引用本文： 陈波, 唐康来, 张吉强, 郭宇鹏, 刘翔周, 施又兴. 抑制肌动蛋白聚合对体外大鼠跟腱来源肌腱干细胞成脂分化的影响研究. 中国修复重建外科杂志, 2015, 29(2): 206-212. doi: 10.7507/1002-1892.20150045 复制
肌腱病是目前最常见的运动损伤性疾病，主要临床表现为疼痛和炎性反应，晚期病变严重时可在病变肌腱内发现异位骨化和脂肪化组织形成[1]。由于肌腱自身再生能力较差，通过传统治疗再生的肌腱主要是由瘢痕组织构成，很难达到结构的完整性及满足生理活动所需强度[2]。随着研究者们从人和动物的肌腱组织中成功分离提取出肌腱干细胞（tendon stem cells，TSCs），并发现TSCs是肌腱组织工程良好的种子细胞之后[3-6]，TSCs特性逐渐成为当前研究热点。
近年来，有研究表明在过度牵伸载荷条件下TSCs会出现异常分化（成脂、成骨分化），加速肌腱病的发展，最终导致脂质蓄积、钙化形成等晚期肌腱病的主要病理表现[7-8]，但其发生机制尚不明确。我们前期实验发现，不同牵伸载荷可导致体外培养的肌腱来源细胞的聚合态纤维肌动蛋白（fibros actin,F-actin）发生断裂、解聚、重组，最终诱导肌腱来源细胞发生牵伸时间、强度和频率依赖性形态改变[9]。机械牵伸载荷是否通过影响细胞骨架和细胞形态改变，进而影响TSCs的分化方向，目前缺少相关研究报道。为此，本实验采用细胞松弛素D（cytochalasin D，CYD）抑制大鼠跟腱源性TSCs可溶球状肌动蛋白（globular actin,G-actin）聚合成F-actin，探讨细胞骨架对TSCs成脂分化的影响，以期为肌腱病发病机制研究及治疗提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
3周龄SD雄性大鼠2只，体重约50 g，由第三军医大学实验动物中心提供。H-DMEM培养基、胰蛋白酶（HyClone 公司，美国）；FBS（GIBCO公司，美国）；I型胶原酶、中性蛋白酶、CYD （Sigma公司，美国）；SD大鼠BMSCs成脂分化完全培养基（广州赛业生物科技有限公司）；罗丹明标记的鬼笔环肽（Biotium公司，美国）；RNAiso Plus试剂盒（TaKaRa公司，日本）；总蛋白提取试剂盒（上海贝博生物公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；抗actin抗体、抗脂肪酸结合蛋白（aP2）抗体、抗过氧化物酶体增殖物激活受体γ （per oxi some proliferator-activated receptor γ，PPARγ）抗体（Abcam公司，美国）。Quantity One软件（Bio-Rad公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；LSM510META型激光共聚焦显微镜（Zeiss公司，德国）。
1.2 TSCs分离、培养及鉴定
参照文献 [6, 10]方法进行TSCs的分离、培养和鉴定。无菌条件下取2只大鼠双侧跟腱，剔除腱鞘及腱周结缔组织，PBS清洗3次；将肌腱剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入2 mL消化液（含3 mg/ mLⅠ 型胶原酶和4 mg/mL中性蛋白酶），37℃孵箱消化1.5 h；加入含15%FBS的DMEM培养基2 mL中止消化，以离心半径10 cm、1 000 r/min离心5 min，弃上清。加入含15%FBS的DMEM培养基4 mL重悬细胞，移入25 cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育，每3天换液1次。细胞扩增传代，原代细胞记为P0代，取P3代细胞用于实验。经检测干细胞表面标志物CD90、CD44、Oct-4和诱导成骨、成软骨、成脂肪分化，鉴定培养细胞为TSCs。
1.3 CYD浓度筛选实验
取P3代TSCs，以1.5×103个/孔密度接种于24孔培养板，待细胞贴壁生长后，参考文献[11]方法分为5组，分别换用CYD终浓度为0（对照组）、50、100、500、1 000 ng/mL的含15%FBS的DMEM培养基500 μL继续培养，每3天换液1次。干预后1 h及3、7 d，倒置相差显微镜下观察细胞存活及形态变化，选择不影响TSCs存活的最大CYD浓度作为实验浓度，并进一步观察明确。
