引用本文： 吴登辉, 于津澜, 张蛟, 杨丽珍, 孙玉华, 张跃辉. 多囊卵巢综合征中环状 RNA 差异表达的生物信息学分析. 华西医学, 2022, 37(2): 231-236. doi: 10.7507/1002-0179.202012054 复制
多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）患病率为 5%～10%，是育龄期妇女最常见的内分泌紊乱疾病之一[1]。其通常表现为肥胖、多毛、稀发排卵或无排卵和卵巢多囊样改变，常与胰岛素抵抗、血脂异常和肥胖症并存，并具有发展心血管疾病、代谢后遗症（例如糖尿病和代谢综合征）的重大风险[2]。尽管该病在临床上非常多见，但其病因和病理生理学过程仍不明确，不断有证据表明，PCOS 可能是一种复杂的多基因疾病，与强表观遗传和环境影响相关[3]。因此，探究该疾病早期的生物学标志物，对改善和治疗 PCOS 具有重要的临床意义。环状 RNA（circular RNA，circRNA）是一类闭合环状的 RNA 分子，主要由真核生物信使 RNA 的前体通过可变剪切加工产生，在古细菌和动植物等多种物种中被发现[4]。circRNA 不具有 5’ 端帽子和 3’ 末端 poly（A）尾巴结构，这一结构上的独特性使其不易被核酸外切酶和分支酶降解[5]，因而有高稳定性、物种间高度保守和组织特异性的特点[6]。目前国内外学者已经发现 circRNA 在肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等多种疾病中均存在差异表达[7]，并有多项研究表明 circRNA 可能在 PCOS 的进程中起着重要作用[8-9]。本研究旨在通过对基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database，GEO）中的 PCOS 卵丘细胞基因芯片进行生物信息学分析，筛选出差异 circRNA，并预测这些差异 circRNA 的潜在调控 miRNA，为帮助阐明 PCOS 的发病机制和治疗药物的研发提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 数据收集
从美国国立生物技术信息中心的 GEO 数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下载基因表达芯片 GSE145296，其所处平台为 GPL28148 Agilent-084217 CapitalBio Technology Human CircRNA Array v2。该芯片包含 6 例 PCOS 患者和 6 例健康个体，本研究将对该芯片中健康个体和 PCOS 患者的卵丘细胞中的 circRNA 进行分析。
1.2 差异 circRNA 的数据分析
本研究选用基因表达芯片 GSE145296，用 GEO2R 在线分析软件进行差异 circRNA 的筛选。GEO2R 是 GEO 数据库自带的在线分析工具，基于此工具可以对部分 GEO 样品数据进行基因差异表达分析。该工具主要针对芯片数据，使用的是基于 R 编程语言的开源软件项目 Bioconductor 项目中的 GEOquery 和 limma R 包，能够对原始提交者提供的处理后的数据表进行比较。将原始数据进行分析，以 P<0.05 和 |logFC|≥1.2 作为筛选条件。
1.3 基因富集分析
把筛选的差异 circRNA 的基因导入 DAVID 数据库（Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery）进行在线分析，选用“Homo sapiens”，对上调或下调的差异 circRNA 进行基因本体（Gene Ontology，GO）分析及京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路分析，得到生物功能富集数据，DAVID 数据库版本为 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）。GO 是基因分析的常用方法，可以对基因进行注释和分类。GO 注释主要分为分子生物学过程、细胞学组分和生物学功能 3 个部分。KEGG 通路也是常见的基因功能富集分析方法。GO 和 KEGG 各项均以 P<0.05 为筛选条件。
1.4 circRNA-miRNA 基因网络图构建
分别选取表达上调和下调的 circRNA 中 |logFC| 排序前 5 位的 circRNA，定义为差异表达最显著的 circRNA，通过位点预测网站 Circular RNA interactome（https://circinteractome.nia.nih.gov/）对这些 circRNA 潜在调控的 miRNA 进行预测，将数据整理后导入 Cytoscape 工具，绘制出 circRNA-miRNA 基因网络图，再利用 cytohubba 插件，找出前 10 个能够与不同差异 circRNA 共同结合的 miRNA。
