Комменсальные бактерии, входящие в состав нормальной микрофлоры глазной поверхности (ГП), играют важную роль в поддержании гомеостаза. Они способны препятствовать развитию воспалительных заболеваний роговицы, действуя опосредованно во взаимосвязи с эпителиальными и иммунными клетками ГП [1].

Количественная и качественная характеристики нормальной микрофлоры ГП изучаются с начала XX века до наших дней. Одним из первых понятие о нормальной микрофлоре глаза в 1907 г. ввел T. Axenfeld [2], а в 1930 г. было дано одно из первых описаний микробиоты ГП с использованием культуральных методов для идентификации микробиального сообщества [3]. Следует отметить: в последнее время все чаще высказывается точка зрения, что традиционные методы микробного культивирования все же позволяют наблюдать лишь часть микробиоты глаза из-за невозможности обнаружить некультивируемые бактерии.

На текущий момент большинство данных о нормальной микрофлоре ГП получено с использованием невизуальных генетических методов исследования [4—17], которые позволяют выявить в том числе и некультивируемые бактерии. Стоит упомянуть, что чрезвычайная чувствительность метода амплификации, применяемого при секвенировании, увеличивает вероятность обнаружения клинически нерелевантных или загрязняющих последовательностей. Кроме того, использование различных методов фильтрации данных секвенирования и разные статистические методы могут иметь значительное влияние на извлеченные типы и роды [18]. Получение данных о микробиоме ГП также сопряжено с решением довольно сложной задачи обработки получаемого с ГП малого количества анализируемого вещества с низкой долей полезной биомассы, а также высоким риском контаминации таких образцов [19]. Малое количество вещества пробы вынуждает исследователей увеличивать число циклов амплификации для наращивания массы ДНК. Это приводит к увеличению количества спонтанных замен и появлению в результатах анализа видов и родов микроорганизмов, не существующих в исходном веществе.

Значимое влияние на получаемое разнообразие оказывает техника проведения исследований. Показано, что риск контаминации образцов кожной микрофлорой снижает использование при проведении метагеномного секвенирования различных накопителей вещества ГП, в частности, жестких контактных линз (ЖКЛ) [19].

Если опустить фактор влияния различных методик на итоговый результат, то считается, что микробиом ГП в норме характеризуется относительно низкой вариабельностью [18]. Однако существуют сведения, что определенные различия состава микрофлоры могут зависеть от пола и возраста [20], ношения контактных линз [21—24], а при возникновении патологических процессов — от климата, географического местоположения и социально-экономического развития региона [25]. Снижение местного и общего иммунитета также может влиять на количественный и качественный состав микрофлоры [10].

Продолжают проводиться исследования, посвященные влияющим на качественный и количественный состав микробиоты ГП факторам, среди которых встречаются сахарный диабет, синдром сухого глаза. К плюсам таких исследований относится не только то, что выявляются потенциальные изменения микробиома ГП в группах условной патологии, но и то, что по таким исследованиям уточняется нормальное микробиальное окружение в группах условной нормы.

Также продолжаются активные исследования влияния контактных линз на микробиом ГП. В недавнем исследовании микробного окружения ГП, проведенном методом амплификации 16S РНК, сообщалось, что не обнаружено значительной разницы в составе микробиоты ГП у пользователей контактных линз в сравнении с контрольной группой [26]. Однако при использовании этого же метода в другом исследовании [21] было обнаружено, что микробиом ГП у пользователей контактных линз более приближен к микробиому кожи.

Исходя из противоречивости данных о микрофлоре, получаемых разными методами, актуальной становится разработка новых оригинальных методик, позволяющих так или иначе дополнить уже существующие сведения о нормальной микрофлоре глаза.