① F-actin染色：取选择的实验浓度组及对照组培养1 h及3、7 d的细胞制作细胞爬片，行F-actin染色，观察该浓度CYD对细胞骨架的影响效果。预冷PBS漂洗细胞爬片2次，4%多聚甲醛室温固定30 min；PBS漂洗3次，0.5%Triton X-100室温下处理细胞30 min；PBS漂洗2次，3%脱脂奶粉4℃冰箱封闭1 h；PBS漂洗2次，罗丹明标记的鬼笔环肽染色液室温避光孵育30 min；PBS快速漂洗2次，DAPI室温染核5 min；PBS快速漂洗3次，滴加抗荧光淬灭封片液封片，采用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架F-actin。② Wesrtern blot检测：参照文献[12]方法通过Western blot检测并计算F-actin/G-actin比值。取选择的实验浓度组培养3、7 d及对照组培养7 d的细胞，用冷裂解液1 （含10 mmol/L K2HPO4、100 mmol/L NaF、50 mmol/L KCl、2 mmol/ L MgCl2、1 mmol/L乙二醇双氨乙基醚四乙酸、0.2 mmol/L二硫苏糖醇、0.5%Triton X-100、1 mmol/L蔗糖，pH7.0）裂解，以离心半径8 cm、16 000 r/min离心30 min，G-actin在上清液中。沉淀的F-actin重新用等体积裂解液2（1.5 mmol/L盐酸胍、1 mmol/L乙酸钠，1 mmol/L CaCl2、1 mmol/L三磷酸腺苷、20 mmol/L Tris-HCl，pH7.5）冰浴1 h，将其转化为可溶的G-actin（每隔15 min温和震荡）；然后以离心半径8 cm、16 000 r/min离心30 min，已转化为G-actin的F-actin在上清液中。将两次裂解离心得到的上清液取等量上样，使用抗actin抗体检测，最后将条带灰度值用于比值计算。
1.4 CYD对TSCs成脂分化的影响
1.4.1 成脂诱导培养基培养
取P3代TSCs，以3×105个/孔密度接种于6孔培养板，依据筛选的CYD最适浓度，分别采用成脂诱导培养基（诱导组）、含CYD的成脂诱导培养基（CYD+诱导组）于37℃、5%CO2孵箱中培养细胞，每3天换液1次。培养3、7 d收集细胞，进行实时荧光定量PCR及Western blot检测。
1.4.2 普通培养基培养
取P3代TSCs，以1.5×105 个/孔密度接种于6孔培养板，依据筛选的CYD最适浓度，分别采用普通培养基（普通组）、含 CYD的普通培养基（CYD+普通组）培养。同上法培养3、7 d收集细胞，进行实时荧光定量PCR检 测。
1.4.3 观测指标
① 实时荧光定量PCR检测成脂分化相关特异标志性基因表达：使用RNAiso Plus试剂盒提取细胞总RNA，并转录为cDNA。各目的基因引物序列：PPARγ上游5'-CCTTTACCACGGTT-
GATTTCTC-3'，下游5'-GGCTCTACTTTGATCGCA-
CTTT-3'；脂蛋白酯酶（1ipoprotein lipase,LPL）上游
5'-CCCAGCAACATTATCCAGTG-3'，下游5'-CCTA-
AGAGGTGGACATTGTC-3'；aP2上游5'-CGAGAT-
TTCCTTCAAACTGGG-3'，下游5'-TCTTGTAGAA-
GTCACGCCTTTC-3'； GAPDH上游5'-TGACTTC-
AACAGCAACTC-3'，下游5'-TGTAGCCATATTCA-
TTGTCA-3'。循环条件：95℃预变性8 min；95℃变性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸25 s，40个循环。溶解曲线分析为：55～95℃，0.5℃/15 s。采用2-ΔΔCt法分析目的基因相对表达量，以GAPDH作为内参。实验重复3次。② Western blot检测：使用总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，10%SDS-PAGE凝胶电泳，聚偏氟乙烯膜转膜，5%脱脂奶粉封闭，稀释一抗（抗actin抗体、抗aP2抗体、抗PPARγ抗体）4℃孵育过夜；二抗室温孵育2 h，洗膜，用ECL试剂盒显影。应用Quantity One软件分析蛋白表达水平。实验重复3 次。
1.5 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 CYD对TSCs的适用浓度筛选
2.1.1 细胞形态观察
倒置相差显微镜观察示，与对照组比较，CYD各浓度组TSCs伸展度减小，形态逐渐变圆。CYD终浓度为50、100 ng/mL时，各时间点TSCs存活未受明显影响；终浓度为500、1 000 ng/ mL时，可见呈核固缩状态的死亡TSCs，且死亡细胞数量随着CYD终浓度、干预时间的增加而增加。见图 1。鉴于此，初步选择CYD终浓度为100 ng/mL进行后续实验。
图1
各组细胞存活状态及形态观察（倒置相差显微镜×100） 从左至右分别为对照组、50 ng/mL组、100 ng/mL组、500 ng/mL组、1 000 ng/mL组 ⓐ 培养1 h ⓑ 培养3 d ⓒ 培养7 d
Figure1.
