Старение сопровождается снижением когнитивных функций у значительной части населения и является основным фактором риска развития большинства нейродегенеративных заболеваний [1, 2]. За последние десятилетия было доказано, что возрастная инволюция головного мозга тесно связана с уменьшением объема как серого, так и белого вещества вследствие прогрессивного сокращения количества крупных нейронов, дегенерации синапсов, нейритов и миелиновых волокон [3—7].
Несмотря на разнообразие сенильных проявлений, данные современной литературы [8—18] о комплексном изучении структурных элементов в стареющем головном мозге представлены неполно и во многом противоречивы. Также следует отметить, что многие изменения, возникающие при возрастной инволюции и нейродегенерации, имеют схожую морфологическую картину и различаются между собой в основном количественно [14]. Все это отражает актуальность исследования структурных элементов головного мозга при старении для их дальнейшего использования в качестве контрольных показателей при исследовании нейродегенеративных заболеваний.
Цель исследования — выявление наиболее характерных морфологических проявлений и оценка морфометрических параметров сенильных изменений нервной ткани в различных структурах головного мозга человека.
Материал и методы
Аутопсийный материал был получен от 20 умерших старческого возраста (75—89 лет), 10 умерших долгожителей (старше 90 лет), причиной смерти которых явилась тромбоэмболия легочной артерии при наличии постинфарктного или атеросклеротического кардиосклероза на фоне гипертонической болезни. Для сравнительного анализа был использован аутопсийный материал лиц 35—45 лет (n=10) с диагнозом внезапной сердечной смерти. В анамнезе умерших больных отсутствовали указания на когнитивные и двигательные нарушения. Также в исследование не включались умершие с выраженным стенозом прецеребральных и церебральных артерий. При макроскопическом исследовании отмечали наличие/отсутствие расширения желудочковой системы, очаговых изменений, измеряли массу головного мозга. Образцы из коры прецентральной извилины, базальных ядер (скорлупа и бледный шар), черной субстанции, гиппокампа фиксировали в забуференном формалине в течение 24 ч с последующим изготовлением парафиновых блоков. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, методом Ниссля, а также по методу Ван Гизона. При помощи сканирующего микроскопа Aperio AT2 (Leica Biosystems) в формате svs были получены цифровые изображения микропрепаратов.
Количественный анализ крупных нейронов базальных ядер, V слоя коры, компактной части черной субстанции и пирамидного слоя гиппокампа в 50 полях зрения при увеличении в 400 раз был выполнен в программе для морфометрии QuPath 0.3.0. Дополнительно для коры прецентральной извилины вычисляли глиальный индекс, представляющий собой отношение числа клеток глии (без ее разграничения по видам) к числу нейронов. Толщину коры измеряли при помощи микрометра на вершине извилины. Амилоидные тельца, липофусциноз, криблюры (резко дилатированные периваскулярные пространства Вирхова—Робина), сосудистые конволюты (капиллярные и микрососудистые формации с несколькими просветами), венозный коллагеноз (утолщение стенок вен вплоть до полной облитерации за счет накопления в них коллагена) и артериолосклероз оценивали полуколичественным методом, где 0 баллов — отсутствие признака, 3 балла — выраженные изменения; качественно — наличие или отсутствие хроматолиза нейронов, внутриклеточных включений, сенильных бляшек, спонгиоформного изменения белого вещества, а также периваскулярных петрификатов. Обработку данных выполняли в программе StatTech v. 2.5.6. Для выявления нормального распределения количественные показатели оценивали с помощью критерия Шапиро—Уилка. Для оценки различий между группами использовали F-критерий Фишера, Краскела—Уоллиса и c2 Пирсона.
Результаты
Результаты проведенного исследования как в группе лиц старческого возраста, так и в группе долгожителей подтверждают, что для старения характерно снижение массы головного мозга. Это сопровождается истончением коры полушарий большого мозга, которое макроскопически проявляется увеличением объема субарахноидальных пространств и желудочков с формированием наружной и внутренней гидроцефалии.