На текущий момент хорошо изучены возможности классической импрессионной цитологии (ИЦ) в диагностике заболеваний ГП. Метод классической ИЦ заключается в аппликации адгезирующего носителя на ГП с частичным захватом верхних слоев эпителия конъюнктивы и роговицы, включая группы клеток человека, компоненты слезы, микроорганизмы и случайные частицы окружающей среды. Клетки, полученные с помощью такой техники, впоследствии могут быть изучены гистологически, иммуногистохимически, а также с помощью молекулярного анализа. Традиционно импрессионная проба изучается методом световой микроскопии, однако разрешение оптической микроскопии может не позволить визуализировать индивидуальные особенности клеток и микроорганизмов. Для увеличения информативности ИЦ мы предложили разработанный в ФГБНУ «НИИГБ» протокол окрашивания биологических образцов солями тяжелых металлов, позволяющий выявить индивидуальные признаки разных микроорганизмов при дальнейшей их визуализации при помощи сканирующего электронного микроскопа (СЭМ).

Оригинальный метод подготовки импрессионной пробы к визуализации основывается на способности живой клетки метаболизировать осмотически сбалансированный раствор, содержащий хлорид элемента группы лантанидов. Лантаноиды являются универсальными заместителями кальция в биологических и минеральных системах. Помимо этого они способны связываться с фосфат-анионами, а продукт их связывания (LnPO₄) устойчив во внутри- и внеклеточных композициях. Дополнительным шагом является контрастирование образца солями свинца, в процессе которого лантаноиды в образовавшихся фосфатах замещаются этим элементом, одновременно «окрашиваются» липофильные структуры. В результате этого при получении изображения вещества пробы с использованием СЭМ в режиме обратного рассеяния электронов удается с достаточной контрастностью увидеть не только внешние очертания объектов, но и особенности их внутреннего строения и метаболизма.

В связи с необходимостью дополнения сведений о микробиоме ГП и заявленным потенциалом использования для этого СЭМ с лантаноидым контрастированием целью настоящей работы явилось определение возможности ИЦ с выходом на СЭМ для оценки нормальной микрофлоры глазной поверхности.

Материал и методы

В исследовании приняли участие 22 добровольца (22 глаза; возраст —23,0 [21,0; 27,0] года), являющиеся аспирантами и сотрудниками ФГБНУ «НИИГБ». Критериями исключения были: возраст младше 18 лет, сопутствующие заболевания (сахарный диабет, гипертоническая болезнь), выраженный синдром сухого глаза, воспалительные и дистрофические заболевания ГП и придаточного аппарата глаза (кератит, конъюнктивит, блефарит), сопутствующие общие заболевания, использование местных и системных антибиотиков за 2 нед до исследования.

Импрессионную пробу выполняли с использованием гибких пластиковых покровных стекол, обычно используемых в медико-биологических исследованиях в качестве носителя при культивировании клеток. Их дугообразно изогнутую поверхность прикладывали к поверхности глаза. Местная анестезия не требовалась, поскольку процедура доставляла всем испытуемым лишь незначительный дискомфорт.

Для подготовки к сканирующей электронной микроскопии использовали серийно выпускаемый набор реактивов BioREE-B (ООО «ГЛАУКОН», Россия), содержащий растворы солей неодима и свинца. Образцы промывали в изотоническом растворе на основе хлорида неодима. Для насыщения образца контрастирующим веществом экспозиция продолжалась в течение 10 мин при 37 °C. Далее образец промывали для удаления излишков хлорида неодима и обрабатывали pH-нейтральным нормотоническим водным раствором уксуснокислого свинца. Визуализацию осуществляли на СЭМ Zeiss EVO LS10 (Zeiss, Германия). Использовали катод LaB₆. Пластиковый носитель с подготовленным образцом размещали на предметном столике микроскопа. Наблюдение проводилось в режиме низкого вакуума (EP, 70 Па) при ускоряющем напряжении 21 кВ и токе на образце 22—63 пА с использованием детектора обратно-рассеянных электронов (BSE).Изображения 1024×768 пискелей захватывались с разрешениями 21,2 и 58,12 нм/пискель.