The survival condition and morphology observation of cells in each group (Inverted phase contrast microscope×100) They were the control group,50 ng/mL group,100 ng/mL group,500 ng/mL group,and 1 000 ng/mL group from left to right respectively ⓐ Cultured for 1 hour ⓑ Cultured for 3 days ⓒ Cultured for 7 days
2.1.2 F-actin染色
激光共聚焦显微镜观察示，对照组TSCs较伸展，呈不规则多角形，荧光强，细胞骨架F-actin呈弥漫状橘红色荧光样物质，分布清晰，细胞质内肌动蛋白纤维丝方向相对规则。而100 ng/ mL组TSCs在干预1 h后即出现胞体伸展度减小，形态相对圆滑，细胞骨架F-actin排列紊乱、模糊、减少，呈颗粒状断裂；随着时间延长，F-actin受到的影响呈递增趋势。见图 2。
图2
100 ng/mL组及对照组F-actin染色观察（激光共聚焦显微镜×400） 从左至右分别为干预1 h、3 d、7 d ⓐ 对照组 ⓑ 100 ng/mL组
Figure2.
The F-actin staining observation of 100 ng/mL group and control group (Confocal laser scanning microscope×400) The intervention time was 1 hour,3 days,and 7 days from left to right respectively ⓐ Control group ⓑ 100 ng/mL group
2.1.3 Wesrtern
blot检测 对照组F-actin/G-actin比值为0.738±0.076，显著高于100 ng/mL组3、7 d的0.399±0.069、0.361±0.061，比较差异均有统计学意义（t=38.333，P=0.001；t=31.405，P=0.001）。100 ng/mL组3、7 d间F-actin/G-actin比值比较，差异亦有统计学意义（t=8.130，P=0.015）。
根据上述实验结果，提示CYD终浓度为100 ng/ mL时既可有效干扰TSCs细胞骨架F-actin的聚合，又不影响TSCs的存活，确定以该浓度用于进一步研究。
2.2 CYD对TSCs成脂分化的影响
2.2.1 成脂诱导培养基培养
实时荧光定量PCR检测示，3、7 d时CYD+诱导组PPARγ、LPL和aP2基因相对表达量显著高于诱导组，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。各基因相对表达量随CYD干预时间延长呈递增趋势，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图 3。
图3
实时荧光定量PCR检测CYD+诱导组和诱导组PPARγ、LPL、aP2基因表达 ⓐ PPARγ ⓑ LPL ⓒ aP2 图 4 Western blot检测CYD+诱导组和诱导组PPARγ、aP2蛋白表达 ⓐ 电泳图 1：诱导组 2：CYD+诱导组 ⓑ aP2蛋白表达水平 PPARγ蛋白表达水平 图 5 实时定量PCR检测CYD+普通组和普通组PPARγ、LPL、aP2基因表达 ⓐ PPARγ ⓑ LPL ⓒ aP2
Figure3.