При изучении массы мозга были обнаружены статистически значимые различия во всех возрастных группах. Масса головного мозга умерших в возрасте 75—89 лет (1266±73 г) и старше 90 лет (1134±48 г) была меньше на 6,2% и 16% соответственно по сравнению с массой мозга умерших в возрасте 35—45 лет (1350±37 г).
Оценивая такие показатели, как атрофия извилин и расширение желудочковой системы (наружная и внутренняя гидроцефалия), в зависимости от возрастной группы, выявили статистически значимые различия (p<0,001) (табл. 1). В 13 случаях (в 5 в возрасте 75—89 лет, в 8 в возрасте старше 90 лет) при макроскопическом исследовании мозга также были обнаружены перенесенные ранее мелкие организованные инфаркты в коре и глубоких отделах мозга в виде мелких постинфарктных кист и глиомезодермальных рубцов. Следует подчеркнуть, что в данных случаях фрагменты для гистологического исследования брали из контралатерального полушария мозга.
Таблица 1. Макроскопические изменения головного мозга в исследуемых возрастных группах
| Показатель | Категория | Возраст, годы | p1—2 | p1—3 | p2—3 | ||
| 35—45 (1) | 75—89 (2) | старше 90 (3) | |||||
| Атрофия извилин с расширением борозд | Да | 0 (0,0) | 7 (35,0) | 8 (80,0) | 0,040* | <0,001* | 0,040* |
| Нет | 10 (100,0) | 13 (65,0) | 2 (20,0) | ||||
| Внутренняя и наружная гидроцефалия | Да | 0 (0,0) | 6 (30,0) | 8 (80,0) | 0,070 | <0,001* | 0,019* |
| Нет | 10 (100,0) | 14 (70,0) | 2 (20,0) | ||||
| Очаговые изменения | Да | 0 (0,0) | 5 (25,0) | 8 (80,0) | 0,140 | <0,001* | 0,008* |
| Нет | 10 (100,0) | 15 (75,0) | 2 (20,0) | ||||
Примечание. Здесь и в табл. 2—4: * — различия показателей статистически значимы (p<0,05).
При оценке толщины коры прецентральной извилины в зависимости от возраста были установлены существенные различия (p<0,001). Толщина коры в группе 35—45 лет в среднем составляла 3882 мкм, а в старческом возрасте толщина коры уменьшалась на 23,2% (табл. 2). В образцах, полученных от лиц старше 90 лет, при сравнении с таковыми от лиц 75—89 лет ее толщина также прогрессивно снижалась. Полученные результаты, демонстрирующие возрастное снижение толщины коры прецентральной извилины, согласуются с другими морфометрическими работами и, наиболее вероятно, связаны с уменьшением количества крупных нейронов и возникающими атрофическими процессами в головном мозге [7, 9, 15].
Таблица 2. Толщина коры прецентральной извилины в исследуемых возрастных группах
| Возраст, годы | Толщина коры, мкм | p | |
| M±SD | 95% ДИ | ||
| 35—45 (1) | 3882±310 | 3660—4104 | p1—2=0,001* p1—3=0,001* p2—3=0,011* |
| 75—89 (2) | 2979±613 | 2692—3266 | |
| Старше 90 (3) | 2360±468 | 2025—2694 | |
В настоящем исследовании между тремя возрастными группами были установлены статистически значимые различия в количестве крупных нейронов в исследованных зонах головного мозга (табл. 3). Исходя из полученных результатов, у лиц старческого возраста и долгожителей по сравнению с лицами молодого возраста отмечалось прогрессивное уменьшение количества нейронов в черной субстанции (на 12,7% и 39,6%), базальных ядрах (на 37,3% и 47,9%), пирамидном слое гиппокампа (на 40% и 42,9%) и V слое коры (на 35,4% и 40%). Однако следует отметить, что число нейронов пирамидного слоя гиппокампа и внутреннего пирамидного слоя коры у лиц 75—89 лет по сравнению с лицами старше 90 лет снижалось незначительно (на 4,8% и 7% соответственно).
