Введение

Бесплодие, по данным Всемирной организации здравоохранения, — одно из пяти социально и демографически наиболее значимых заболеваний в мире [1]. В России проблема бесплодия стоит не менее остро, чем в других странах. В нашей стране зарегистрированы приблизительно 10 млн человек репродуктивного возраста, имеющих проблемы с зачатием, большую часть этой популяции составляют женщины — около 6 млн, и значительному числу (около 250 тыс.) пациентов данный диагноз устанавливают ежегодно. Количество бесплодных браков на территории России в целом колеблется в пределах 17,2—24,0% [2—4]. Кроме того, в условиях эколого-репродуктивного диссонанса и всемирного спада экономики современный институт семьи претерпел существенные изменения: год за годом увеличивается средний возраст вступления в брак и рождения первого ребенка, снижается количество многодетных семей. На момент предполагаемого деторождения индекс соматического и репродуктивного здоровья женщины снижен, что может потенциально неблагоприятно влиять на способность к зачатию и течение наступившей беременности. Известно, что с увеличением возраста женщины частота бесплодия растет. Так, в возрасте 35—44 лет частота бесплодия у женщин в 2 раза выше, чем в возрасте 30—34 лет. Доказано также, что эффективность мер по восстановлению фертильности обратно пропорциональна возрасту: чем старше пациентка, тем менее результативно лечение бесплодия, причем значительное снижение эффективности отмечается у пациенток старше 35 лет [5]. В связи с этим принципиальная задача, стоящая перед исследователями и специалистами здравоохранения, заключается в поиске максимально эффективных мероприятий по восстановлению фертильности. Потребность повышения эффективности вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) диктует поиск новых подходов с целью влияния на те составляющие, коррекция которых возможна и необходима, что помогло бы коренным образом изменить ситуацию с низкой результативностью программ ВРТ. Сегодня к таким мерам относят качественную прегравидарную подготовку, включающую лечение гинекологических и экстрагенитальных заболеваний.

В структуре причин женского бесплодия лидирующие позиции бесспорно занимает трубно-перитонеальный фактор, что обусловлено высокой распространенностью воспалительных заболеваний органов малого таза (ВЗОМТ) в общей популяции [6]. ВЗОМТ наиболее часто становятся причиной бесплодия у женщин моложе 30 лет с высокой сексуальной активностью. Малосимптомное течение, формирование микробных ассоциаций и биопленок, проблема антибиотикорезистентности, а также низкая приверженность лечению, характерная для российских пациенток, к сожалению, в совокупности негативно влияют на эффективность терапии, частоту развития осложнений, в том числе бесплодия. Еще одной частой причиной женского бесплодия служит эндокринный фактор, занимающий второе место по частоте выявления.

Среди нозологических форм женского бесплодия особое место занимает синдром поликистозных яичников (СПКЯ), наиболее часто встречающийся у женщин репродуктивного возраста. Наряду с репродуктивными нарушениями, обусловленными СПКЯ, доказана прямая корреляция этого синдрома с метаболическим синдромом и сердечно-сосудистыми заболеваниями. В общей популяции СПКЯ встречается достаточно часто — у 9,0—21,0% женщин детородного возраста [7—9]. Среди пациенток с ановуляторным бесплодием СПКЯ диагностируют у 90—95% [10].

Еще одной из частых причин утраты фертильности служит эндометриоз. Каждая 10-я женщина в мире имеет ту или иную форму эндометриоза, причем среди пациенток с бесплодием данное заболевание диагностируют у 30,0—50,0% [11].

Высокая распространенность гинекологических заболеваний способствует формированию высокой частоты бесплодия. В связи с этим в последние годы значительно выросла потребность в применении ВРТ. Эффективность широко колеблется — от 33,0 до 52% в зависимости от вида программы ВРТ [12—13]. Не вызывает сомнений, что на результативность ВРТ влияет множество составляющих, и при женском бесплодии на первом месте среди них — качество ооцитов, зависящее от микроокружения яичника. Отбор ооцитов, которые в дальнейшем и будут использованы для оплодотворения in vitro — один из важнейших этапов программы ВРТ, ведь именно работа с гаметами, имеющими высокий репродуктивный потенциал, может существенно повысить результативность ВРТ. Ключевая проблема при отборе качественных ооцитов состоит в том, что до настоящего времени нет единых четких критериев для данной процедуры. Научные сведения о биологических маркерах качества ооцитов, содержащихся в фолликулярной жидкости, носят противоречивый характер.