Результаты

Частота обнаружения микроорганизмов в пробе. По результатам визуализации в большинстве проб (16 из 22) помимо слущенных клеток эпителия были обнаружены коккоморфные, палочковидные или грибоподобные микроорганизмы в различных комбинациях. В трех пробах были визуализированы исключительно коккоморфные микроорганизмы, в семи — исключительно палочковидные, в одной — исключительно грибоподобные. В двух пробах были обнаружены коккоморфные и палочковидные микроорганизмы, в двух — коккоморфные и грибоподобные, в одной — палочковидные и грибоподобные. Таким образом, коккоморфные и палочковидные организмы выявлялись нами с относительно равной частотой. В шести пробах из 22 не удалось визуализировать объекты, которые можно было бы идентифицировать в качестве микробиального окружения.

Характеристика ассоциации микроорганизмов и клеток эпителия. Слущенные эпителиальные клетки на поверхности адгезивного носителя были визуализированы во всех взятых пробах. При этом нередко микроорганизмы локализовались на поверхности эпителиальных клеток (рис. 1). Со структурами цитоплазматической мембраны эпителия механически связаны были как мелкие палочковидные (см. рис. 1, прерывистые стрелки), так и коккоморфные микроорганизмы (см. рис. 1, сплошные стрелки). Крупных палочковидных микроорганизмов на поверхности эпителиальных клеток обнаружено не было. Помимо микроорганизмов на изображениях в высоком разрешении визуализировались элементы ультраструктуры эпителиальных клеток, в том числе клеточное ядро (см. рис. 1, г, звездочка) и ядрышко (см. рис. 1, г, выноска). При беглом анализе изображений эти структурные элементы могут мимикрировать под микроорганизмы, что требует дополнительного внимания оператора при расшифровке.

Рис. 1. Изображение ассоциированных с роговичным эпителием микроорганизмов, полученное с помощью СЭМ (BSE). Масштабный отрезок равен 2 мкм.

а — палочковидные бактерии (прерывистые стрелки) на поверхности роговичного эпителия; б — близкорасположенные одиночные коккоморфные бактерии (сплошные стрелки) на поверхности роговичного эпителия; в — одиночная палочковидная бактерия (прерывистая стрелка) на поверхности роговичного эпителия, сплошная стрелка указывает на локализованный вне области эпителиальной клетки коккоморфный микроорганизм; г — одиночные коккоморфные микроорганизмы (сплошные стрелки) на поверхности роговичного эпителия, звездочкой маркирована область ядра клетки, выноской обозначен диаметр ядрышка клетки.

Нами подтверждено, что высокой степенью адгезии к эпителию ГП обладают коккоморфные микроорганизмы [27], и обнаружено, что мелкие палочковидные микроорганизмы также способны адгезироваться на поверхности эпителия ГП. Крупные палочковидные микроорганизмы такой способностью, по нашим данным, не обладают.

Характеристика коккоморфных микроорганизмов. В семи пробах из 22 были визуализированы коккоморфные микроорганизмы диаметром от ≈0,9 до ≈1,5 мкм (рис. 2). Коккоморфные организмы были представлены в основном в виде групп и индивидов, связанных с поверхностью эпителиальных клеток (см. рис. 2, а—г), но также встречались и в свободном состоянии (см. рис. 2, д, е).

Рис. 2. Изображения коккоморфных микроорганизмов, полученных с помощью СЭМ (BSE). Масштабный отрезок равен 1 мкм.

а — одиночный коккоморфный микроорганизм с четкими контурами на поверхности эпителиальной клетки, диаметр ≈1,3 мкм; б — близкорасположенные одиночные коккоморфные микроорганизмы на поверхности эпителиальной клетки, диаметр ≈0,9—1,2 мкм; в — близкорасположенные одиночные коккоморфные микроорганизмы на поверхности эпителиальной клетки, диаметр ≈1,0—1,5 мкм; г — делящиеся коккоморфные микроорганизмы, стрелками обозначена область деления, диаметр ≈1,2—1,5 мкм; д — делящиеся коккоморфные микроорганизмы (коккобациллы), стрелками обозначены яркие локусы на поверхности микроорганизма, соотношения диаметров ≈1,2—1,3.