Таблица 3. Количество нейронов в различных структурах головного мозга в исследуемых возрастных группах
| Показатель | Возраст, годы | Значения | p1—2 | p1—3 | p2—3 | |
| M±SD/Me | 95% ДИ/Q1—Q3 | |||||
| Количество нейронов черной субстанции | 35—45 (1) | 346 | 328—442 | 0,030* | <0,001* | 0,001* |
| 75—89 (2) | 302 | 282—334 | ||||
| Старше 90 (3) | 209 | 190—235 | ||||
| Количество нейронов в базальных ядрах | 35—45 (1) | 169 | 134—193 | 0,004* | <0,001* | 0,014* |
| 75—89 (2) | 106 | 99—125 | ||||
| Старше 90 (3) | 88 | 83—92 | ||||
| Количество нейронов в пирамидном слое гиппокампа | 35—45(1) | 698±109 | 621—776 | 0,001* | 0,001* | 0,628 |
| 75—89(2) | 418±111 | 367—470 | ||||
| Старше 90 (3) | 398±97 | 328—468 | ||||
| Количество нейронов V слоя коры прецентральной извилины | 35—45(1) | 220 | 188—250 | 0,008* | 0,008* | 0,597 |
| 75—89(2) | 142 | 123—162 | ||||
| Старше 90 (3) | 132 | 111—156 | ||||
Следует подчеркнуть, что к сенильным изменениям можно отнести не только гибель нейронов, но и снижение их объема, сопровождающееся уменьшением не только количества вещества Ниссля в цитоплазме, но и размеров ядра [13, 14, 19]. В дальнейшем клетки приобретают угловатые контуры, происходит их гиперхромное сморщивание, тотальный хроматолиз и превращение в «клетки-тени» (рис. 1). Процесс завершается «выпадением» (гибелью) нейронов, что может носить как локальный, так и диффузный характер. В данном исследовании хроматолиз нейронов был обнаружен в 10%, 60% и 90% случаев в группах лиц 35—45 лет, 75—89 лет и старше 90 лет соответственно.
Рис. 1. Изменения нейронов коры при старении.
а — уменьшение объема цитоплазмы и ядра нейрона коры прецентральной извилины (стрелка), исчезновение апикальных дендритов; б — хроматолиз нейрона (стрелка); в — «клетка-тень» (стрелка). Окраска методом Ниссля, ×400.
Одним из характерных признаков старения является липопигментная дистрофия, проявляющаяся в виде накопления в цитоплазме нейрона липофусцина. В данном исследовании липофусцин обнаруживался не только у лиц старших возрастных групп (рис. 2), но в небольшом количестве также был выявлен в клетках молодых индивидуумов. Степень выраженности липопигментной дистрофии нейронов в зависимости от возраста отражена на рис. 3. Этот гранулярный материал желто-коричневого цвета, состоящий из протеинов, липидов и углеводов, рассматривается многими авторами как «пигмент изнашивания», возникающий в связи с нарушением окислительно-восстановительных процессов. Липофусцин нерастворим и сохраняется на протяжении всего периода существования клетки, а его количество зависит не только от давности процесса и возраста, но и от липофильности/липофобности нейронов [14, 20].
Рис. 2. Накопление липофусцина в цитоплазме нейронов коры головного мозга (стрелки).
Окраска гематоксилином и эозином, ×400.
Рис. 3. Выраженность липопигментной дистрофии нейронов в исследуемых возрастных группах.
При световой микроскопии в нейронах также в небольшом количестве выявлялись цитоплазматические и внутриядерные включения (тельца), характеризующиеся определенной формой, размером и тинкториальными свойствами. Так, в 2 случаях в группе лиц старческого возраста в цитоплазме нейронов черной субстанции были обнаружены округлые включения с плотным интенсивно окрашенным центром и более разреженной светлой аморфной периферической частью — тельца Леви (рис. 4а). Кроме цитоплазматических включений выявлены и внутриядерные тельца Маринеско, также расположенные в нигростриарных нейронах как у лиц старческого возраста (n=4), так и у долгожителей (n=4) (рис. 4б). Эти округлые включения эозинофильны, их размеры сопоставимы с ядрышком (2—10 мкм), а в их составе некоторым авторам [14, 21] удалось выявить компоненты убиквитин-протеасомной системы деградации белков.
