，用于验证模型的准确性。使用“rms”软件包建立包含临床参数的风险评分相关列线图。为了评估实际生存率和列线图预测生存率之间的拟合效果，生成了校准曲线。
1.7 免疫相关性分析
为了进一步观察胃癌患者不同风险评分之间的潜在差异，使用CIBERSORT算法探索免疫细胞浸润与风险的关联。使用R包“CIBERSORT”计算每个胃癌样本中免疫细胞亚群的比例，使用Spearman秩相关性分析计算风险评分、模型基因表达量和免疫细胞的相关性，使用R软件的“ggplot”包将结果可视化。
2 结果
2.1 DRGs在胃癌中的表达谱
首先，在TCGA-STAD数据集中，与正常组织相比，胃癌组织中SLC7A11、SLC3A2、RPN1、NUBPL、LRPPRC、OXSM、FLNB、MYH9、MYH10、IQGAP1、PDLIM1、CD2AP和INF2共13种基因表达上调，FLNA、MYL6和DSTN表达下调，剩余8种基因则无统计学意义（图1）。之后，使用整体集对所有胃癌样本进行分析，单因素Cox比例风险回归分析结果显示，有9种基因影响OS：LRPPRC ［HR=0.792，95%CI（0.649，0.968），P=0.023］、OXSM ［HR=0.653，95%CI（0.509，0.838），P<0.001］、NDUFS1 ［HR=0.729，95%CI（0.575，0.924），P=0.009］、GYS1 ［HR=0.756，95%CI（0.591，0.967），P=0.026］、FLNA ［HR=1.192，95%CI（1.095，1.297），P<0.001］、TLN1 ［HR=1.188，95% CI（1.021，1.382），P=0.025］、MYL6 ［HR=1.460，95%CI（1.158，1.839），P<0.001］、MYH10 ［HR=1.191，95%CI（1.073，1.323），P=0.001］ 和DSTN ［HR=1.219，95%CI（1.048，1.417），P=0.010］。具体见表1。
图1
示DRGs在胃癌组织与正常组织间的表达差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
表1
胃癌患者DRGs表达量与OS关系的单因素Cox比例风险回归分析结果
2.2 胃癌的DRGs簇识别
为全面了解胃癌中DRGs的表达模式，将来自TCGA-STAD和GSE84437数据集的样本进行了整合。使用基于24个DRGs的一致聚类算法，在837个胃癌样本中确定了两种不同的亚型（图2a），累积分布函数图（cumulative distribution function，CDF）同样表明，集群的最佳数量为2（图2b）。因此，整合数据集被分为两个DRGs集群，其中集群B表现出显著的生存优势（图2c）。PCA结果显示，两个DRGs亚群能够较明显地将837例胃癌样本区分开来（图2d）。
图2
示胃癌的DRGs簇识别及验证、GO富集分析和KEGG富集分析结果，以及风险评分与生存的关系
a：通过一致性聚类鉴定出双硫死亡相关的两种亚型；b：从
2.3 DRGs簇差异基因表达谱的富集分析
使用R软件的“limma”包鉴定出2个DRGs集群之间的299个DEGs，并对299个DEGs进行GO和KEGG分析，以探索相关功能通路。GO富集分析结果显示，DEGs与细胞外基质组织、硫化物结合、生长因子结合、整合素结合等功能有关。KEGG分析结果表明，血管平滑肌收缩、环磷酸鸟苷酸-蛋白激酶G（cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G，cGMP-PKG）信号通路、Wnt信号通路、细胞外基质-受体相互作用、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信号通路、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路等肿瘤相关通路显著富集（图2e和2f）。
2.4 双硫死亡相关预后模型的构建