The mRNA expressions of PPARγ,LPL,and aP2 in CYD+induction group and induction group by real-time quantitative PCR ⓐ PPARγ ⓑ LPL ⓒ aP2 Fig. 4 The protein expressions of PPARγ and aP2 in CYD+induction group and induction group by Western blot ⓐ Electrophoretogram 1: Induction group 2: CYD+induction group Protein expression of PPARγ ⓑ Protein expression of aP2 Fig. 5 The mRNA expressions of PPARγ,LPL,and aP2 in CYD+ordinary group and ordinary group by real-time quantitative PCR ⓐ PPARγ ⓑ LPL ⓒ aP2
Western blot检测示，3、7 d时CYD+诱导组PPARγ、aP2蛋白相对表达量显著高于诱导组，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；并且相对表达量随CYD干预时间的延长有递增趋势，比较差异亦有统计学意义（P＜0.05）。见图 4。
2.2.2 普通培养基培养
实时荧光定量PCR检测示，3、7 d时CYD+普通组PPARγ、LPL和aP2基因相对表达量显著高于普通组，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；且LPL、aP2基因的相对表达量随CYD干预时间的延长呈递增趋势，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；PPARγ基因相对表达量在CYD干预3 d和7 d时比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 5。
3 讨论
细胞骨架是维持细胞形态的关键结构，其动态变化在细胞黏附、迁移、凋亡、细胞周期、信号转导等生理过程中均有着重要作用[13-15]，主要由微管、微丝及中间纤维共同构成。其中，微丝是由F-actin聚合形成，与肌动蛋白结合蛋白交联以形成网络状结构[16]，作为一种应力纤维，在机械牵伸等力学刺激应答过程中起关键作用。有研究报道，在力学刺激信号由细胞外基质向细胞内转导过程中，通过形成一个“细胞外基质-整合素-细胞骨架-细胞核”的网架系统，细胞外的机械力信号可沿此“轨道”传导，进而使细胞对该力学刺激发生一系列后续反应[17-18]。除了感受力学刺激外，细胞骨架还能将力学信号转换为化学信号。当肌动蛋白纤维收缩时，细胞骨架相关蛋白也会受到牵伸，此时便会出现一些新的细胞骨架相关蛋白结合位点，进而使一些信号蛋白发生磷酸化而被激活[19]。随着对干细胞研究的深入，有学者发现细胞骨架在调控干细胞分化功能方面也起着重要作用[20]。有研究证实当聚集成团生长时，细胞多接近呈圆形，更容易向软骨细胞分化[21]；当MSCs形态被干预成圆形时，多向成脂肪分化；而当MSCs伸展开后，则更倾向于成骨分化[22]。
本研究探讨了细胞骨架在TSCs成脂分化过程中的作用。首先从大鼠跟腱中分离出TSCs，并通过观察细胞呈鹅卵石样聚集生长，检测干细胞表面标志物CD90、CD44、Oct-4以及成功诱导其成骨、成软骨、成脂肪分化，证实了所培养细胞为TSCs[10]。然后通过浓度筛选实验，在不影响TSCs存活状态的前提下，使用CYD干预TSCs培养，结果显示：100 ng/mL终浓度的CYD可有效干扰TSCs细胞骨架F-actin的聚合，并且随着干预时间延长，F-actin受到的影响呈递增趋势。随后在TSCs成脂诱导培养过程中，通过使用CYD干扰其细胞骨架F-actin的聚合发现：相对于单纯的TSCs成脂诱导培养，CYD干预可明显促进TSCs成脂诱导培养的诱导效率。表明细胞骨架的变化参与了TSCs成脂分化的调控，但是其在TSCs成脂分化过程中的作用究竟是协同增强成脂诱导培养基的诱导作用，还是可单独启动TSCs向成脂方向分化尚不清楚。为此，我们进一步在TSCs普通培养过程中使用CYD干扰其细胞骨架F-actin的聚合，发现在无诱导因素情况下，单纯CYD干预也可明显促进TSCs成脂分化。表明细胞骨架的变化是导致TSCs发生成脂分化的诱导启动因素。上述实验结果与CYD干预能促进MSCs成脂分化是一致的[23]，并且进一步深化了我们课题组前期研究发现：8%牵伸应变量对TSCs能产生过度牵伸效果，并且可使TSCs中RhoA/Rho相关蛋白激酶（Rho as soc iat ed protein kinases，ROCK）分子表达显著升高[24]，而RhoA/ROCK分子具有机械敏感性[25]，当受到外界应力时，RhoA/ROCK通过调节细胞骨架重塑，导致干细胞发生形状变化，使干细胞向不同方向分化[22]。