2 结果
2.1 差异 circRNA 的提取
经 GEO2R 初步分析获得 175875 个差异 circRNA，随后经 P<0.05、|logFC|≥1.2 条件筛选，共鉴定出 247 个差异 circRNA，其中包括了 157 个上调基因和 90 个下调基因，上调和下调差异表达倍数前 5 个基因见表1。
表1
差异表达变化最大的基因
2.2 差异 circRNA 的 GO 富集分析和 KEGG 信号通路分析
在生物学过程中，差异 circRNA 主要富集在有丝分裂核分裂、有丝分裂纺锤体装配检查点、细胞分裂、有丝分裂细胞质分裂和细胞增殖上（图1a）；在细胞定位中，差异 circRNA 主要富集在纺锤体、细胞膜、细胞质、细胞微管和纺锤极体上（图1b）；从分子功能上看，差异 circRNA 主要集中在蛋白结合、微管马达活动、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）结合、Rho 鸟苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）酶蛋白结合和蛋白激酶 A 结合上（图1c）。KEGG 信号通路分析结果显示，差异 circRNA 主要富集于叉头框蛋白 O（forkhead box O，FoxO）信号通路、p53 信号通路、黄体酮介导卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂和细胞周期等信号通路过程（图1d）。
图1
差异 circRNA 的 GO 富集分析和 KEGG 信号通路分析
a. 生物学过程；b. 细胞定位；c. 分子功能；d. KEGG 富集通路。图中左侧文字后括号内数字表示基因数量
2.3 circRNA-miRNA 基因网络图建
通过 Circular RNA interactome 预测到差异表达最显著的 circRNA 潜在调控的 miRNA 共 402 个，其中与目标上调基因结合的 miRNA 共 277 个，与目标下调基因结合的 miRNA 共 125 个，利用 Cytoscape 工具构建出 circRNA-miRNA 基因网络图（图2），通过 cytohubba 功能找到前 10 个与多个差异 circRNA 结合的 miRNA，分别为 hsa-miR-557、hsa-miR-507、hsa-miR-224、hsa-miR-136、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-579、hsa-miR-502-5p、hsa-miR-186、hsa-miR-1253、hsa-miR-432。
图2
circRNA-miRNA 网络图
红色三角形表示上调基因，绿色三角箭头代表下调基因，蓝色椭圆表示与之相结合的 miRNA
3 讨论
自 1976 年 Sanger 等[10]在 RNA 病毒中发现 circRNA 至今已经 30 多年，随着科学技术水平的发展和检测手段的不断提高，circRNA 在动植物及人体中的作用被不断探索。诸多研究者发现多种 circRNA 在不同的细胞类型和发育阶段中存在特异性表达，这提示 circRNA 很有可能具有重要的基因调控功能[11]。尽管既往研究已发现了很多与 PCOS 发生发展相关的因素，但是当前 PCOS 的发病机制仍不明确[12]。目前许多研究证实了非编码 RNA 在 PCOS 的发生发展过程中具有重要的调控作用，如 Jiao 等[13]发现健康妇女和 PCOS 患者之间、成熟和不成熟的卵泡液中的长非编码 RNA 和信使 RNA 谱存在显著差异；Li 等[14]研究表明，PCOS 颗粒细胞中牛磺酸正调节 1 蛋白表达的增加可能有助于过度的卵泡活化和生长，并可能破坏优势卵泡的选择；Wang 等[15]发现Ⅱ类主要组织相容性复合体 DRα 和白细胞介素-10 可能通过金黄色葡萄球菌感染富集的吞噬体促进 PCOS 进程，而 miR-486-5p 可能通过靶向 PRELID2 基因参与 PCOS 的卵泡发育，miR-4651 可能通过调节其靶基因而通过白细胞跨内皮迁移参与炎症。circRNA 作为非编码 RNA 的组成部分，其在 PCOS 中也发挥了重要作用。Liu 等[16]通过实验证明 circ-PSMC3 可通过海绵化 miR-296-3p 调节 PTEN 表达来缓解 PCOS 症状；Wang 等[17]通过高通量测序进行表达谱分析，获得了值得进一步研究的新 circRNA、miRNA 和基因靶标，为 PCOS 发病机制的研究提供了有价值的补充。