将299个DEGs作为种子基因，使用LASSO回归识别出14个DEGs参与模型的构建，其相关风险系数见表2。通过中位风险值将所有患者（N总=837）分为高风险和低风险两组。分别在整体集、训练集和验证集中，将所有样本按照风险评分进行升序排列（图2g～2l）。结果显示，随着风险的增加，生存期达到5年以上的患者逐渐减少、死亡患者逐渐增多，高低风险组之间具有较明显的差异。
表2
模型构成基因及其相关风险系数
2.5 预后模型预测效果的验证
本研究进一步验证了预测模型对OS的预测效果，结果表明，在整体集、训练集和验证集中，高风险组的OS均差于低风险组（图3a～3c），差异有统计学意义（P<0.05）。ROC曲线显示，在整体集、训练集和验证集中，模型预测的1、3、5年生存率均显示出了较好的灵敏度（图3d～3f）。
图3
示不同风险胃癌患者的OS曲线及预后风险模型的ROC曲线、OS预测列线图及其效能评估结果
a、b、c：整体集（a）、训练集（b）和验证集（c）中高风险和低风险胃癌患者的OS曲线；d、e、f：预后风险模型预测整体集（d）、训练集（e）和验证集（f）中胃癌患者1、3、5 年总生存率的ROC曲线；g、h：OS预测列线图（g）及其效能评估结果（h），***
2.6 预后模型的预测价值
使用整体集的数据，本研究通过“rms”软件包创建了一个列线图来预测胃癌患者1年、3年和5年的预期存活率（图3g）。每例患者的总积分值是根据其性别、年龄、风险水平（低风险表示低DRGs评分，高风险表示高DRGs评分）以及肿瘤T和N分期来确定的。预后的程度与患者的总体评分直接相关。校准曲线图显示，列线图的预测效果较好（图3h）。
2.7 免疫相关性分析
本研究进一步探索了风险评分对肿瘤免疫治疗的影响，结果显示，风险评分与滤泡辅助性T细胞、CD8+T细胞、记忆性CD4+T细胞激活、浆细胞和M1巨噬细胞所占比例呈负相关（P<0.05），风险评分与记忆性CD4+T细胞休眠、中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞休眠、M2巨噬细胞和树突状细胞激活呈正相关（P<0.05），见图4。
3 讨论
胃癌作为一种常见的恶性肿瘤，被发现时通常已是晚期，患者的预后普遍不理想[12]。早期胃癌通常采用传统治疗方法即手术切除，其中胃大部切除术+化疗是公认最有效的胃癌治疗方法，但由于其较多的并发症，患者生活质量通常较差[13-14]。对于晚期的患者，中位OS为3～4个月，5年生存率仅为3.17%，总体预后难以令人满意。近年来，随着免疫疗法的不断进步，晚期胃癌的治疗效果有了显著提高[15]。研究[16]表明，胃癌患者的治疗反应和预后与免疫细胞成分密切相关。
双硫死亡作为一种新的细胞死亡方式，在肿瘤发生中的作用尚不明确。之前的研究表明，二硫化物在癌症中起到促进复发作用[17]，线粒体中二硫键的聚合可以改变肿瘤的进展，激活细胞坏死性凋亡[18]。当二硫化钼（molybdenum disulfide，MoS2）与金属有机骨架结合时，可以形成针对肿瘤的多功能诊断治疗纳米平台[19]。Liu等[4]提出二硫化物在肿瘤细胞中的积累导致细胞解体和死亡，为肿瘤的治疗提供了新的方向。
目前对胃癌的分类方法主要是基于肿瘤细胞的病理特征，根据许多研究，基于不同特征的胃癌亚型也可以揭示临床相关性和预后价值[20]。本研究基于无监督聚类将患者分为两种双硫死亡亚型，试图为胃癌诊断和治疗的新特征模式提供理论依据。本研究发现，24个DRGs中有16个基因与预后有关。这可能是由于，当组织和细胞中的二硫键集聚时，肿瘤细胞的氧化还原系统被激活，进而使肿瘤细胞免于降解和死亡[21]，这揭示了双硫死亡是一种抗肿瘤细胞的关键方式。GO和KEGG分析也显示，DEGs 在多种肿瘤相关通路显著富集，这与甲状腺癌[22]、乳腺癌[23]和肝癌[24]的研究结果是一致的。
为了探索双硫死亡在胃癌中的作用，笔者从不同亚型的DEGs中筛选了14个关键基因构建了OS预测模型，并从内部和外部验证了其准确性，结果显示该模型能够较准确地预测患者的预后。随后，笔者探索了风险评分与免疫细胞浸润的关系，结果显示，大部分特异性免疫细胞比例与风险评分呈负相关，尤其是高风险评分时的CD8+T细胞浸润降低，往往预示着更差的预后[25]。