Цели научного обзора: 1) проанализировать состояние проблемы оценки качества ооцитов различными современными методами для прогнозирования исхода программ ВРТ; 2) оценить результаты научных работ по определению качества ооцитов в зависимости от содержания биологически активных веществ в фолликулярной жидкости при различном состоянии овариального резерва.

Материал и методы

Поиск исследований, опубликованных в международных и российских базах данных и электронных ресурсах (MedLine, EMBASE, eLibrary, Cyberleninka) по проблеме оценки качества ооцитов в программах ВРТ с помощью ключевых слов (бесплодие, фолликулярная жидкость, качество ооцитов, ЭКО, беременность) на русском и английском языках.

Результаты

Оценка морфологии ооцитов

Сегодня основной метод отбора ооцитов базируется на изучении морфологии клетки [14]. В первую очередь обращают внимание на диаметр фолликула, нормальные значения которого имеют широкий диапазон, потому данный критерий обладает крайне низкой специфичностью [1]. Оценивая параметры ооцита, клинические морфологи выделили так называемые экстрацитоплазматические и интраплазматические аномалии, опираясь на изучение которых, можно подобрать более качественный клеточный материал для обеспечения благополучного развития и течения беременности. Известно, что в результате мейоза в ооците образуется так называемое полярное тельце. Как правило, его присутствие свидетельствует о том, что данная половая клетка пригодна для оплодотворения. Однако в ходе исследований обнаружено, что незрелые ооциты также могут содержать полярное тельце. Существуют аномалии полярного тельца, указывающие на низкое качество ооцита (резкое увеличение, фрагментация полярного тельца). Увеличение полярного тельца также может свидетельствовать об анеуплоидии [15]. О зрелости ооцита также говорит наличие развитого веретена деления в метафазе II. Такие клетки считаются более перспективными для оплодотворения. Большое значение играет форма ооцита — выраженное изменение таковой впоследствии негативно сказывается на процессе имплантации бластоцисты, являясь предиктором невынашивания беременности. Морфология блестящей оболочки также может свидетельствовать о том или ином состоянии ооцита. Эта оболочка в норме имеет вид сети с порами и выемками; кроме того, в ней выделяют внутреннюю и наружную зоны, отличные друг от друга по структуре. Результаты электронной микроскопии показали, что ооциты, имеющие пористо-ячеистую структуру блестящей оболочки, обладают высоким потенциалом развития. Губчатое строение блестящей оболочки, напротив, говорит о низком качестве гаметы и более низкой вероятности успешного оплодотворения. Существенное значение имеет уплотнение или деформация блестящей оболочки, что происходит вследствие нарушения синтеза одного из четырех гликопротеидов, входящих в ее состав. Для циклов ВРТ также не используют ооциты, имеющие увеличенное перивителлиновое пространство, поскольку подобное изменение характерно для стареющих клеток, которые в дальнейшем могут быть причиной репродуктивных неудач. Такие ооциты наиболее часто встречаются у пациенток старшего возраста. Кроме того, в данном пространстве могут иметься грануляции. Однако авторы исследований на этот счет не пришли к единому мнению: одни утверждают, что наличие грануляций свидетельствует о низком качестве половой клетки, другие же говорят о том, что наличие данной аномалии никоим образом не влияет на состояние ооцита [16]. К интрацитоплазматическим аномалиям, которые следует учитывать при отборе качественного биологического материала, относят вакуолизацию цитоплазмы, регистрируемую достаточно часто. Количество и размер вакуолей вариабельны; как правило, вакуоли >5—10 мкм в диаметре не оказывают негативного влияния на эффективность фертилизации и развития беременности. Если же в цитоплазме ооцита обнаруживается одна или несколько крупных вакуолей, то данный ооцит характеризуется сниженной способностью к оплодотворению. К тому же наличие крупной вакуоли (>14 мкм) изменяет архитектонику клетки, обусловливая смещение ее структур, в том числе веретена деления, правильное строение которого имеет принципиальное значение для сохранения высокой репродуктивной способности клетки [17]. Грануляцию цитоплазмы, которую можно также обнаружить при электронной микроскопии, рассматривают как вариант нормы [18]. Ее наличие даже свидетельствует о большем потенциале к дальнейшему развитию, нежели ооциты с гомогенной цитоплазмой. Однако необходимо учитывать особенности расположения грануляций. Хотя и этот аспект по-прежнему остается спорным: результаты некоторых исследований выявили связь низкого качества ооцита с центральным расположением грануляций [19]. Наличие крупных грануляций в цитоплазме ооцита значительно ухудшает прогноз на успешное оплодотворение. Большое количество грануляций может снижать репродуктивный потенциал клетки. Рефракционные тельца, которые чаще других аномалий обнаруживаются в ооцитах, содержат особый пигмент — липофусцин, накопление которого происходит в клетках, имеющих низкую пролиферативную активность [20]. Для оценки качества ооцита также следует принимать во внимание агрегацию шероховатого эндоплазматического ретикулума, которая возникает при старении половой клетки [17]. Известно, что при наличии агрегации эндоплазматического ретикулума повышается частота невынашивания беременности в связи с высокой вероятностью развития аномалий эмбриона [20, 21].