本研究通过 GEO 数据库分析了一个 PCOS 的 circRNA 芯片表达谱 GSE145276，通过 GEO2R 分析并发现了 247 个差异表达 circRNA，包括 157 个上调 circRNA 和 90 个下调 circRNA。因为 circRNA 较其他线性 RNA 分子更稳定，因此这些 circRNA 可以为 PCOS 的诊断与治疗提供重要的分子标志物。GO 富集分析结果发现，差异 circRNA 主要富集在细胞分裂、细胞增殖以及纺锤体检查点，功能主要集中在蛋白质结合和核酸结合上。KEGG 信号通路分析结果显示差异 circRNA 主要富集于 FoxO 信号通路、p53 信号通路、黄体酮介导卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂和细胞周期等信号通路过程。PCOS 主要表现有卵巢多囊样改变、稀疏排卵或无排卵，已有相关研究表明这主要与卵母细胞的功能有关[18]，卵母细胞分泌的因子控制早期窦状卵泡发育，在整个卵泡形成过程中，由各种蛋白质、类固醇、能量代谢物、细胞因子和生长因子建立的不断变化的卵泡内微环境适当协调卵泡生长和卵母细胞发育，差异 circRNA 作用于细胞生长发育和增殖过程，这有助于解释 PCOS 的发病机制。p53 信号通路一般被认为与肿瘤密切相关，但也有研究者发现，p53 基因的一个变异与代谢密切相关，这可能会导致肥胖和 2 型糖尿病的发展，甚至与心脏病相关[19]。FoxO 信号通路参与许多细胞生理事件，例如细胞凋亡、细胞周期控制、葡萄糖代谢、抗氧化应激和长寿，当受到生长因子或胰岛素的刺激时，FoxO 被磷酸化并失去活性，磷酸化的 FoxO 改变其构象，然后与 14-3-3 蛋白结合，介导 FoxO 从细胞核到细胞质的输出，并减少 FoxO 靶基因的表达[20]。
circRNA 是一种竞争性的内源性 RNA，其含有共同的 miRNA 应答元件，它的一个重要作用机制是发挥 miRNA 海绵功能，能够与 miRNA 靶向结合，间接调节 mRNA 的翻译，调控基因表达，影响疾病的发生发展。miRNA 的有效性受其 miRNA 应答元件细胞浓度的影响，因此，miRNA 的活性与 circRNA 的存在与否密切相关[21]。circRNA 竞争性结合到 miRNA 而导致 miRNA 分子减少，从而使其对 miRNA 靶基因的抑制作用减弱，致使 miRNA 靶基因的表达上调[22]。本研究通过在线软件分析预测到，与差异最显著的 10 个 circRNA 结合的 miRNA 有 402 个，并发现存在一个 miRNA 与多个 circRNA 有结合位点的情况，通过 Cytoscape 找出了前 10 个这样的 miRNA，即 hsa-miR-557、hsa-miR-507、hsa-miR-224、hsa-miR-136、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-579、hsa-miR-502-5p、hsa-miR-186、hsa-miR-1253、hsa-miR-432。有研究表明，在 PCOS 患者的颗粒细胞（包括卵巢颗粒细胞和卵巢颗粒肿瘤细胞）中，hsa_circ_0118530 大大升高，将 hsa_circ_0118530 siRNA 转染到卵巢颗粒细胞中，能够诱导细胞凋亡，抑制细胞迁移，而 miR-136 的抑制作用明显逆转了 hsa_circ_0118530 对颗粒细胞进程、氧化应激和炎症释放的功能，miR-136 被预测并确认为 hsa_circ_0118530 的靶标，敲除 hsa_circ_0118530 被认为可以抑制海绵状 miR-136 的 PCOS 进程[23]。Ma 等[24]通过实验验证了 hsa_circ_0043533 和 hsa_circ_0097636 在 PCOS 组和对照组中表达差异显著，在患者卵丘颗粒细胞中分别显著上调和下调；相关性分析提示，二者的表达与患者睾酮水平呈现正相关，它们在 PCOS 的发生发展中发挥了重要作用。Song 等[25]发现颗粒细胞中 hsa-miR-186 的水平与 PCOS 患者的血清雌二醇水平呈正相关。此外，雌二醇治疗直接增加了卵巢颗粒细胞和主要颗粒细胞中 hsa-miR-186 的水平，这为了解 PCOS 的病理生理学提供了新的见识。另外还有多种 miRNA 虽然未在 PCOS 中有相关研究报道，但在妇科肿瘤疾病中研究却有所涉及，例如 hsa-miR-127-5p 被认为可能参与了子宫内膜腺癌的病程[26]，hsa-miR-579 对卵巢癌的发展有所影响[27]。