Микроорганизмы обнаруживались как одиночно (см. рис. 2, д, е), так и попарно. При этом стоит отметить, что парное расположение может быть характерно для представителей рода Micrococcus, обнаруживаемых на ГП с помощью культуральных методов [28], а также при метагеномном секвенировании при условии использования ЖКЛ в качестве носителя и накопителя биомассы [19].

Среди коккоморфных микроорганизмов были представлены такие, соотношение диаметров которых превышало значение 1,2 (см. рис. 2, д). Такое соотношение позволяет причислить микроорганизмы к коккобациллам, к которым относятся представители рода Acinetobacter и Paracoccus, выявляемые на ГП при метагеномном секвенировании [17, 19].

Стоит отметить, что коккоморфных организмов, расположенных цепочкой, которая характерна для представителецй рода Streptococcus (выявляемых на ГП при использовании и культуральных методов [28], и метагеномного секвенирования [17]), визуально обнаружить не удалось. Однако пары бактериальных клеток, деление которых произошло вдоль большего диаметра коккобациллы, могут также соответствовать представителям этого рода бактерий.

Характеристика палочковидных микроорганизмов. В 10 пробах из 22 были визуализированы разнообразные палочковидные микроорганизмы длиной от ≈1 до ≈7,3 мкм, шириной от ≈0,4 до ≈1,3 мкм (рис. 3).

Рис. 3. Изображения палочковидных микроорганизмов, полученных с помощью СЭМ (BSE). Масштабный отрезок равен 1 мкм.

а — одиночный палочковидный микроорганизм, длина ≈1 мкм, ширина ≈0,5 мкм; б — одиночный палочковидный микроорганизм, стрелками обозначены яркие контуры на полярных концах, длина ≈5 мкм, ширина ≈1,3 мкм; в — одиночный палочковидный микроорганизм на поверхности эпителиальной клетки, длина ≈1,6 мкм, ширина ≈0,8 мкм; г — одиночный палочковидный микроорганизм, длина ≈7,3 мкм, ширина ≈0,7 мкм; д — одиночный асимметричный палочковидный микроорганизм, длина ≈4,2 мкм, ширина ≈0,8 мкм, стрелкой указано утолщение на одном из полюсов; е — одиночный палочковидный микроорганизм, длина ≈1,3 мкм, ширина ≈0,4 мкм, стрелками указаны яркие локусы на полярных концах микроорганизма; ж — группа палочковидных бактерий, формирующих цепочку. Длина одного микроорганизма ≈2,2—3 мкм, ширина ≈0,7 мкм, сплошными стрелками обозначены границы микроорганизмов, прерывистой стрелкой обозначены темные локусы, расположенные центрально и субтерминально; з — слегка изогнутый тонкий одиночный палочковидный микроорганизм, длина ≈4,5 мкм, ширина ≈0,4 мкм; и — одиночная слегка изогнутая бобовидная палочковидная бактерия с ярким выгнутым контуром, длина ≈2,4 мкм, ширина ≈0,8 мкм.

И по данным культуральных методов [28] и по результатам метагеномного секвенирования [17], наиболее встречающимися палочками среди нормального микробиома считаются представители рода Corynebacterium. Одной из основных характеристик рода Corynebacterium являются биполярно расположенные внутриклеточные хранилища комплексного неорганического полифосфата — волютина [29]. При окрашивании BioREE-B вследствие связывания фосфатных остатков с неодимом такие локусы должны обладать повышенной яркостью на изображениях в обратно-рассеянных электронах. По нашим данным, среди палочковидных бактерий обнаруживались палочки с характерными точечными яркими локусами, расположенными биполярно (см. рис. 3, е), такие палочковидные бактерии по описанному признаку можно отнести к представителям рода Corynebacterium. Стоит отметить, что не все представители рода Corynebacterium могут обладать зернами волютина, вследствие чего потенциальных представителей этого рода среди обнаруженных нами палочковидных микроорганизмов может быть больше.