Рис. 4. Изменения нигростриарных нейронов при старении.
а — тельца Леви с плотным интенсивно окрашенным центром и более разреженной светлой аморфной периферической частью (стрелка); б — два эозинофильных внутриядерных включения, расположенных рядом с ядрышком (тельца Маринеско) (стрелка); в — свободно расположенные гранулы нейромеланина на месте погибших нейронов (стрелки), частичная депигментация нейронов. Окраска гематоксилином и эозином, ×400.
При изучении черной субстанции обращали на себя внимание признаки гибели нигростриарных нейронов с поглощением пигмента микроглиоцитами, а на месте погибших нейронов обнаруживались остатки цитоплазмы и ядра, свободно лежащие зерна нейромеланина (рис. 4в) — высокомолекулярного пигмента, синтез которого осуществляется путем полимеризации катехоламинов [22].
При анализе соотношения плотности расположения нейронов и глиоцитов обнаружено, что у умерших в возрасте 35—45 лет величина глиального индекса была в 2,7 и 3,7 раза меньше по сравнению с лицами старческого возраста и долгожителей соответственно (табл. 4); статистически значимых различий между двумя последними группами не выявлено. Полученные результаты демонстрируют изменение соотношения между нейронами и нейроглией в сторону увеличения последней, что подтверждает дегенерацию крупных нейронов и реактивную пролиферацию глии при старении.
Таблица 4. Показатель глиального индекса в зависимости от возраста
| Возраст, годы | Me | Q1—Q3 | p |
| 35—45 (1) | 3 | 3—4 | p1—2=<0,001* p1—3=<0,001* p2—3=0,271 |
| 75—89 (2) | 8 | 5—11 | |
| Старше 90 (3) | 11 | 8—13 |
Во всех образцах, взятых у лиц 75—89 лет и лиц старше 90 лет, были обнаружены и изменения белого вещества, проявившиеся в виде мелкопористого и крупнопористого разрыхления и формирования спонгиоформного состояния ткани мозга (рис. 5а).
Рис. 5. Изменения белого вещества при старении.
а — спонгиоформное изменение белого вещества в базальных ядрах и значительное уменьшение количества олигодендроглиоцитов; б — скопление амилоидных телец, часть из которых имеют слоистую структуру, в поверхностных слоях коры прецентральной извилины, на границе с субарахноидальным пространством; в — множественные амилоидные тельца в белом веществе головного мозга. Окраска гематоксилином и эозином. а, б — ×400; в — ×80.
У лиц старческого возраста и долгожителей под эпендимой, мягкой мозговой оболочкой, вокруг интрацеребральных сосудов определялись множественные округлые базофильные структуры различной величины — амилоидные тельца, являющиеся дегенеративной формой астроцитарной глии [23] (рис. 5б, 5в).
Одним из важнейших проявлений старения ткани головного мозга на морфологическом уровне является сенильная бляшка, состоящая из центрально расположенного амилоида и дистрофически измененных отростков нейронов, глиоцитов, расположенных перифокально [14]. По результатам нашего исследования, сенильные бляшки, находящиеся преимущественно в коре, реже — в базальных ядрах (рис. 6), в небольшом количестве были обнаружены у лиц 75—89 лет (n=3) и лиц старше 90 лет (n=3).
Рис. 6. Сенильные бляшки в ткани головного мозга.
а, б — сенильные бляшки различной величины в коре прецентральной извилины (стрелки); микрососудистый конволют (звездочка). Окраска гематоксилином и эозином, ×400.