Оценка митохондриальной ДНК

Особый интерес эмбриологов и клиницистов сосредоточен на митохондриальной ДНК (мтДНК) ооцита. Митохондрии ооцита имеют лишь 1—2 молекулы мтДНК в отличие от митохондрий соматических клеток, в которых количество молекул мтДНК может достигать 10 [22]. Количество копий молекулы ДНК в человеческих ооцитах имеет широкую вариацию не только в популяции, но и в ооцитах одной пациентки. Поэтому однозначно судить о качестве клетки по точному количеству копий не представляется возможным. Однако с возрастом происходит их снижение, поэтому пул ооцитов, полученный в ходе программы ВРТ у пациенток старшего репродуктивного возраста, по качеству значительно хуже, чем у более молодых женщин [23]. Кроме того, ооциты можно оценить и по синтезу АТФ клеточными митохондриями. Количество АТФ в клетках также вариабельно. Однако клетки с высоким уровнем АТФ считаются более перспективными для оплодотворения [24]. Таким образом, широкий спектр морфологических критериев качества ооцита дает возможность отобрать наилучшие ооциты для оплодотворения в программах ВРТ.

Оценка состава фолликулярной жидкости

Однако, проводя оценку качества получаемых ооцитов, нельзя опираться только на морфологию половых клеток. Кроме структурных особенностей ооцитов, необходимо учитывать биохимический состав фолликулярной жидкости (ФЖ), представляющей собой абсолютно уникальную биологическую субстанцию, в которой происходит развитие ооцита второго порядка [25]. Микроокружение оказывает на ооцит колоссальное влияние, определяя его качество и репродуктивный потенциал. ФЖ представлена большим многообразием компонентов: это гормоны, липиды, цитокины, ферменты, факторы роста, электролиты и другие биологически активные агенты [26]. Концентрация многих веществ напрямую коррелирует со стадией развития гаметы и степенью зрелости фолликула. Поэтому сегодня особое внимание исследователей направлено на поиск специфических биохимических маркеров, которые позволят определить качественные гаметы с высоким потенциалом фертилизации для дальнейшего применения в программах ВРТ.