По данным метагеномного секвенирования, относительно часто на ГП встречаются представители рода Pseudomonas [17], которые по визуальным признакам можно охарактеризовать как одиночные палочковидные бактерии длиной 2—3 мкм и шириной до 1 мкм (см. рис. 3, б). Их характерной особенностью являются четкие контуры бактериальной клетки и слабо изогнутая бобовидная форма [30] — такая, как у палочковидного микроорганизма на рис. 3, и.

По полученным нами визуализационным данным, палочковидные микроорганизмы с длиной, превышающей 4 мкм (см. рис. 3, б, г, д, з), могут значительно варьировать по толщине. Относительно тонкие крупные палочковидные бактерии шириной ≈0,4 мкм (см. рис. 3, з) могут принадлежать к роду Mycobacterium, представителей которого можно обнаружить среди нормальной микрофлоры, по данным метагеномного секвенирования [19]. Крупные палочковидные микроорганизмы с шириной, превышающей 0,7 мкм, могут принадлежать к представителям рода Propionibacterium, которые выявляются при культивировании [28], и представителям рода Gluconacetobacter, выявляемым с помощью метагеномного секвенирования при условии использования ЖКЛ в качестве носителя и накопителя биомассы [19]. При этом стоит отметить, что представители рода Propionibacterium могут иметь «булавовидную форму» с одним концом закругленным, а с другим — суженным [31]. Такая асимметрия наблюдается у палочковидного микроорганизма, представленного на рис. 3, д.

Бактерии рода Bacillus — спорообразующие палочковидные клетки, располагающиеся цепочкой (стрептобациллы), — с определенными оговорками можно рассматривать как представителей нормальной микрофлоры ГП (по данным метагеномного секвенирования [17]). Отличительной особенностью внутриклеточных спор является их способность к тепловому расширению при сканировании электронным пучком, вследствие чего они темнеют, увеличиваются и деформируют бактериальную клетку непосредственно во время анализа. Такие обособленные внутриклеточные структуры с пониженной яркостью можно наблюдать у микроорганизмов на рис. 3, ж (прерывистые стрелки), что позволяет условно отнести их к спорообразующим стрептобациллам.

Характеристика грибоподобных микроорганизмов. В четырех пробах из 22 были визуализированы микроорганизмы, которые морфологически сходны с дрожжеподобными грибами, представляющими собой сферические или овоидные клетки размером 3—5 мкм (рис. 4). Следует отметить, что такие объекты можно перепутать с другими относительно крупными объектами, такими как компактизированное ядро десквамированного эпителия, диаметр которого (см. рис. 1, г) может совпадать с диаметром грибковой клетки.

Рис. 4. Изображения, полученные с помощью СЭМ (BSE). Масштабный отрезок равен 2 мкм.

а — одиночный грибоподобный микроорганизм, диаметр ≈3 мкм; б — одиночный грибоподобный микроорганизм, размер ≈3,6×4 мкм; в — одиночный грибоподобный микроорганизм, диаметр ≈2,3 мкм.

Обсуждение

В связи с тем, что метод импрессионной пробы с выходом на СЭМ является относительно новым, получаемые с его применением данные могут не совпадать с данными других методов. Одним из методов сравнения может быть оценка сопоставимости частоты обнаружения микроорганизмов в импрессионной пробе при ее визуализации на СЭМ с использованием лантаноидного контрастирования в сравнении с другими широко используемыми методами исследования микробиома. Считается, что метагеномное секвенирование при условии достаточного объема анализируемого материала позволяет получить информацию о микроорганизмах с частотой обнаружения, достигающей 100%. В свою очередь, частота выявления бактериального компонента нормального микробиома ГП при использовании традиционного метода микробного культивирования составляет <80% [32], а частота обнаружения грибковой микрофлоры культуральным методом в норме варьирует от 3 до 28% [33—36]. Таким образом, частота обнаружения микробиальной составляющей ГП визуальным методом, представленным в настоящем исследовании, сопоставима с частотой выявляемости нормального микробиома при применении метода микробного культивирования. Это может быть связано с тем, что при метагеномном секвенировании значительная, если не большая, выявляемая доля микробиального разнообразия может быть следствием появления ложноположительных результатов, обусловленных самой технологией проведения анализа.