综上述，在TSCs成脂分化过程中，细胞骨架的变化起着非常重要的作用，它不是TSCs成脂分化的一个结果，而是导致TSCs成脂分化的早期细胞内改变之一。这表明机械牵伸载荷有可能是通过影响细胞骨架和细胞形态改变，进而影响TSCs的分化方向，为肌腱病发病机制研究及治疗提供了新思路。但本研究目前只研究了细胞骨架对TSCs成脂分化的调控作用，对于细胞骨架在TSCs向其他方向分化时的影响以及细胞骨架上下游的调控信号分子尚需进一步研究。
肌腱病是目前最常见的运动损伤性疾病，主要临床表现为疼痛和炎性反应，晚期病变严重时可在病变肌腱内发现异位骨化和脂肪化组织形成[1]。由于肌腱自身再生能力较差，通过传统治疗再生的肌腱主要是由瘢痕组织构成，很难达到结构的完整性及满足生理活动所需强度[2]。随着研究者们从人和动物的肌腱组织中成功分离提取出肌腱干细胞（tendon stem cells，TSCs），并发现TSCs是肌腱组织工程良好的种子细胞之后[3-6]，TSCs特性逐渐成为当前研究热点。
近年来，有研究表明在过度牵伸载荷条件下TSCs会出现异常分化（成脂、成骨分化），加速肌腱病的发展，最终导致脂质蓄积、钙化形成等晚期肌腱病的主要病理表现[7-8]，但其发生机制尚不明确。我们前期实验发现，不同牵伸载荷可导致体外培养的肌腱来源细胞的聚合态纤维肌动蛋白（fibros actin,F-actin）发生断裂、解聚、重组，最终诱导肌腱来源细胞发生牵伸时间、强度和频率依赖性形态改变[9]。机械牵伸载荷是否通过影响细胞骨架和细胞形态改变，进而影响TSCs的分化方向，目前缺少相关研究报道。为此，本实验采用细胞松弛素D（cytochalasin D，CYD）抑制大鼠跟腱源性TSCs可溶球状肌动蛋白（globular actin,G-actin）聚合成F-actin，探讨细胞骨架对TSCs成脂分化的影响，以期为肌腱病发病机制研究及治疗提供新思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
3周龄SD雄性大鼠2只，体重约50 g，由第三军医大学实验动物中心提供。H-DMEM培养基、胰蛋白酶（HyClone 公司，美国）；FBS（GIBCO公司，美国）；I型胶原酶、中性蛋白酶、CYD （Sigma公司，美国）；SD大鼠BMSCs成脂分化完全培养基（广州赛业生物科技有限公司）；罗丹明标记的鬼笔环肽（Biotium公司，美国）；RNAiso Plus试剂盒（TaKaRa公司，日本）；总蛋白提取试剂盒（上海贝博生物公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；抗actin抗体、抗脂肪酸结合蛋白（aP2）抗体、抗过氧化物酶体增殖物激活受体γ （per oxi some proliferator-activated receptor γ，PPARγ）抗体（Abcam公司，美国）。Quantity One软件（Bio-Rad公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；LSM510META型激光共聚焦显微镜（Zeiss公司，德国）。
1.2 TSCs分离、培养及鉴定
参照文献 [6, 10]方法进行TSCs的分离、培养和鉴定。无菌条件下取2只大鼠双侧跟腱，剔除腱鞘及腱周结缔组织，PBS清洗3次；将肌腱剪碎成1 mm×1 mm×1 mm大小，加入2 mL消化液（含3 mg/ mLⅠ 型胶原酶和4 mg/mL中性蛋白酶），37℃孵箱消化1.5 h；加入含15%FBS的DMEM培养基2 mL中止消化，以离心半径10 cm、1 000 r/min离心5 min，弃上清。加入含15%FBS的DMEM培养基4 mL重悬细胞，移入25 cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中孵育，每3天换液1次。细胞扩增传代，原代细胞记为P0代，取P3代细胞用于实验。经检测干细胞表面标志物CD90、CD44、Oct-4和诱导成骨、成软骨、成脂肪分化，鉴定培养细胞为TSCs。
1.3 CYD浓度筛选实验
取P3代TSCs，以1.5×103个/孔密度接种于24孔培养板，待细胞贴壁生长后，参考文献[11]方法分为5组，分别换用CYD终浓度为0（对照组）、50、100、500、1 000 ng/mL的含15%FBS的DMEM培养基500 μL继续培养，每3天换液1次。干预后1 h及3、7 d，倒置相差显微镜下观察细胞存活及形态变化，选择不影响TSCs存活的最大CYD浓度作为实验浓度，并进一步观察明确。