Большой интерес представляет гормональный профиль ФЖ. В окружение фолликула входит ряд репродуктивных гормонов, таких как эстрадиол, фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормоны, соматотропный гормон, хорионический гонадотропин человека, прогестерон, фракции андрогенов. Характеристики ФЖ определяются не только содержанием гормонов в плазме крови, но и уровнем секреции этих биологически активных веществ клетками теки и гранулезы растущего фолликула. Ввиду широкого биологического действия перечисленных гормонов предложено использовать гормональный профиль для прогнозирования исхода цикла ВРТ. Однако результаты работы K. Walters и соавт. (2018) продемонстрировали, что концентрации половых стероидов в ФЖ после проведения овариальной стимуляции не могут выступать в качестве достоверных предикторов результативности экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) [27]. Основным предиктором успеха цикла ЭКО является уровень антимюллерова гормона (АМГ), поскольку он является специфическим маркером овариального резерва. Доказано, что АМГ участвует в регуляции фолликулогенеза. Этот гликопротеид вырабатывается гранулезой и клетками кумулюса первичных, преантральных и малых антральных фолликулов. Синтез АМГ постепенно уменьшается по мере роста фолликулов. Продукция гормона в примордиальных, доминантном и в фолликулах, подвергшихся атрезии, отсутствует. Таким образом, концентрация АМГ в сыворотке крови прямо коррелирует с количеством первичных, преантральных и малых антральных фолликулов. Не исключено, что АМГ также можно расценивать как маркер, отвечающий за качество половых клеток. Это предположение подтверждено результатами исследования A. Kedem-Dickman и соавт. (2012), в котором в ФЖ незрелых ооцитов обнаружены высокие концентрации АМГ, в то время как в клетках стадии развития метафаза II его концентрация была значительно ниже [28]. Концентрация прогестерона оказывает огромное влияние на наступление беременности и ее исход, однако до настоящего времени спорным остается вопрос о роли данного гормона для качества ооцита. Учитывая, что: 1) стероидогенез — один из важнейших процессов при созревании растущего фолликула, 2) прогестерону отведена ведущая роль в преовуляторной фазе, можно полагать, что прогестерон оказывает определенное воздействие на качество ооцитов, хотя этот механизм пока неясен [26]. Метаанализ и систематический обзор, посвященный взаимосвязи концентрации прогестерона в ФЖ и результативности программ ВРТ [29], показал, что более высокие концентрации прогестерона в ФЖ зарегистрированы в протоколах ЭКО, завершившихся успехом. Результаты исследования, выполненного Y. O’Brien и соавт. (2019), продемонстрировали, что концентрации прогестерона и АМГ в ФЖ были статистически значимо выше у пациенток, чьи ооциты не только успешно оплодотворены, но и дошли в развитии до стадии бластоцисты [30]. Таким образом, определение концентрации прогестерона и АМГ в ФЖ может иметь положительную прогностическую ценность в отношении результативности программ ВРТ. Большое значение для фолликулогенеза имеет уровень андрогенов. Рецепторы к данной группе стероидов присутствуют во всех структурах фолликула — в ооците, гранулезе, теке. Количество рецепторов к андрогенам в гранулезе возрастает по мере роста фолликула; максимальное их количество регистрируется в антральном фолликуле. Концентрация тестостерона напрямую зависит от размера фолликула: чем больше фолликул, тем выше концентрация данного гормона [31]. Так, у пациенток с СПКЯ количество тестостерона в антральных фолликулах значительно выше, чем у пациенток без этого синдрома [32]. Концентрацию андрогенов в ФЖ можно предположительно использовать для оценки качества ооцитов, однако до настоящего времени исследования в этом направлении не окончены. Результаты относительно влияния витамина D на качество половых клеток в опубликованных работах весьма противоречивы [33, 34]. Он присутствует в сыворотке крови и в ФЖ, имеет большое значение для фолликуло- и оогенеза и, вероятнее всего, оказывает определенное влияние на ооциты, однако результаты исследований остаются спорными [35]. Интересны исследования ФЖ, в которых оценивали концентрацию мелатонина. Мелатонин можно рассматривать как адаптоген репродуктивной системы женщины. Он участвует в процессах созревания фолликула и овуляции. Концентрация этого гормона в ФЖ значительно выше, нежели в сыворотке крови. Ранее считалось, что мелатонин синтезируется только в эпифизе. Однако результаты последних работ говорят о том, что различные органы способны продуцировать мелатонин, и фолликулы в данном случае не являются исключением. Полагают, что фолликул может самостоятельно синтезировать или накапливать мелатонин. Доказано, что при некоторых гинекологических заболеваниях концентрация мелатонина в ФЖ становится ниже, чем в сыворотке крови, что отмечается, например, у женщин с СПКЯ. Предположительно, низкие значения мелатонина при СПКЯ могут обусловливать ановуляцию [36]. Мелатонин способен модулировать продукцию прогестерона после наступления овуляции. Еще одна важная роль мелатонина — участие в защите фолликула от повреждений свободными радикалами совместно с антиоксидантной системой. По данным исследования H. Tamura и соавт. (2013), изучавших влияние концентрации мелатонина на созревание ооцита, выявлены положительные эффекты этого гормона. Однако доказательная база еще не сформирована, и исследователи полагают, что контроль концентрации мелатонина в ФЖ может стать одним из наиболее важных предикторов эффективности ЭКО в будущем [37]. Различные исследования микроокружения ооцитов акцентировали внимание клиницистов и на таком параметре, как матриксные металлопротеиназы (ММП), влияющие на функциональное состояние яичника. Они оказывают разрушающее действие на белковые структуры внеклеточного матрикса. Так, матриксная металлопротеиназа-1 (ММП-1) отвечает за деградацию коллагена при воспалительном процессе [38—40]. ММП-1 содержится во всех фолликулах на любой стадии их развития (маркируются ядра и цитоплазма ооцитов, гранулезные клетки фолликула). Количество ММП-1 увеличивается по мере созревания фолликула. Важным компонентом контроля ферментативной активности выступает тканевый ингибитор металлопротеиназ (ТИМП), который обнаруживается в половых клетках на различной стадии развития. Как и в случае ММП-1, тканевый ингибитор присутствует в значительных количествах в ооцитах, достигших полной зрелости, в примордиальных фолликулах ТИМП экспрессируется слабо. Эти два компонента, ММП-1 и ТИМП-1, образуют друг с другом систему, которая играет большую роль в архитектонике матрикса. Кроме того, баланс в системе ММП-1/ТИМП-1 определяет качественные характеристики зрелого ооцита [40]. Доказано, что при наличии локального воспалительного процесса количество ММП-1 в ФЖ существенно возрастает, однако концентрация ТИМП-1 не зависит от степени выраженности воспаления [41]. Поэтому исследование концентрации ММП в ФЖ может обладать прогностической ценностью в отношении исхода программ ВРТ.