对于这14个DRGs相关的mRNAs，既往的研究[26]发现，FLNA能够通过抑制血管内皮生长因子的表达水平，进一步遏制肿瘤新血管的生成，最终抑制胃癌细胞的局部复发和远处转移；ALDH1B1是醛脱氢酶家族的成员，在促进结直肠癌和胰腺癌的进展中起到重要作用[27]；除此之外，有研究[28]表明，EIF4E依赖性ALDH1B1抑制能够增强铁死亡诱导剂在体外和体内的抗癌活性；IL-33可使巨噬细胞向肿瘤起始细胞发送旁分泌TGF-β信号，诱导侵入性和耐药性，并进一步上调IL-33表达[29]。TGFBR3、AHNAK2、THBS1和PDK4为甲状腺癌[30]、结直肠癌[31]、胰腺癌[32]或胃癌[33]诊断和预后的治疗靶点和潜在生物标志物，此外CHRNA3是肺癌中的显著致癌基因，但在胃癌中的作用尚不明确[34]；目前尚未发现PDE1A、OMD、DPT和PI16在癌症预后中作用的相关报道。
然而，本研究也存在一些局限性。首先，本研究所有数据均来自于公共数据库，缺乏基础实验验证；第二，本研究结果需要更多的独立队列和更大的样本量来验证模型的准确性；第三，本研究是对胃癌的回顾性研究，未涉及基因的功能和机制验证，这将是我们未来努力的方向。
总的来说，本研究在胃癌样本中定量构建了双硫死亡风险评分模型，该评分对肿瘤患者的预后评估具有一定的预测价值，是一种新的预后生物标志物。
重要声明
利益冲突声明：本文所有作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：蔡辉，指导研究；刘硕，分析数据及撰写初稿；朱丽慧，整理数据并修改手稿；廖天一和张翔，技术支持及图片制作。所有作者均审阅了此文稿并同意最终文稿。
胃癌（gastric cancer）是世界上最常见的癌症之一，其进展快、治疗效果不理想、死亡率高，已对人类的生命安全构成严重威胁[1]。尽管随着医学的不断发展，胃癌的治疗手段有了长足的进步，但其生存率仍无法令人满意[2]。如何进一步改善胃癌患者的预后，提高生活质量，是一个亟待解决的健康问题。因此，开发出一些有效的肿瘤标志物用来指导胃癌患者的早期诊断和预后评价意义重大[3]。双硫死亡（disulfidptosis）是一种最新发现的程序性死亡（programmed cell death，PCD）形式，研究[4]表明，细胞内二硫化物的异常积累，如胱氨酸，会诱导二硫化物应激，并对细胞产生高度毒性。在高表达SLC7A11的肿瘤细胞中，氧化还原状态被改变，二硫化物积累破坏细胞组蛋白骨架间二硫键的正常结合，使其从细胞质膜上剥离，最终导致细胞死亡。因此，双硫死亡与癌症之间存在着密切的联系。许多癌细胞通过氧化应激，导致二硫化物代谢紊乱，从而影响癌细胞的生存和增殖[5-6]。除此之外，双硫死亡作为一种新的PCD模式，可能与肿瘤免疫反应有一定的相关性。双硫死亡产生的细胞死亡信号能够被肿瘤免疫细胞识别，从而激活肿瘤特异性T细胞的免疫反应，增强体液免疫和细胞免疫的有效性，最终提高肿瘤的治疗效果[7]。在本研究中，笔者利用生物信息学的方法，建立了一个双硫死亡相关的预后评分模型，以期为临床免疫治疗和预后评估提供新的思路。
1 方法
1.1 数据收集和处理
胃癌患者的转录组数据和临床信息分别来自于TCGA（412例胃癌组织和36例正常对照）和GEO（483例胃癌组织）数据库。TCGA数据库选择TCGA-STAD数据集中的mRNA表达数据，数据类型选择FPKM；GEO数据库选择GSE84437数据集。数据库样本中的37%甲醛溶液浸泡样本和转移样本被剔除，临床病理数据缺失的个体在分析过程中也被排除。使用R软件中的“SVA”包对数据去除批次效应。
1.2 双硫死亡相关基因（disulfidptosis-related genes，DRGs）的表达与预后
从最近发表的一篇文献[4]中获得了24个DRGs用于后续的分析研究，分别为：SLC7A11、SLC3A2、RPN1、NCKAP1、NUBPL、NDUFA11、LRPPRC、OXSM、NDUFS1、GYS1、FLNA、FLNB、MYH9、TLN1、ACTB、MYL6、MYH10、CAPZB、DSTN、IQGAP1、ACTN4、PDLIM1、CD2AP和INF2。使用R软件中的“ggpubr”包分析TCGA-STAD数据集并绘制DRGs表达箱线图。之后，将上述2个数据集与生存数据合并，以供后续分析。其中总生存期（overall survival，OS）不明的样本被剔除，此时TCGA-STAD和GSE84437数据集中剩余的样本数分别为404例和433例，共计 837例样本。R软件中的“survival”包用于分析DRGs与OS之间的关系。根据Cox比例风险回归计算其风险比（hazard ratio，HR）及其95%可信区间（confidence interval，95%CI）。本研究检验水准α=0.05。