综上，通过本研究及相关文献资料的检索不难发现，circRNA 通过多种方式参与到 PCOS 的发生发展过程，hsa_circ_0118530、hsa_circ_0043533 和 hsa_circ_0097636 作为差异表达基因在 PCOS 中发挥的作用值得进一步挖掘。通过预测 circRNA 潜在调控的 miRNA，能够更清晰地对 circRNA 在 PCOS 中的作用进行相关分析，增加对 PCOS 病理生理过程的进一步了解。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）患病率为 5%～10%，是育龄期妇女最常见的内分泌紊乱疾病之一[1]。其通常表现为肥胖、多毛、稀发排卵或无排卵和卵巢多囊样改变，常与胰岛素抵抗、血脂异常和肥胖症并存，并具有发展心血管疾病、代谢后遗症（例如糖尿病和代谢综合征）的重大风险[2]。尽管该病在临床上非常多见，但其病因和病理生理学过程仍不明确，不断有证据表明，PCOS 可能是一种复杂的多基因疾病，与强表观遗传和环境影响相关[3]。因此，探究该疾病早期的生物学标志物，对改善和治疗 PCOS 具有重要的临床意义。环状 RNA（circular RNA，circRNA）是一类闭合环状的 RNA 分子，主要由真核生物信使 RNA 的前体通过可变剪切加工产生，在古细菌和动植物等多种物种中被发现[4]。circRNA 不具有 5’ 端帽子和 3’ 末端 poly（A）尾巴结构，这一结构上的独特性使其不易被核酸外切酶和分支酶降解[5]，因而有高稳定性、物种间高度保守和组织特异性的特点[6]。目前国内外学者已经发现 circRNA 在肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病等多种疾病中均存在差异表达[7]，并有多项研究表明 circRNA 可能在 PCOS 的进程中起着重要作用[8-9]。本研究旨在通过对基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database，GEO）中的 PCOS 卵丘细胞基因芯片进行生物信息学分析，筛选出差异 circRNA，并预测这些差异 circRNA 的潜在调控 miRNA，为帮助阐明 PCOS 的发病机制和治疗药物的研发提供理论依据。
1 资料与方法
1.1 数据收集
从美国国立生物技术信息中心的 GEO 数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下载基因表达芯片 GSE145296，其所处平台为 GPL28148 Agilent-084217 CapitalBio Technology Human CircRNA Array v2。该芯片包含 6 例 PCOS 患者和 6 例健康个体，本研究将对该芯片中健康个体和 PCOS 患者的卵丘细胞中的 circRNA 进行分析。
1.2 差异 circRNA 的数据分析
本研究选用基因表达芯片 GSE145296，用 GEO2R 在线分析软件进行差异 circRNA 的筛选。GEO2R 是 GEO 数据库自带的在线分析工具，基于此工具可以对部分 GEO 样品数据进行基因差异表达分析。该工具主要针对芯片数据，使用的是基于 R 编程语言的开源软件项目 Bioconductor 项目中的 GEOquery 和 limma R 包，能够对原始提交者提供的处理后的数据表进行比较。将原始数据进行分析，以 P<0.05 和 |logFC|≥1.2 作为筛选条件。
1.3 基因富集分析
把筛选的差异 circRNA 的基因导入 DAVID 数据库（Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery）进行在线分析，选用“Homo sapiens”，对上调或下调的差异 circRNA 进行基因本体（Gene Ontology，GO）分析及京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路分析，得到生物功能富集数据，DAVID 数据库版本为 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）。GO 是基因分析的常用方法，可以对基因进行注释和分类。GO 注释主要分为分子生物学过程、细胞学组分和生物学功能 3 个部分。KEGG 通路也是常见的基因功能富集分析方法。GO 和 KEGG 各项均以 P<0.05 为筛选条件。
1.4 circRNA-miRNA 基因网络图构建
分别选取表达上调和下调的 circRNA 中 |logFC| 排序前 5 位的 circRNA，定义为差异表达最显著的 circRNA，通过位点预测网站 Circular RNA interactome（https://circinteractome.nia.nih.gov/）对这些 circRNA 潜在调控的 miRNA 进行预测，将数据整理后导入 Cytoscape 工具，绘制出 circRNA-miRNA 基因网络图，再利用 cytohubba 插件，找出前 10 个能够与不同差异 circRNA 共同结合的 miRNA。
