Бесплодный брак является важной медико-социальной проблемой, затрагивающей около 10—15% пар репродуктивного возраста во всем мире. Одним из негативных трендов последних десятилетий является постепенное снижение качества спермы, при этом наиболее резкие изменения отмечены в средней концентрации сперматозоидов [1, 2]. Повышение экспозиции к различным поллютантам (токсическим веществам) рассматривается как одна из наиболее вероятных причин подобных изменений.
Бисфенол А является «эндокринным разрушителем» (англ. endocrine disruptor) — данным термином Американское общество эндокринологов характеризует экзогенные химические вещества (или смесь химических веществ), которые влияют на какой-либо аспект действия гормонов. Негативное влияние бисфенола А на различные этапы сперматогенеза животных показано во многих исследованиях [3—5]. Основные эффекты бисфенола А — это снижение количества и подвижности сперматозоидов, повреждение акросомы, а также повышение фрагментации ДНК.
Исследования влияния «эндокринных разрушителей» на репродуктивное здоровье мужчин являются обсервационными, а их результаты часто противоречивы [6]. К примеру, исследователи из Чехии показали, что бисфенол А содержится в 93% образцов спермы пациентов клиники вспомогательной репродукции, при этом уровень бисфенола А в сперме негативно влияет на все параметры спермограммы [7]. В других подобных исследованиях не выявлена связь между уровнем бисфенола А в организме и показателями спермограммы [8, 9], но показано негативное влияние бисфенола А на фертильность у мужчин с ожирением.
Учитывая повсеместную распространенность бисфенола А, исследователи отмечают, что в научном сообществе возрастает интерес к изучению негативного влияния «эндокринных разрушителей» на репродуктивное здоровье мужчин.
Цель исследования — проанализировать связь между уровнем бисфенола А в крови мужчин, показателями спермограммы и результатами программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).
Материал и методы
Дизайн исследования
В проспективное исследование включены 154 супружеские пары, обратившиеся для проведения ВРТ в ФГБУ «НМИЦ АГП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России. Набор пациентов в исследование осуществлялся с января 2017 г. по декабрь 2018 г. Все пациенты подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Исследование одобрено комиссией по этике биомедицинских исследований. Критериями включения явились нормальный кариотип обоих супругов, отсутствие выраженной патоспермии (100% тератозооспермии, абсолютной астенозооспермии, всех видов азооспермии), возраст женщин от 18 до 39 лет включительно, индекс массы тела женщин от 19 до 25 кг/м2 включительно. Критериями исключения были использование донорских гамет или суррогатного материнства, а также получение трех ооцитов и менее в день трансвагинальной пункции яичников.
Все включенные в исследование супружеские пары обследованы согласно Приказу Минздрава России от 30.08.12 №107н «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению» [3].
Стимуляцию яичников проводили по протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона, дозу гонадотропинов подбирали индивидуально. Введение антагонистов гонадотропин-рилизинг-гормона начинали при наличии в яичниках фолликулов 14 мм и более. Триггер овуляции вводили при наличии в яичниках фолликулов 17 мм и более. Поддержка лютеиновой фазы и посттрансферного периода у всех пациенток проведена по стандартному протоколу.
Оценку эякулята перед проведением оплодотворения проводил эмбриолог согласно классификации Всемирной организации здравоохранения 2010 г. [10].
Оплодотворение ооцитов осуществляли с помощью инсеминации ооцитов in vitro («классическое» экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО), далее ЭКО — метод оплодотворения) или интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ). Культивирование и перенос эмбриона проводили согласно принятым в клинической практике методикам.
Определение уровня бета-хорионического гонадотропина осуществляли через 14 дней после переноса эмбриона в полость матки. Ультразвуковое исследование матки осуществляли через 21 день после переноса эмбриона в полость матки, при наличии плодного яйца в полости матки диагностировали клиническую беременность. Через 40 нед после переноса эмбриона проводили телефонный опрос пациенток для анализа исходов беременности. Под частотой наступления беременности понимали отношение количества клинических беременностей к общему количеству нативных циклов с переносом эмбриона. Под частотой живорождения понимали отношение количества родов живым плодом к общему количеству нативных циклов с переносом эмбриона. Под кумулятивной частотой живорождения понимали отношение количества живорождений в данном цикле и живорождений после переноса размороженных эмбрионов, полученных в данном цикле ЭКО или ИКСИ, к общему количеству циклов.