1.3 样本聚类分析
使用R软件中的“Consensus Cluster Plus”包对24个DRGs表达进行无监督聚类分析，以识别不同的DRGs相关聚类[8]。应用“K-Means”算法，并使用“欧几里得”作为距离单位，同时对80%的项目进行重新采样和1 000次复制[9]。根据模糊聚类比例（proportion of ambiguous clustering，PAC）确定最佳k值（本研究为 2）。对两个DRGs簇进行主成分分析（principal component analysis，PCA），以确定聚类结果的可靠性。使用对数秩检验比较两类间OS的差异。
1.4 DRGs相关差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）的筛选和富集分析
采用R软件的“limma”包用于探索两个DRGs集群之间的DEGs，使用|log2 FC|>1 ［FC为差异倍数（fold change）］和FDR<0.05 ［FDR为错误发现率（false discovery rate）］ 作为截止值[10]。使用“clusterProfiler”和“annotation”包对DRGs相关的DEGs进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析[11]。
1.5 预后模型的建立
将整体集随机平均分组为训练集（n=419）和验证集（n=418）。首先，在训练集中使用R软件中的“glmnet”包进行LASSO-Cox回归分析，以缩小并选择最理想的双硫死亡相关的预后特征（disulfidptosis-related prognostic signature，DRPS）基因。根据模型中关键基因的表达谱，使用模型方程计算双硫死亡风险评分。模型公式：风险评分=（expi为基因表达，coef为基因风险系数）。之后，根据训练集的中位风险评分将所有参与研究的胃癌样本分为高风险组和低风险组，并采用Cox比例风险回归比较高低风险组的OS差异。
1.6 预测价值的验证
在整体集、训练集和验证集中验证预测模型的准确度。将所有样本按照风险评分进行升序排列，并绘制生存状况散点图，以观察风险评分与生存状态的关系。分别绘制整体集、训练集和验证集的OS曲线和受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线，用于验证模型的准确性。使用“rms”软件包建立包含临床参数的风险评分相关列线图。为了评估实际生存率和列线图预测生存率之间的拟合效果，生成了校准曲线。
1.7 免疫相关性分析
为了进一步观察胃癌患者不同风险评分之间的潜在差异，使用CIBERSORT算法探索免疫细胞浸润与风险的关联。使用R包“CIBERSORT”计算每个胃癌样本中免疫细胞亚群的比例，使用Spearman秩相关性分析计算风险评分、模型基因表达量和免疫细胞的相关性，使用R软件的“ggplot”包将结果可视化。
2 结果
2.1 DRGs在胃癌中的表达谱
首先，在TCGA-STAD数据集中，与正常组织相比，胃癌组织中SLC7A11、SLC3A2、RPN1、NUBPL、LRPPRC、OXSM、FLNB、MYH9、MYH10、IQGAP1、PDLIM1、CD2AP和INF2共13种基因表达上调，FLNA、MYL6和DSTN表达下调，剩余8种基因则无统计学意义（图1）。之后，使用整体集对所有胃癌样本进行分析，单因素Cox比例风险回归分析结果显示，有9种基因影响OS：LRPPRC ［HR=0.792，95%CI（0.649，0.968），P=0.023］、OXSM ［HR=0.653，95%CI（0.509，0.838），P<0.001］、NDUFS1 ［HR=0.729，95%CI（0.575，0.924），P=0.009］、GYS1 ［HR=0.756，95%CI（0.591，0.967），P=0.026］、FLNA ［HR=1.192，95%CI（1.095，1.297），P<0.001］、TLN1 ［HR=1.188，95% CI（1.021，1.382），P=0.025］、MYL6 ［HR=1.460，95%CI（1.158，1.839），P<0.001］、MYH10 ［HR=1.191，95%CI（1.073，1.323），P=0.001］ 和DSTN ［HR=1.219，95%CI（1.048，1.417），P=0.010］。具体见表1。