2 结果
2.1 差异 circRNA 的提取
经 GEO2R 初步分析获得 175875 个差异 circRNA，随后经 P<0.05、|logFC|≥1.2 条件筛选，共鉴定出 247 个差异 circRNA，其中包括了 157 个上调基因和 90 个下调基因，上调和下调差异表达倍数前 5 个基因见表1。
表1
差异表达变化最大的基因
2.2 差异 circRNA 的 GO 富集分析和 KEGG 信号通路分析
在生物学过程中，差异 circRNA 主要富集在有丝分裂核分裂、有丝分裂纺锤体装配检查点、细胞分裂、有丝分裂细胞质分裂和细胞增殖上（图1a）；在细胞定位中，差异 circRNA 主要富集在纺锤体、细胞膜、细胞质、细胞微管和纺锤极体上（图1b）；从分子功能上看，差异 circRNA 主要集中在蛋白结合、微管马达活动、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）结合、Rho 鸟苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）酶蛋白结合和蛋白激酶 A 结合上（图1c）。KEGG 信号通路分析结果显示，差异 circRNA 主要富集于叉头框蛋白 O（forkhead box O，FoxO）信号通路、p53 信号通路、黄体酮介导卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂和细胞周期等信号通路过程（图1d）。
图1
差异 circRNA 的 GO 富集分析和 KEGG 信号通路分析
a. 生物学过程；b. 细胞定位；c. 分子功能；d. KEGG 富集通路。图中左侧文字后括号内数字表示基因数量
2.3 circRNA-miRNA 基因网络图建
通过 Circular RNA interactome 预测到差异表达最显著的 circRNA 潜在调控的 miRNA 共 402 个，其中与目标上调基因结合的 miRNA 共 277 个，与目标下调基因结合的 miRNA 共 125 个，利用 Cytoscape 工具构建出 circRNA-miRNA 基因网络图（图2），通过 cytohubba 功能找到前 10 个与多个差异 circRNA 结合的 miRNA，分别为 hsa-miR-557、hsa-miR-507、hsa-miR-224、hsa-miR-136、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-579、hsa-miR-502-5p、hsa-miR-186、hsa-miR-1253、hsa-miR-432。
图2
circRNA-miRNA 网络图
红色三角形表示上调基因，绿色三角箭头代表下调基因，蓝色椭圆表示与之相结合的 miRNA
3 讨论
自 1976 年 Sanger 等[10]在 RNA 病毒中发现 circRNA 至今已经 30 多年，随着科学技术水平的发展和检测手段的不断提高，circRNA 在动植物及人体中的作用被不断探索。诸多研究者发现多种 circRNA 在不同的细胞类型和发育阶段中存在特异性表达，这提示 circRNA 很有可能具有重要的基因调控功能[11]。尽管既往研究已发现了很多与 PCOS 发生发展相关的因素，但是当前 PCOS 的发病机制仍不明确[12]。目前许多研究证实了非编码 RNA 在 PCOS 的发生发展过程中具有重要的调控作用，如 Jiao 等[13]发现健康妇女和 PCOS 患者之间、成熟和不成熟的卵泡液中的长非编码 RNA 和信使 RNA 谱存在显著差异；Li 等[14]研究表明，PCOS 颗粒细胞中牛磺酸正调节 1 蛋白表达的增加可能有助于过度的卵泡活化和生长，并可能破坏优势卵泡的选择；Wang 等[15]发现Ⅱ类主要组织相容性复合体 DRα 和白细胞介素-10 可能通过金黄色葡萄球菌感染富集的吞噬体促进 PCOS 进程，而 miR-486-5p 可能通过靶向 PRELID2 基因参与 PCOS 的卵泡发育，miR-4651 可能通过调节其靶基因而通过白细胞跨内皮迁移参与炎症。circRNA 作为非编码 RNA 的组成部分，其在 PCOS 中也发挥了重要作用。Liu 等[16]通过实验证明 circ-PSMC3 可通过海绵化 miR-296-3p 调节 PTEN 表达来缓解 PCOS 症状；Wang 等[17]通过高通量测序进行表达谱分析，获得了值得进一步研究的新 circRNA、miRNA 和基因靶标，为 PCOS 发病机制的研究提供了有价值的补充。