① F-actin染色：取选择的实验浓度组及对照组培养1 h及3、7 d的细胞制作细胞爬片，行F-actin染色，观察该浓度CYD对细胞骨架的影响效果。预冷PBS漂洗细胞爬片2次，4%多聚甲醛室温固定30 min；PBS漂洗3次，0.5%Triton X-100室温下处理细胞30 min；PBS漂洗2次，3%脱脂奶粉4℃冰箱封闭1 h；PBS漂洗2次，罗丹明标记的鬼笔环肽染色液室温避光孵育30 min；PBS快速漂洗2次，DAPI室温染核5 min；PBS快速漂洗3次，滴加抗荧光淬灭封片液封片，采用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架F-actin。② Wesrtern blot检测：参照文献[12]方法通过Western blot检测并计算F-actin/G-actin比值。取选择的实验浓度组培养3、7 d及对照组培养7 d的细胞，用冷裂解液1 （含10 mmol/L K2HPO4、100 mmol/L NaF、50 mmol/L KCl、2 mmol/ L MgCl2、1 mmol/L乙二醇双氨乙基醚四乙酸、0.2 mmol/L二硫苏糖醇、0.5%Triton X-100、1 mmol/L蔗糖，pH7.0）裂解，以离心半径8 cm、16 000 r/min离心30 min，G-actin在上清液中。沉淀的F-actin重新用等体积裂解液2（1.5 mmol/L盐酸胍、1 mmol/L乙酸钠，1 mmol/L CaCl2、1 mmol/L三磷酸腺苷、20 mmol/L Tris-HCl，pH7.5）冰浴1 h，将其转化为可溶的G-actin（每隔15 min温和震荡）；然后以离心半径8 cm、16 000 r/min离心30 min，已转化为G-actin的F-actin在上清液中。将两次裂解离心得到的上清液取等量上样，使用抗actin抗体检测，最后将条带灰度值用于比值计算。
1.4 CYD对TSCs成脂分化的影响
1.4.1 成脂诱导培养基培养
取P3代TSCs，以3×105个/孔密度接种于6孔培养板，依据筛选的CYD最适浓度，分别采用成脂诱导培养基（诱导组）、含CYD的成脂诱导培养基（CYD+诱导组）于37℃、5%CO2孵箱中培养细胞，每3天换液1次。培养3、7 d收集细胞，进行实时荧光定量PCR及Western blot检测。
1.4.2 普通培养基培养
取P3代TSCs，以1.5×105 个/孔密度接种于6孔培养板，依据筛选的CYD最适浓度，分别采用普通培养基（普通组）、含 CYD的普通培养基（CYD+普通组）培养。同上法培养3、7 d收集细胞，进行实时荧光定量PCR检 测。
1.4.3 观测指标
① 实时荧光定量PCR检测成脂分化相关特异标志性基因表达：使用RNAiso Plus试剂盒提取细胞总RNA，并转录为cDNA。各目的基因引物序列：PPARγ上游5'-CCTTTACCACGGTT-
GATTTCTC-3'，下游5'-GGCTCTACTTTGATCGCA-
CTTT-3'；脂蛋白酯酶（1ipoprotein lipase,LPL）上游
5'-CCCAGCAACATTATCCAGTG-3'，下游5'-CCTA-
AGAGGTGGACATTGTC-3'；aP2上游5'-CGAGAT-
TTCCTTCAAACTGGG-3'，下游5'-TCTTGTAGAA-
GTCACGCCTTTC-3'； GAPDH上游5'-TGACTTC-
AACAGCAACTC-3'，下游5'-TGTAGCCATATTCA-
TTGTCA-3'。循环条件：95℃预变性8 min；95℃变性10 s、60℃退火20 s、72℃延伸25 s，40个循环。溶解曲线分析为：55～95℃，0.5℃/15 s。采用2-ΔΔCt法分析目的基因相对表达量，以GAPDH作为内参。实验重复3次。② Western blot检测：使用总蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，10%SDS-PAGE凝胶电泳，聚偏氟乙烯膜转膜，5%脱脂奶粉封闭，稀释一抗（抗actin抗体、抗aP2抗体、抗PPARγ抗体）4℃孵育过夜；二抗室温孵育2 h，洗膜，用ECL试剂盒显影。应用Quantity One软件分析蛋白表达水平。实验重复3 次。
1.5 统计学方法
采用SPSS13.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验；检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 CYD对TSCs的适用浓度筛选
2.1.1 细胞形态观察
倒置相差显微镜观察示，与对照组比较，CYD各浓度组TSCs伸展度减小，形态逐渐变圆。CYD终浓度为50、100 ng/mL时，各时间点TSCs存活未受明显影响；终浓度为500、1 000 ng/ mL时，可见呈核固缩状态的死亡TSCs，且死亡细胞数量随着CYD终浓度、干预时间的增加而增加。见图 1。鉴于此，初步选择CYD终浓度为100 ng/mL进行后续实验。
图1
各组细胞存活状态及形态观察（倒置相差显微镜×100） 从左至右分别为对照组、50 ng/mL组、100 ng/mL组、500 ng/mL组、1 000 ng/mL组 ⓐ 培养1 h ⓑ 培养3 d ⓒ 培养7 d
Figure1.