图1
示DRGs在胃癌组织与正常组织间的表达差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
表1
胃癌患者DRGs表达量与OS关系的单因素Cox比例风险回归分析结果
2.2 胃癌的DRGs簇识别
为全面了解胃癌中DRGs的表达模式，将来自TCGA-STAD和GSE84437数据集的样本进行了整合。使用基于24个DRGs的一致聚类算法，在837个胃癌样本中确定了两种不同的亚型（图2a），累积分布函数图（cumulative distribution function，CDF）同样表明，集群的最佳数量为2（图2b）。因此，整合数据集被分为两个DRGs集群，其中集群B表现出显著的生存优势（图2c）。PCA结果显示，两个DRGs亚群能够较明显地将837例胃癌样本区分开来（图2d）。
图2
示胃癌的DRGs簇识别及验证、GO富集分析和KEGG富集分析结果，以及风险评分与生存的关系
a：通过一致性聚类鉴定出双硫死亡相关的两种亚型；b：从
2.3 DRGs簇差异基因表达谱的富集分析
使用R软件的“limma”包鉴定出2个DRGs集群之间的299个DEGs，并对299个DEGs进行GO和KEGG分析，以探索相关功能通路。GO富集分析结果显示，DEGs与细胞外基质组织、硫化物结合、生长因子结合、整合素结合等功能有关。KEGG分析结果表明，血管平滑肌收缩、环磷酸鸟苷酸-蛋白激酶G（cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G，cGMP-PKG）信号通路、Wnt信号通路、细胞外基质-受体相互作用、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信号通路、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号通路等肿瘤相关通路显著富集（图2e和2f）。
2.4 双硫死亡相关预后模型的构建
将299个DEGs作为种子基因，使用LASSO回归识别出14个DEGs参与模型的构建，其相关风险系数见表2。通过中位风险值将所有患者（N总=837）分为高风险和低风险两组。分别在整体集、训练集和验证集中，将所有样本按照风险评分进行升序排列（图2g～2l）。结果显示，随着风险的增加，生存期达到5年以上的患者逐渐减少、死亡患者逐渐增多，高低风险组之间具有较明显的差异。
表2
模型构成基因及其相关风险系数
2.5 预后模型预测效果的验证
本研究进一步验证了预测模型对OS的预测效果，结果表明，在整体集、训练集和验证集中，高风险组的OS均差于低风险组（图3a～3c），差异有统计学意义（P<0.05）。ROC曲线显示，在整体集、训练集和验证集中，模型预测的1、3、5年生存率均显示出了较好的灵敏度（图3d～3f）。
图3
示不同风险胃癌患者的OS曲线及预后风险模型的ROC曲线、OS预测列线图及其效能评估结果
a、b、c：整体集（a）、训练集（b）和验证集（c）中高风险和低风险胃癌患者的OS曲线；d、e、f：预后风险模型预测整体集（d）、训练集（e）和验证集（f）中胃癌患者1、3、5 年总生存率的ROC曲线；g、h：OS预测列线图（g）及其效能评估结果（h），***
2.6 预后模型的预测价值
使用整体集的数据，本研究通过“rms”软件包创建了一个列线图来预测胃癌患者1年、3年和5年的预期存活率（图3g）。每例患者的总积分值是根据其性别、年龄、风险水平（低风险表示低DRGs评分，高风险表示高DRGs评分）以及肿瘤T和N分期来确定的。预后的程度与患者的总体评分直接相关。校准曲线图显示，列线图的预测效果较好（图3h）。