本研究通过 GEO 数据库分析了一个 PCOS 的 circRNA 芯片表达谱 GSE145276，通过 GEO2R 分析并发现了 247 个差异表达 circRNA，包括 157 个上调 circRNA 和 90 个下调 circRNA。因为 circRNA 较其他线性 RNA 分子更稳定，因此这些 circRNA 可以为 PCOS 的诊断与治疗提供重要的分子标志物。GO 富集分析结果发现，差异 circRNA 主要富集在细胞分裂、细胞增殖以及纺锤体检查点，功能主要集中在蛋白质结合和核酸结合上。KEGG 信号通路分析结果显示差异 circRNA 主要富集于 FoxO 信号通路、p53 信号通路、黄体酮介导卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂和细胞周期等信号通路过程。PCOS 主要表现有卵巢多囊样改变、稀疏排卵或无排卵，已有相关研究表明这主要与卵母细胞的功能有关[18]，卵母细胞分泌的因子控制早期窦状卵泡发育，在整个卵泡形成过程中，由各种蛋白质、类固醇、能量代谢物、细胞因子和生长因子建立的不断变化的卵泡内微环境适当协调卵泡生长和卵母细胞发育，差异 circRNA 作用于细胞生长发育和增殖过程，这有助于解释 PCOS 的发病机制。p53 信号通路一般被认为与肿瘤密切相关，但也有研究者发现，p53 基因的一个变异与代谢密切相关，这可能会导致肥胖和 2 型糖尿病的发展，甚至与心脏病相关[19]。FoxO 信号通路参与许多细胞生理事件，例如细胞凋亡、细胞周期控制、葡萄糖代谢、抗氧化应激和长寿，当受到生长因子或胰岛素的刺激时，FoxO 被磷酸化并失去活性，磷酸化的 FoxO 改变其构象，然后与 14-3-3 蛋白结合，介导 FoxO 从细胞核到细胞质的输出，并减少 FoxO 靶基因的表达[20]。
circRNA 是一种竞争性的内源性 RNA，其含有共同的 miRNA 应答元件，它的一个重要作用机制是发挥 miRNA 海绵功能，能够与 miRNA 靶向结合，间接调节 mRNA 的翻译，调控基因表达，影响疾病的发生发展。miRNA 的有效性受其 miRNA 应答元件细胞浓度的影响，因此，miRNA 的活性与 circRNA 的存在与否密切相关[21]。circRNA 竞争性结合到 miRNA 而导致 miRNA 分子减少，从而使其对 miRNA 靶基因的抑制作用减弱，致使 miRNA 靶基因的表达上调[22]。本研究通过在线软件分析预测到，与差异最显著的 10 个 circRNA 结合的 miRNA 有 402 个，并发现存在一个 miRNA 与多个 circRNA 有结合位点的情况，通过 Cytoscape 找出了前 10 个这样的 miRNA，即 hsa-miR-557、hsa-miR-507、hsa-miR-224、hsa-miR-136、hsa-miR-127-5p、hsa-miR-579、hsa-miR-502-5p、hsa-miR-186、hsa-miR-1253、hsa-miR-432。有研究表明，在 PCOS 患者的颗粒细胞（包括卵巢颗粒细胞和卵巢颗粒肿瘤细胞）中，hsa_circ_0118530 大大升高，将 hsa_circ_0118530 siRNA 转染到卵巢颗粒细胞中，能够诱导细胞凋亡，抑制细胞迁移，而 miR-136 的抑制作用明显逆转了 hsa_circ_0118530 对颗粒细胞进程、氧化应激和炎症释放的功能，miR-136 被预测并确认为 hsa_circ_0118530 的靶标，敲除 hsa_circ_0118530 被认为可以抑制海绵状 miR-136 的 PCOS 进程[23]。Ma 等[24]通过实验验证了 hsa_circ_0043533 和 hsa_circ_0097636 在 PCOS 组和对照组中表达差异显著，在患者卵丘颗粒细胞中分别显著上调和下调；相关性分析提示，二者的表达与患者睾酮水平呈现正相关，它们在 PCOS 的发生发展中发挥了重要作用。Song 等[25]发现颗粒细胞中 hsa-miR-186 的水平与 PCOS 患者的血清雌二醇水平呈正相关。此外，雌二醇治疗直接增加了卵巢颗粒细胞和主要颗粒细胞中 hsa-miR-186 的水平，这为了解 PCOS 的病理生理学提供了新的见识。另外还有多种 miRNA 虽然未在 PCOS 中有相关研究报道，但在妇科肿瘤疾病中研究却有所涉及，例如 hsa-miR-127-5p 被认为可能参与了子宫内膜腺癌的病程[26]，hsa-miR-579 对卵巢癌的发展有所影响[27]。
综上，通过本研究及相关文献资料的检索不难发现，circRNA 通过多种方式参与到 PCOS 的发生发展过程，hsa_circ_0118530、hsa_circ_0043533 和 hsa_circ_0097636 作为差异表达基因在 PCOS 中发挥的作用值得进一步挖掘。通过预测 circRNA 潜在调控的 miRNA，能够更清晰地对 circRNA 在 PCOS 中的作用进行相关分析，增加对 PCOS 病理生理过程的进一步了解。
利益冲突：所有作者声明不存在利益冲突。