The survival condition and morphology observation of cells in each group (Inverted phase contrast microscope×100) They were the control group,50 ng/mL group,100 ng/mL group,500 ng/mL group,and 1 000 ng/mL group from left to right respectively ⓐ Cultured for 1 hour ⓑ Cultured for 3 days ⓒ Cultured for 7 days
2.1.2 F-actin染色
激光共聚焦显微镜观察示，对照组TSCs较伸展，呈不规则多角形，荧光强，细胞骨架F-actin呈弥漫状橘红色荧光样物质，分布清晰，细胞质内肌动蛋白纤维丝方向相对规则。而100 ng/ mL组TSCs在干预1 h后即出现胞体伸展度减小，形态相对圆滑，细胞骨架F-actin排列紊乱、模糊、减少，呈颗粒状断裂；随着时间延长，F-actin受到的影响呈递增趋势。见图 2。
图2
100 ng/mL组及对照组F-actin染色观察（激光共聚焦显微镜×400） 从左至右分别为干预1 h、3 d、7 d ⓐ 对照组 ⓑ 100 ng/mL组
Figure2.
The F-actin staining observation of 100 ng/mL group and control group (Confocal laser scanning microscope×400) The intervention time was 1 hour,3 days,and 7 days from left to right respectively ⓐ Control group ⓑ 100 ng/mL group
2.1.3 Wesrtern
blot检测 对照组F-actin/G-actin比值为0.738±0.076，显著高于100 ng/mL组3、7 d的0.399±0.069、0.361±0.061，比较差异均有统计学意义（t=38.333，P=0.001；t=31.405，P=0.001）。100 ng/mL组3、7 d间F-actin/G-actin比值比较，差异亦有统计学意义（t=8.130，P=0.015）。
根据上述实验结果，提示CYD终浓度为100 ng/ mL时既可有效干扰TSCs细胞骨架F-actin的聚合，又不影响TSCs的存活，确定以该浓度用于进一步研究。
2.2 CYD对TSCs成脂分化的影响
2.2.1 成脂诱导培养基培养
实时荧光定量PCR检测示，3、7 d时CYD+诱导组PPARγ、LPL和aP2基因相对表达量显著高于诱导组，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。各基因相对表达量随CYD干预时间延长呈递增趋势，比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图 3。
图3
实时荧光定量PCR检测CYD+诱导组和诱导组PPARγ、LPL、aP2基因表达 ⓐ PPARγ ⓑ LPL ⓒ aP2 图 4 Western blot检测CYD+诱导组和诱导组PPARγ、aP2蛋白表达 ⓐ 电泳图 1：诱导组 2：CYD+诱导组 ⓑ aP2蛋白表达水平 PPARγ蛋白表达水平 图 5 实时定量PCR检测CYD+普通组和普通组PPARγ、LPL、aP2基因表达 ⓐ PPARγ ⓑ LPL ⓒ aP2
Figure3.