2.7 免疫相关性分析
本研究进一步探索了风险评分对肿瘤免疫治疗的影响，结果显示，风险评分与滤泡辅助性T细胞、CD8+T细胞、记忆性CD4+T细胞激活、浆细胞和M1巨噬细胞所占比例呈负相关（P<0.05），风险评分与记忆性CD4+T细胞休眠、中性粒细胞、单核细胞、肥大细胞休眠、M2巨噬细胞和树突状细胞激活呈正相关（P<0.05），见图4。
3 讨论
胃癌作为一种常见的恶性肿瘤，被发现时通常已是晚期，患者的预后普遍不理想[12]。早期胃癌通常采用传统治疗方法即手术切除，其中胃大部切除术+化疗是公认最有效的胃癌治疗方法，但由于其较多的并发症，患者生活质量通常较差[13-14]。对于晚期的患者，中位OS为3～4个月，5年生存率仅为3.17%，总体预后难以令人满意。近年来，随着免疫疗法的不断进步，晚期胃癌的治疗效果有了显著提高[15]。研究[16]表明，胃癌患者的治疗反应和预后与免疫细胞成分密切相关。
双硫死亡作为一种新的细胞死亡方式，在肿瘤发生中的作用尚不明确。之前的研究表明，二硫化物在癌症中起到促进复发作用[17]，线粒体中二硫键的聚合可以改变肿瘤的进展，激活细胞坏死性凋亡[18]。当二硫化钼（molybdenum disulfide，MoS2）与金属有机骨架结合时，可以形成针对肿瘤的多功能诊断治疗纳米平台[19]。Liu等[4]提出二硫化物在肿瘤细胞中的积累导致细胞解体和死亡，为肿瘤的治疗提供了新的方向。
目前对胃癌的分类方法主要是基于肿瘤细胞的病理特征，根据许多研究，基于不同特征的胃癌亚型也可以揭示临床相关性和预后价值[20]。本研究基于无监督聚类将患者分为两种双硫死亡亚型，试图为胃癌诊断和治疗的新特征模式提供理论依据。本研究发现，24个DRGs中有16个基因与预后有关。这可能是由于，当组织和细胞中的二硫键集聚时，肿瘤细胞的氧化还原系统被激活，进而使肿瘤细胞免于降解和死亡[21]，这揭示了双硫死亡是一种抗肿瘤细胞的关键方式。GO和KEGG分析也显示，DEGs 在多种肿瘤相关通路显著富集，这与甲状腺癌[22]、乳腺癌[23]和肝癌[24]的研究结果是一致的。
为了探索双硫死亡在胃癌中的作用，笔者从不同亚型的DEGs中筛选了14个关键基因构建了OS预测模型，并从内部和外部验证了其准确性，结果显示该模型能够较准确地预测患者的预后。随后，笔者探索了风险评分与免疫细胞浸润的关系，结果显示，大部分特异性免疫细胞比例与风险评分呈负相关，尤其是高风险评分时的CD8+T细胞浸润降低，往往预示着更差的预后[25]。
对于这14个DRGs相关的mRNAs，既往的研究[26]发现，FLNA能够通过抑制血管内皮生长因子的表达水平，进一步遏制肿瘤新血管的生成，最终抑制胃癌细胞的局部复发和远处转移；ALDH1B1是醛脱氢酶家族的成员，在促进结直肠癌和胰腺癌的进展中起到重要作用[27]；除此之外，有研究[28]表明，EIF4E依赖性ALDH1B1抑制能够增强铁死亡诱导剂在体外和体内的抗癌活性；IL-33可使巨噬细胞向肿瘤起始细胞发送旁分泌TGF-β信号，诱导侵入性和耐药性，并进一步上调IL-33表达[29]。TGFBR3、AHNAK2、THBS1和PDK4为甲状腺癌[30]、结直肠癌[31]、胰腺癌[32]或胃癌[33]诊断和预后的治疗靶点和潜在生物标志物，此外CHRNA3是肺癌中的显著致癌基因，但在胃癌中的作用尚不明确[34]；目前尚未发现PDE1A、OMD、DPT和PI16在癌症预后中作用的相关报道。
然而，本研究也存在一些局限性。首先，本研究所有数据均来自于公共数据库，缺乏基础实验验证；第二，本研究结果需要更多的独立队列和更大的样本量来验证模型的准确性；第三，本研究是对胃癌的回顾性研究，未涉及基因的功能和机制验证，这将是我们未来努力的方向。
总的来说，本研究在胃癌样本中定量构建了双硫死亡风险评分模型，该评分对肿瘤患者的预后评估具有一定的预测价值，是一种新的预后生物标志物。
重要声明
利益冲突声明：本文所有作者阅读并理解了《中国普外基础与临床杂志》的政策声明，我们没有相互竞争的利益。
作者贡献声明：蔡辉，指导研究；刘硕，分析数据及撰写初稿；朱丽慧，整理数据并修改手稿；廖天一和张翔，技术支持及图片制作。所有作者均审阅了此文稿并同意最终文稿。