Сбор и предварительная обработка образцов
Забор венозной крови у мужчин для проведения исследования осуществляли в день трансвагинальной пункции яичников, после чего образцы подвергали криоконсервации при температуре –80°C. Определение уровня бисфенола А проводили методом масс-спектрометрии, при этом лаборатория не имела доступа к клиническим характеристикам пациентов.
Количественный анализ уровня бисфенола А в сыворотке крови методом хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС)
Бензофенон (Ph2CO, 182,22 g/mol, Sigma-Aldrich, США, 99% чистота) использовали в качестве внутреннего стандарта. Для повышения чувствительности метода проводилась предварительная дериватизация дансилхлоридом (99%, HPLC-grage, «Sigma-Aldrich», США). Все сток-растворы готовились посредством растворения требуемого количества бисфенола А (4,4’-isopropyl-idenediphenol, 228,29 g/mol, Sigma-Aldrich, США) или бензофенона в 100% MeOH (99,9%, HPLC Basic, «Scharlau», Испания). До использования растворы хранились в холодильнике в стеклянных виалах при температуре 4 °C не больше 1 нед. Все стеклянные стаканчики промывали гексаном для устранения возможного загрязнения в процессе пробоподготовки.
К 700 мкл сыворотки крови добавляли 70 мкл IS (10 мкг/мл бензофенона в 100% MeOH) с последующим перемешиванием на вортексе и центрифугированием. После добавления 700 мкл MTBE (≥99,5%, HPLC grade, «Fisher Chemical», США), перемешивания на вортексе в течение 1 мин, центрифугирования при 13 000 об/мин при комнатной температуре в течение 10 мин проводили забор верхней фазы. Экстракцию проводили еще дважды, затем органическую фазу сушили в потоке N2 при 40°C до полного высыхания раствора. Для дериватизации бисфенола А добавляли 100 мкл свежеприготовленной смеси дансилхлорида (1 мг/мл в ацетонитриле) и Na2CO3 (1 мг/мл в воде) (1:1), термостатировали при 70°C в течение 10 мин, центрифугировали при 13 000 об/мин при комнатной температуре в течение 10 мин. Надосадочную жидкость в объеме 90 мкл переносили в стеклянную виалу со вставкой для последующего хромато-масс-спектрометрического анализа.
Пробоподготовка проводилась в пластиковых пробирках Эппендорфа 2 мл, которые не содержат бисфенола A. Данное утверждение проверено укороченной пробоподготовкой, в процессе которой 1,8 мл MTBE выдерживали в течение 3 ч в пустых пластиковых пробирках Эппендорфа, после этого добавляли 70 мкл IS и сушили в токе N2 при температуре 40 °C до полного высыхания, после чего продолжалась стандартная пробоподготовка. В полученных смывах с пластиковых пробирок Эппендорфа бисфенол А не обнаружен.
Для построения калибровочной кривой в качестве матрицы использовалась вода MS-grade, что позволило достичь порога чувствительности методики от 0 нг/мл. К 700 мкл H2O добавляли 70 мкл IS и 70 мкл сток-раствора требуемой концентрации. Калибровочная кривая построена по 9 точкам (коэффициент корреляции выше 0,99) с концентрациями бисфенола А в получившемся образце в диапазоне от 0,1 до 100 нг. В качестве контроля качества брали 4 QC: QC1=0,2 нг, QC2=0,6 нг, QC3=50 нг и QC4=75 нг бисфенола A. Предел чувствительности LOQ составил 0,2 нг.