Разные методы исследования микробиома дают разное представление о доминирующих микроорганизмах ГП. По данным культуральных методов, доминирующей флорой является коккоморфная — стафилококковая. Консенсусным мнением о том, какие микроорганизмы представлены в норме на ГП, по данным культуральных методов, является то, что на ГП присутствуют представители родов (в порядке убывания частоты выявляемости): Staphylococcus, Corynebacterium, Streptococcus, Propionibacterium и Micrococcus [28]. По данным метагеномного секвенирования, доминирующими на ГП являются палочковидные бактерии. Систематический анализ данных метагеномного секвенирования [4—16] говорит о том, что коровой (основной, с относительной численностью не менее 1%) микрофлорой ГП являются представители родов (в порядке убывания): Corynebacterium, Acinetobacter (коккобациллы), Pseudomonas, Staphylococcus, Propionibacterium и Streptococcus, Bacillus (?) [17]. В этом отношении интересно отметить, что настоящее исследование прямо не подтверждает ни данные культуральных исследований, говорящие о доминирующих в микробиоме кокковых микроорганизмах, ни данные метагеномного секвенирования, свидетельствующие о том, что доминирующими в микробиоме ГП являются палочковидные бактерии. При визуализации импрессионной пробы на СЭМ с использованием лантаноидного контрастирования коккоморфные и палочковидные организмы выявлялись с относительно равной частотой. При этом стоит отметить, что микроорганизмы на полученных в настоящем исследовании изображениях по своим морфологическим характеристикам в целом совпадали с описанием тех микроорганизмов, которые идентифицируются на ГП невизуальными методами: культуральным и метагеномным секвенированием.

Заключение

Впервые с помощью импрессионной пробы и использованием СЭМ удалось быстро и с высоким разрешением визуализировать клеточную и микробиотическую составляющую ГП. Удалось проиллюстрировать существующее в норме морфологическое разнообразие микроорганизмов ГП и особенности локализации отдельных микробов по отношению к клеткам эпителия. При этом изображения в настоящем исследовании, характеризующие представленность микробиома глаза, совпали с приводимыми в литературе данными исследований, в которых информацию о микробиоме получали невизуальными методами.

Было показано, что частота обнаружения микробиальной составляющей ГП «визуальным» методом, представленным в настоящем исследовании, сопоставима с частотой выявляемости микробиома при применении метода микробного культивирования (<80%). Коккоморфные и палочковидные микроорганизмы выявлялись с относительно одинаковой частотой, при этом коккоморфные организмы были представлены в основном в ассоциации с клетками эпителия. Показано морфологическое разнообразие палочковидных микроорганизмов.

Результаты исследования могут быть использованы в качестве визуального референса нормального микробиома глаза. Предложенные подходы можно использовать и для диагностики инфекционной патологии ГП. Воспроизводимость получаемых с помощью лантаноидного контрастирования индивидуальных признаков микроорганизмов позволяет рекомендовать получаемые этим методом изображения для объективной интерпретации посредством машинной диагностики, что сделает доступной лабораторную диагностическую методику на основе ИЦ и СЭМ.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: И.Н., А.С., Е.Ф.

Сбор и обработка материала: Е.Р., М.К., О.П.

Статистическая обработка: М.К., И.Н.

Написание текста: М.К., Е.Р., О.П.

Редактирование: И.Н.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.