Липиды имеют огромный спектр биологических функций в человеческом организме, и состав ФЖ не является исключением. Проведенные исследования позволили выделить те липиды в составе ФЖ, которые оказывают влияние на фолликулогенез. Установлено, что у пациенток с благоприятными исходами беременности концентрации фосфолипидов и сфинголипидов ФЖ были выше, а концентрации холестерола и триглицеридов — ниже, чем у женщин с неблагоприятным исходом беременности [42]. В исследовании R. Browne и соавт. (2009) показано, что липопротеины высокой плотности (ЛПВП) могут быть прогностическими параметрами фрагментации эмбриона в программах ВРТ [43]. ЛПВП играют большую роль в развитии фолликула и ооцита за счет своего влияния на уровень холестерола, содержащегося в ФЖ, который необходим для синтеза всех стероидных гормонов. Результаты исследований липидного состава ФЖ указывают на протективное действие ЛПВП в отношении ооцита, что в дальнейшем положительным образом сказывается на процессе эмбриогенеза.

Необходимо понимать, что состав липидного профиля ФЖ не может быть постоянным, он меняется с возрастом и зависит от большого количества факторов: параметров общего липидного обмена пациентки, ведущего фактора бесплодия, наличия метаболического синдрома и прочее. Так, F. Cordeiro и соавт. (2018) в своем исследовании показали, что у пациенток старше 35 лет в ФЖ повышено содержание триацилглицерола, диацилглицерола, сфингомиелина [44]. Увеличение концентрации триацилглицерола в ФЖ может указывать на снижение качества ооцитов, поскольку ацилглицеролы способствуют активации апоптоза в гранулезе фолликула, что выражается в снижении качества гаметы. Обнаружено, что малое количество ооцитов в стадии развития метафаза II, полученных при трансвагинальной пункции фолликулов, ассоциировалось с повышенным уровнем триглицеридов. В когорте пациенток с СПКЯ отмечена повышенная концентрация сфингомиелина в ФЖ. Возможно, что сфингомиелины оказывают неблагоприятное влияние на процесс оогенеза. У пациенток старше 35 лет отмечены статистически значимо более низкие концентрации фосфатидилхолина, фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина в ФЖ [45].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Оценка качества ооцитов сегодня проводится несколькими методами: рутинная технология — оценка морфологии ооцитов; определение митохондриальной ДНК и метаболитов фолликулярной жидкости — перспективные научные направления. Поддержание оптимального состава фолликулярной жидкости способствует правильному росту и развитию ооцита, обусловливает метаболический потенциал гаметы, закономерно влияет на качество фолликулярного аппарата яичника и результативность процесса оплодотворения. Определенное соотношение биологически активных веществ в составе фолликулярной жидкости предоставляет информацию о развитии фолликулов. Поскольку фолликулярная жидкость представляет собой динамическую субстанцию, в которой происходит постоянное изменение соотношений различных веществ в зависимости от стадии фолликулогенеза, наличия соматических или гинекологических заболеваний, определение дисбаланса в ее составе может указывать на вероятность формирования ооцита низкого качества.

Однако в литературе представлены лишь единичные исследования, в которых изучена связь состояния овариального резерва с качественным составом фолликулярной жидкости, и результаты этих исследований носят противоречивый характер. Многообразие изучаемых параметров и отсутствие единой системы оценки качества фолликулярной жидкости для прогнозирования качества ооцитов с целью повышения эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий обосновывают необходимость дальнейших исследований.

Участие авторов:

Концепция и дизайн — Михайлюкова А.С., Вартанян Э.В., Доброхотова Ю.Э.

Сбор и обработка материала — Михайлюкова А.С., Цатурова К.А., Кузьмичева В.С.

Написание текста — Михайлюкова А.С., Цатурова К.А., Кузьмичева В.С.

Редактирование — Девятова Е.А., Вартанян Э.В.

Финансирование. Финансовая поддержка осуществлена учреждением, проводившим данное исследование.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.