Хроматографическое разделение осуществлялось на Agilent 1260 Infinity («Agilent Technologies», США) с масс-спектрометрическим детектированием (QTRAP 5500 AB Sciex) в режиме электроспрея (ESI-MS/MS) в положительной моде в режиме MRM. Для анализа использовалась колонка Zorbax Eclipse Plus C18, размер 3×50 мм, размер зерна 1,8 мкм. Подвижная фаза A — дистиллированная H2O с 0,1% муравьиной кислоты, подвижная фаза B — ацетонитрил с 0,1% муравьиной кислоты. Измерения проводились в изократическом режиме в течение 5 мин с постоянным соотношением фаз A/B=4/96 при скорости потока 450 мкл/мин, температуре колонки 35 °C и объеме пробы 5 мкл. ВЭЖХ-МС/МС анализ проводился в трех технических повторах. Мертвое время системы в данных условиях не превышало 0,5 мин, время выхода IS — 0,76 мин, а время выхода бисфенола А — 1,48 мин. В табл. 1 приведены параметры используемых MRM-переходов.
Таблица 1. Параметры MRM-переходов
| Q1 (Da) | Q3 (Da) | t_scan (ms) | Соединение | CE (V) | CXP (V) |
| 695,192 | 170,2 | 50 | Дериватизированный бисфенол А | 55 | 16 |
| 695,192 | 170,6 | 50 | Дериватизированный бисфенол А | 53 | 16 |
| 695,192 | 115,1 | 50 | Дериватизированный бисфенол А | 129 | 14 |
| 695,192 | 128,0 | 50 | Дериватизированный бисфенол А | 129 | 14 |
| 695,192 | 156,1 | 50 | Дериватизированный бисфенол А | 105 | 16 |
| 183,125 | 105,0 | 50 | Бензофенон | 21 | 12 |
| 183,125 | 77,0 | 50 | Бензофенон | 43 | 8 |
Статистическая обработка данных
Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica v. 10 (США). Данные с нормальным распределением представлены как среднее значение (стандартное отклонение), данные с ненормальным распределением — как медиана (интерквартильный размах). Статистический анализ проводился с применением χ2-теста для сравнения категориальных переменных, теста Краскела—Уоллиса для сравнения медиан. Для корреляционного анализа использовали критерий Спирмена. Мерой ассоциации для сравнения бинарных данных служило отношение шансов (ОШ) с 95% доверительным интервалом (95% ДИ). Различия между статистическими величинами считали значимыми при уровне p<0,05.
Результаты
Нижний предел количественного определения уровня бисфенола А составил 0,1 нг/мл. Бисфенол А обнаружен в 91,6% (141 из 154) образцов крови мужчин, участвующих в программах ВРТ. Медиана возраста мужчин составила 33,5 (30—36) года. Медиана уровня бисфенола А в крови мужчин составила 0,6 (0,23—2,14) нг/мл. Данные о концентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов представлены в табл. 2.
Таблица 2. Основные параметры спермограммы в день оплодотворения
| Параметр | Среднее значение | Медиана | Интерквартильный размах |
| Концентрация сперматозоидов, млн/мл | 62,0 | 57,0 | 31—86 |
| Подвижность сперматозоидов, прогрессивно подвижные, % | 50,8 | 51,0 | 40—64 |
| Морфологически нормальные формы, % | 2 | 2 | 1—3 |
При проведении корреляционного анализа не найдена связь между уровнем бисфенола А в крови пациентов, возрастом пациентов и основными параметрами спермограммы. При этом наблюдали положительную корреляционную связь между концентрацией сперматозоидов, количеством прогрессивно-подвижных сперматозоидов и долей морфологически нормальных сперматозоидов (табл. 3).
Таблица 3. Корреляция между возрастом мужчины, уровнем бисфенола А в крови и основными параметрами спермограммы
| Параметр | Бисфенол А | Возраст | Концентрация сперматозоидов | Подвижность сперматозоидов | Морфология сперматозоидов |
| Уровень бисфенола А | 1 | –0,49 (0,546) | –0,09 (0,912) | –0,102 (0,207) | –0,57 (0,482) |
| Возраст мужчин | –0,49 (0,546) | 1 | –0,13 (0,832) | –0,42 (0,471) | –0,07 (0,436) |
| Концентрация сперматозоидов | –0,09 (0,912) | –0,13 (0,832) | 1 | 0,342 (<0,001) | 0,305 (<0,001) |
| Подвижность сперматозоидов | –0,102 (0,207) | –0,42 (0,471) | 0,342 (<0,001) | 1 | 0,128 (0,029) |
| Морфология сперматозоидов | –0,57 (0,482) | –0,07 (0,436) | 0,305 (<0,001) | 0,128 (0,029) | 1 |
Примечание. Данные представлены как коэффициент корреляции (P, критерий Спирмена).