The mRNA expressions of PPARγ,LPL,and aP2 in CYD+induction group and induction group by real-time quantitative PCR ⓐ PPARγ ⓑ LPL ⓒ aP2 Fig. 4 The protein expressions of PPARγ and aP2 in CYD+induction group and induction group by Western blot ⓐ Electrophoretogram 1: Induction group 2: CYD+induction group Protein expression of PPARγ ⓑ Protein expression of aP2 Fig. 5 The mRNA expressions of PPARγ,LPL,and aP2 in CYD+ordinary group and ordinary group by real-time quantitative PCR ⓐ PPARγ ⓑ LPL ⓒ aP2
Western blot检测示，3、7 d时CYD+诱导组PPARγ、aP2蛋白相对表达量显著高于诱导组，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；并且相对表达量随CYD干预时间的延长有递增趋势，比较差异亦有统计学意义（P＜0.05）。见图 4。
2.2.2 普通培养基培养
实时荧光定量PCR检测示，3、7 d时CYD+普通组PPARγ、LPL和aP2基因相对表达量显著高于普通组，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；且LPL、aP2基因的相对表达量随CYD干预时间的延长呈递增趋势，比较差异有统计学意义（P＜0.05）；PPARγ基因相对表达量在CYD干预3 d和7 d时比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 5。
3 讨论
细胞骨架是维持细胞形态的关键结构，其动态变化在细胞黏附、迁移、凋亡、细胞周期、信号转导等生理过程中均有着重要作用[13-15]，主要由微管、微丝及中间纤维共同构成。其中，微丝是由F-actin聚合形成，与肌动蛋白结合蛋白交联以形成网络状结构[16]，作为一种应力纤维，在机械牵伸等力学刺激应答过程中起关键作用。有研究报道，在力学刺激信号由细胞外基质向细胞内转导过程中，通过形成一个“细胞外基质-整合素-细胞骨架-细胞核”的网架系统，细胞外的机械力信号可沿此“轨道”传导，进而使细胞对该力学刺激发生一系列后续反应[17-18]。除了感受力学刺激外，细胞骨架还能将力学信号转换为化学信号。当肌动蛋白纤维收缩时，细胞骨架相关蛋白也会受到牵伸，此时便会出现一些新的细胞骨架相关蛋白结合位点，进而使一些信号蛋白发生磷酸化而被激活[19]。随着对干细胞研究的深入，有学者发现细胞骨架在调控干细胞分化功能方面也起着重要作用[20]。有研究证实当聚集成团生长时，细胞多接近呈圆形，更容易向软骨细胞分化[21]；当MSCs形态被干预成圆形时，多向成脂肪分化；而当MSCs伸展开后，则更倾向于成骨分化[22]。
本研究探讨了细胞骨架在TSCs成脂分化过程中的作用。首先从大鼠跟腱中分离出TSCs，并通过观察细胞呈鹅卵石样聚集生长，检测干细胞表面标志物CD90、CD44、Oct-4以及成功诱导其成骨、成软骨、成脂肪分化，证实了所培养细胞为TSCs[10]。然后通过浓度筛选实验，在不影响TSCs存活状态的前提下，使用CYD干预TSCs培养，结果显示：100 ng/mL终浓度的CYD可有效干扰TSCs细胞骨架F-actin的聚合，并且随着干预时间延长，F-actin受到的影响呈递增趋势。随后在TSCs成脂诱导培养过程中，通过使用CYD干扰其细胞骨架F-actin的聚合发现：相对于单纯的TSCs成脂诱导培养，CYD干预可明显促进TSCs成脂诱导培养的诱导效率。表明细胞骨架的变化参与了TSCs成脂分化的调控，但是其在TSCs成脂分化过程中的作用究竟是协同增强成脂诱导培养基的诱导作用，还是可单独启动TSCs向成脂方向分化尚不清楚。为此，我们进一步在TSCs普通培养过程中使用CYD干扰其细胞骨架F-actin的聚合，发现在无诱导因素情况下，单纯CYD干预也可明显促进TSCs成脂分化。表明细胞骨架的变化是导致TSCs发生成脂分化的诱导启动因素。上述实验结果与CYD干预能促进MSCs成脂分化是一致的[23]，并且进一步深化了我们课题组前期研究发现：8%牵伸应变量对TSCs能产生过度牵伸效果，并且可使TSCs中RhoA/Rho相关蛋白激酶（Rho as soc iat ed protein kinases，ROCK）分子表达显著升高[24]，而RhoA/ROCK分子具有机械敏感性[25]，当受到外界应力时，RhoA/ROCK通过调节细胞骨架重塑，导致干细胞发生形状变化，使干细胞向不同方向分化[22]。
综上述，在TSCs成脂分化过程中，细胞骨架的变化起着非常重要的作用，它不是TSCs成脂分化的一个结果，而是导致TSCs成脂分化的早期细胞内改变之一。这表明机械牵伸载荷有可能是通过影响细胞骨架和细胞形态改变，进而影响TSCs的分化方向，为肌腱病发病机制研究及治疗提供了新思路。但本研究目前只研究了细胞骨架对TSCs成脂分化的调控作用，对于细胞骨架在TSCs向其他方向分化时的影响以及细胞骨架上下游的调控信号分子尚需进一步研究。