Выраженное расширение периваскулярных пространств с формированием криблюр встречалось в 30% случаев как у лиц старческого возраста, так и у долгожителей (рис. 7а). Известно, что этому процессу способствует перемещение по периваскулярным пространствам отечной жидкости, которая высвобождается при деструкции отростков астроцитов и отодвигает ткань мозга от адвентиции сосудов. Также к определенному дополнительному фактору, способствующему образованию криблюр, можно отнести и атрофические изменения головного мозга [14].
Рис. 7. Изменения сосудов головного мозга при старении.
а — расширенные периваскулярные пространства Вирхова—Робина (криблюры) в базальных ядрах, а также множественные амилоидные тельца; б, в — тонкостенные сосуды в базальных ядрах и коре полушарий большого мозга; г — формирование сосудистого конволюта в базальных ядрах; д — утолщение стенки вены за счет коллагеновых волокон (красного цвета); е — петрификаты в базальных ядрах, расположенные вокруг сосудов по типу муфты; а—г, е — окраска гематоксилином и эозином; д — окраска по Ван Гизону; а, б — ×100; в — ×400; г, д — ×80; е — ×200.
При старении значительным изменениям подвергаются и элементы сосудистой системы головного мозга, включающие интрацеребральные артерии и вены, сосуды микроциркуляторного русла (артериолы, венулы и капилляры) [14, 24, 25]. В одних сосудах отмечались прогрессирующий фиброз и утолщение стенок, запустевание их просветов, в других — истончение сосудистой стенки (рис. 7б, 7в) и потеря тонуса. Результаты исследования показали, что выраженный фиброз и утолщение стенок сосудов в 2,5 раза чаще встречались в старческой возрастной группе, чем в группе долгожителей.
По результатам данного исследования, большое количество конволютов в 2 раза чаще встречалось в группе лиц старше 90 лет, чем лиц 75—89 лет. Чаще они располагались в коре, реже их можно было выявить в базальных ядрах (см. рис. 6а, рис. 7г). Образование сосудистых конволютов при старении рассматривается рядом авторов как компенсаторный процесс в ответ на гипоксию, обусловленную нарушениями общей гемодинамики [24, 25].
При старении венозное русло подвергается ремоделированию в виде утолщения стенок, что приводит к облитерации просвета сосудов и снижению упругости сосудистой стенки. В литературе [14, 26—28] данный процесс обозначен как венозный коллагеноз, являющийся отдельным типом церебральной микроангиопатии. Необходимо отметить, что признаки выраженного венозного коллагеноза (рис. 7д) чаще были обнаружены в группе лиц старческого возраста (35% случаев) по сравнению с лицами старше 90 лет (20% случаев).
Кроме того, в нескольких образцах головного мозга, полученных от лиц как старческого возраста, так и долгожителей, в базальных ядрах обращали на себя внимание периваскулярные петрификаты (рис. 7е), возникающие, вероятно, вследствие ишемии и гипоксии и представляющие собой очаги обызвествления вокруг мелких артерий и артериол [29], однако статистически значимых различий в трех возрастных группах выявить не удалось (p=0,193).
Обсуждение
На основании вышеперечисленных данных можно сделать вывод, что старение тесно связано с уменьшением массы и объема головного мозга, а также с истончением коры полушарий большого мозга. Данные процессы закономерно приводят к атрофии извилин с расширением борозд, увеличению объема резервных пространств с формированием наружной и внутренней гидроцефалии, что во многих публикациях фигурирует под термином «сенильная атрофия» головного мозга.