Для проведения дальнейшего анализа выделены 4 группы в зависимости от квартиля уровня бисфенола А в крови мужчин исследуемых супружеских пар (Q1, Q2, Q3, Q4). Оценили основные параметры спермограммы и частоту оплодотворения в квартильных группах уровня бисфенола А в крови мужчин. Отмечено снижение концентрации сперматозоидов у мужчин группы Q4, однако различия не были статистически значимыми. Медиана концентрации сперматозоидов у мужчин группы Q4 составила 51 млн/мл — по сравнению с 57 млн/мл у всех исследуемых мужчин и 69 млн/мл у мужчин группы Q1 (табл. 4).
Таблица 4. Основные показатели качества спермы в зависимости от уровня бисфенола А у мужчин
| Параметр | Всего (n=154) | Q1 (n=41) | Q2 (n=36) | Q3 (n=39) | Q4 (n=38) | p* |
| Концентрация сперматозоидов, млн/мл | 57,0 (31,0—86,0) | 69,0 (33,0—95,0) | 63,5 (43,5—114,5) | 69,0 (33,0—92,0) | 51,0 (24,0—100,0) | 0,808 |
| Подвижность сперматозоидов, прогрессивно подвижные, % | 51,0 (40,0—64,0) | 62,0 (45,0—69,0) | 57,0 (46,5—66,0) | 55,0 (36,0—69,0) | 55,5 (40,0—72,0) | 0,615 |
| Морфологически нормальные сперматозоиды, % | 2 (1—3) | 2 (1—2) | 2 (1—2) | 2 (1—3) | 2 (1—3) | 0,936 |
| Частота оплодотворения ооцитов | 100 (83—100) | 100 (100—100) | 100 (95—100) | 100 (80—100) | 100 (83—100) | 0,338 |
Примечание. * — тест Краскела—Уоллиса для сравнения непрерывных данных; данные представлены как медиана (интерквартильный размах).
Затем оценили результаты программ ВРТ в квартильных группах уровня бисфенола А в крови мужчин. Частота наступления беременности не различалась у женщин всех групп, однако наблюдали тенденцию к повышению частоты ранних репродуктивных потерь при повышении уровня бисфенола А в крови супруга. Частота самопроизвольного прерывания беременности составила 23,5% у женщин группы Q4 по сравнению с 5,6% у женщин группы Q1 и с 20,8% в общей когорте исследуемых женщин (табл. 5).
Таблица 5. Результаты программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в семейных парах в зависимости от уровня бисфенола А в крови мужчин
| Результат ВРТ | Всего (n=154) | Q1♂ (n=41) | Q2♂ (n=36) | Q3♂ (n=39) | Q4♂ (n=38) | p* |
| Частота наступления беременности, n (%) | 67 (47,5) | 13 (46,4) | 21 (58,3) | 16 (41,0) | 17 (44,7) | 0,479 |
| Потери в I триместре, n (%) | 15 (20,8) | 1 (5,6) | 6 (28,6) | 4 (25,0) | 4 (23,5) | 0,314 |
| Частота родов, n (%) | 52 (36,9) | 12 (42,9) | 15 (41,7) | 12 (30,8) | 13 (34,2) | 0,676 |
| Σ частоты родов, n (%) | 68 (48,2) | 16 (57,1) | 17 (47,2) | 18 (46,2) | 17 (44,7) | 0,763 |
Путем ROC-анализа определен пороговый уровень бисфенола А у мужчин, при котором повышалась вероятность прерывания беременности в I триместре. Пороговый уровень составил 0,4 нг/мл. ОШ самопроизвольного прерывания беременности при уровне у мужчин бисфенола А 0,4 нг/мл и выше составил 4,06 (95% ДИ 0,77—40,13).
Отдельно проанализировали результаты программ ВРТ в тех случаях, когда бисфенол А в крови не обнаружен (n=13). Беременность наступила в 5 (38,5%) случаях, все беременности закончились своевременными родами. Таким образом, все случаи самопроизвольного прерывания беременности произошли в тех парах, в которых мужчины имели в крови детектируемый уровень бисфенола А.
Обсуждение
По данным нашего исследования, бисфенол А в детектируемой концентрации обнаружен у большинства пациентов, что согласуется с данными, полученными в других странах [11—13].
Не найдено корреляционной связи между уровнем бисфенола А в крови пациентов, количеством, подвижностью и морфологией сперматозоидов. При этом медиана концентрации сперматозоидов у мужчин группы Q4 была в 1,4 раза ниже, чем у мужчин группы Q1. Влияние «эндокринных разрушителей» на репродуктивное здоровье мужчин является предметом интереса различных исследователей, принимая во внимание все данные, полученные на экспериментальных моделях животных.
Помимо прямого повреждающего воздействия на репродуктивные ткани, приводящего к нарушению сперматогенеза, субфертильности и бесплодию, изменения в ДНК сперматозоидов могут влиять на здоровье будущих поколений. Трансгенерационное воздействие, т.е. влияние «эндокринных разрушителей» на здоровье и фертильность нескольких поколений, продемонстрировано на моделях мышей [9]. Аналогичные исследования не могут быть воспроизведены на человеке, однако подобное влияние «эндокринных разрушителей» на репродуктивное здоровье человека представляется весьма вероятным.
Следует отметить, что патогенез влияния бисфенола А на сперматогенез до конца не изучен. Наиболее вероятным механизмом является повреждение рецепторов к гонадотропинам и стероидным гормонам, влияние на стероидогенез, а также прямое повреждение сперматогенного эпителия и сперматозоидов [14]. Однако механизмы воздействия на фертильность и другие параметры здоровья следующих поколений вызывают много вопросов.
Различные результаты имеющихся исследований у человека можно объяснить несколькими факторами. Во-первых, в исследованиях определяли содержание бисфенола А в различных биологических тканях — крови, моче или сперме. Во всех исследованиях определение уровня бисфенола А проводилось однократно, в основном без учета клинико-анамнестических характеристик. Во-вторых, объектом подобных исследований преимущественно являлись пациенты клиник вспомогательной репродукции, т.е. пациенты с нарушенной фертильностью. В-третьих, оценка эякулята во всех исследованиях также проводилась однократно, обычно в день проведения оплодотворения ооцитов. При этом показатели спермограммы у одного и того же мужчины могут варьировать в широком диапазоне в течение времени.
Интересной находкой данного исследования является связь между повышением уровня бисфенола А в крови мужчин и невынашиванием беременности после программ ВРТ. Наиболее вероятным механизмом влияния бисфенола А на риск невынашивания беременности является воздействие на целостность ДНК сперматозоидов и мейоз (подобные данные получены на моделях животных). Полученные нами данные не согласуются с исследованием L. Dodge и соавт., в котором при анализе 211 циклов ВРТ не найдено связи между уровнем фенолов в моче мужчин и результатами ВРТ [15].
Сильными сторонами нашего исследования явились выборка пациентов и наличие информации обо всех этапах ВРТ. Оценку подвижности, морфологии и концентрации сперматозоидов проводил один эмбриолог, что снижает вероятность ошибки исследования.
Недостаток нашего исследования — отсутствие подробных данных об анамнезе и соматическом здоровье мужчин. Мы не проводили оценку фрагментации ДНК сперматозоидов, что будет являться предметом дальнейших исследований.
Заключение
Бисфенол А в детектируемой концентрации обнаружен у большинства пациентов с бесплодием. Уровень бисфенола А негативно влияет на концентрацию сперматозоидов и частоту ранних репродуктивных потерь после ВРТ, что является основанием для проведения дальнейших исследований. Учитывая широкую распространенность «эндокринных разрушителей» в окружающей среде, мы предполагаем, что изучение их влияния на репродуктивное здоровье мужчин окажется предметом внимания научного сообщества в будущем.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Франкевич В.Е., Долгушина Н.В.
Сбор и обработка материала — Сыркашева А.Г., Киндышева С.В.
Статистический анализ данных — Сыркашева А.Г.
Написание текста — Сыркашева А.Г., Киндышева С.В.
Редактирование — Франкевич В.Е., Долгушина Н.В.
Исследование проведено без спонсорской поддержки.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.