Однако для целостного понимания процесса старения необходимо учитывать не только общие сенильные проявления, но и изменения, протекающие в отдельных структурах головного мозга. Между тем в публикациях, посвященных количественным и качественным инволютивным характеристикам, многие авторы выбирают объектом для исследования гиппокамп и редко выделяют несколько структурно-функциональных зон. В данной работе был проведен морфологический и морфометрический анализ не только гиппокампа, участвующего в консолидации памяти, но и различных структур, отвечающих за сложные движения. По нашим данным, кора прецентральной извилины, гиппокамп, стриатум и черная субстанция с возрастом теряют крупные нейроны и интенсивно накапливают в сохраненных нейронах липофусцин. Однако необходимо отметить, что некоторые исследования [8, 10, 13] продемонстрировали лишь незначительное снижение количества нейронов в различных зонах головного мозга человека при старении. Такое расхождение результатов можно объяснить несколькими причинами. В данном исследовании редукция нейронов в определенной степени могла быть обусловлена недостаточностью мозгового кровообращения из-за церебральной ангиопатии. Это подтверждается обнаруженными в ряде случаев очаговыми изменениями вследствие перенесенных ранее малых глубинных инфарктов, развитие которых связано с гипертонической болезнью. В свою очередь, наличие в качестве первоначальной причины смерти кардиосклероза свидетельствует в пользу кардиоэмболической этиологии перенесенных ранее малых поверхностных инфарктов. Таким образом, необходимо отметить, что невозможность полного исключения коморбидных и возраст-ассоциированных заболеваний определяет сложность изучения морфологических изменений, обусловленных исключительно сенильными проявлениями. Определенный вклад в расхождение данных могло внести и различие в методологическом подходе при морфометрии. Так, в вышеупомянутых работах при оценке результатов использовался стереологический анализ, позволяющий провести трехмерную реконструкцию исследуемых структур.
Полученные данные свидетельствуют о том, что при морфологическом исследовании вышеперечисленных функционально напряженных зон головного мозга в них были обнаружены изменения, характерные для нейродегенерации. Среди них наиболее распространенный характер имели хроматолиз, гиперхроматоз и сморщивание нейронов. В то же время цитоплазматические тельца Леви и внутриядерные тельца Маринеско были обнаружены лишь в единичных нейронах черной субстанции, а в неокортексе в небольшом количестве определены сенильные бляшки.
Как известно, при старении отмечаются выраженные изменения не только нейронов, но и нейроглии в виде репаративного («заместительного») глиоза, что в нашем исследовании подтверждено значительным увеличением глиального индекса у лиц старческого возраста и долгожителей. Полученные данные согласуются с данными исследователей [7, 13, 14], показавших, что по мере прогрессирования гибели крупных нейронов возможно компенсаторное увеличение популяции глии. Возникающие участки разрежения замещаются глиальными элементами по типу изоморфного или анизоморфного глиоза [14, 23]. В первом случае пролиферирующие и гипертрофированные астроциты повторяют контуры анатомических структур, а при анизоморфном глиозе они располагаются хаотично [23]. При этом дегенеративные изменения астроцитарной глии сопровождаются формированием большого количества амилоидных телец вокруг интрацеребральных сосудов и на границе с субарахноидальным пространством.
Также в исследовании были обнаружены и изменения белого вещества, характерные для старения. К таким проявлениям сенильных изменений можно отнести формирование спонгиоформной структуры белого вещества, утрату олигодендроцитов, расширение периваскулярных пространств с формированием криблюр.
В данной работе помимо исследования нервной ткани были выделены изменения церебральных сосудов при возрастной инволюции, которые включают артериолосклероз, истончение стенок сосудов, утрату капилляров, сосудистые конволюты, развитие венозного коллагеноза и периваскулярные петрификаты.
Заключение
Морфологические изменения и морфометрические характеристики, обнаруженные в различных возрастных группах при старении, феноменологически сходны с определенной совокупностью морфологических изменений при нейродегенеративных заболеваниях позднего возраста и отличаются от них главным образом количественно, а их механизмы требуют дальнейшего изучения.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — А.С. Магнаева, Т.С. Гулевская, П.Л. Ануфриев
Сбор и обработка материала — А.С. Магнаева, Т.И. Баранич
Статистическая обработка — А.С. Магнаева
Написание текста — А.С. Магнаева, Т.С. Гулевская, В.С. Сухоруков
Редактирование — Т.С. Гулевская, В.С. Сухоруков
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.