引用本文: 朱双龙, 段会全, 刘英富, 李光宗, 刘迎节, 黄梦强, 陈旭义, 徐云强. 柴胡皂苷 a 对大鼠急性脊髓损伤的神经保护作用与机制研究. 中国修复重建外科杂志, 2017, 31(7): 825-829. doi: 10.7507/1002-1892.201702106 复制
近年来,脊髓损伤发病率不断增加,临床上对脊髓损伤病理机制的理解和早期治疗等方面取得了一些进展,但成果均不理想[1]。目前观点认为,脊髓损伤后引起的继发性损伤导致的组织出血、水肿、细胞凋亡、免疫炎症等级联反应对脊髓神经组织的破坏具有重要作用并影响预后,其中炎性反应在脊髓继发性损伤中扮演了重要角色[2]。脊髓损伤后组织水肿、血管-脊髓屏障损伤和神经元坏死与炎性反应密切相关,神经再生被抑制[3]。炎性反应刺激以及微血管破坏激发了水通道蛋白 4(aqua-porin 4,AQP4)高表达,加重了神经细胞水肿,加速细胞凋亡[4]。
随着我国传统中医学的发展,中医药对脊髓损伤治疗的作用越来越被重视[5-7]。柴胡皂苷 a(saiko-saponin a,SSa)是源自柴胡的主要活性成分,分子式为 C42H68O13,相对分子质量为 780.98,其药理学作用广泛,具有抗炎、免疫调节及抗菌等作用[8]。近年研究发现,SSa 在颅脑创伤后能显著降低脑组织水肿蛋白 AQP4 表达,具有抗氧化应激反应和抗炎性反应,从而促进神经功能恢复,但相关作用机制仍未明确[9]。
本实验通过建立大鼠脊髓损伤模型,腹腔注射 SSa,观察比较损伤脊髓组织形态结构变化以及水肿蛋白 AQP4、蛋白 NF-κB P65、蛋白 NF-κB P-P65、炎性因子表达情况,探讨 SSa 对大鼠脊髓损伤后的保护作用机制,为预防和治疗脊髓损伤提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年雌性 SD 大鼠 72 只,体质量 220~250 g,由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所提供。
一抗大鼠 NF-κB P65、NF-κB P-P65、AQP4 抗体(Abcam 公司,美国);SSa(上海源叶生物科技有限公司);TNF-α ELISA、IL-6 ELISA 抗体和相关试剂盒(武汉六合生物技术有限公司)。4℃ 低温离心机(Eppendorf 公司,德国);酶标仪(Thermo Fisher Scientific 公司,芬兰);CO2 细胞培养箱(Forma Scientifis 公司,美国);高压灭菌箱(山东新华医疗器械有限公司);快速组织细胞破碎仪(上海净信科技有限公司);倒置相差显微镜(Nikon 公司,日本)。
1.2 实验分组及方法
将 SD 大鼠随机分为 3 组:假手术组(A 组)、脊髓损伤组(B 组)和 SSa 处理组(C 组),每组 24 只。A 组大鼠以 5% 水合氯醛(0.6 mL/100 g)腹腔注射麻醉后,仅切除 T9~T11 椎板,不作其他处理。B、C 组参考文献[2,6]方法,利用改良 Allen 重物打击法制作大鼠脊髓损伤模型:同上法麻醉大鼠后,沿肩胛骨向下逐个计数直至定位 T10;以 T10 为中心逐层分离,暴露 T9~T11 节段,使用微型咬骨钳咬除 1/2(T9~T11)棘突及其两侧椎板暴露脊髓。将重 10 g、直径 2.5 mm 打击锤定位打击位置于 T10 节段,高度调整为 5 cm 后打击;打击后见大鼠双后肢抽动、甩尾,随后完全松弛,提示造模成功。C 组于造模后即刻用 5 mL 无菌注射器经腹部表皮斜刺进针,之后垂直入针,回抽判断是否回血,无回血则给予大鼠腹腔注射 SSa(10 mg/kg)1 次(根据文献[9],本实验选择 5、10、20 mg/kg 药物浓度进行比较,确定 10 mg/kg 为最优药物浓度选择);BBB 评分和斜板实验大鼠每天腹腔注射 1 次,连续 1 周。B 组注入等量生理盐水。术后大鼠单笼饲养,防止感染。术后 24 h 各组分别取 18 只大鼠同上法麻醉后,取损伤节段脊髓组织保存待测;每组其余 6 只大鼠采用 BBB 评分和斜板实验评价双下肢运动恢复情况。
1.3 观测指标
1.3.1 BBB 评分 术后 1、3、7、14、21、28 d 采用 BBB 评分评价各组大鼠后肢运动功能,取每只大鼠左右侧肢体评分均值作为最终评分。
1.3.2 斜板实验 术后 1、3、7、14、21、28 d 进行斜板实验,在斜板上将鼠头朝向上、下、左、右,记录其保持 5 s 的最大角度。
1.3.3 ELISA 检测 取出保存的各组脊髓组织,加入 PBS 溶液后,在组织细胞破碎仪中以 900×g 匀浆 6 min,低温条件下(4℃)以 450×g 离心 20 min;取上清液,按照 TNF-α、IL-6 ELISA 试剂盒说明书进行操作,加终止液后混匀,酶标仪进行检测,测量脊髓组织中炎性因子 TNF-α、IL-6 表达浓度。
1.3.4 Western blot 检测 取出保存的各组脊髓组织,称重后加入一定量蛋白裂解液,放置于组织细胞破碎仪中研磨,充分裂解;以 12 000×g 离心 15 min,取出上清,BCA 法测定总蛋白浓度。经过加样、电泳、转膜、封闭、一抗 1∶5 000 孵育过夜,二抗 1∶10 000 孵育 1 h,加入显色剂显色,以 GAPDH 作为内参。显影仪显影,Image J 软件测算蛋白灰度值,计算目的蛋白 NF-κB P65、NF-κB P-P65 和 AQP4 蛋白与 GAPDH 灰度值的比值,作为其相对表达量。
1.3.5 HE 染色观察 术后 24 h 采用多聚甲醛灌注,取出各实验组脊髓组织,置于 4% 多聚甲醛固定 48 h,石蜡包埋,从损伤脊髓中心部位连续切片,片厚 5 μm,行 HE 染色,倒置相差显微镜下观察脊髓损伤处灰质区的形态学改变。
1.4 统计学方法
采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用 LSD 检验;检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 BBB 评分和斜板实验
术后各组大鼠均顺利存活至实验完成,切口无红肿等感染表现。术后各时间点 A 组 BBB 评分和斜板实验最大角度均显著高于 B、C 组,差异有统计学意义(P<0.05);术后 14、21、28 d C 组上述指标显著高于 B 组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图 1、2。
2.2 ELISA 检测
A、B、C 组 TNF-α 浓度分别为(124.90±16.16)、(622.30±21.61)、(384.50±16.22)pg/mL,IL-6 浓度分别为(77.30±16.41)、(197.50±4.59)、(127.10±10.69)pg/mL。A 组 TNF-α、IL-6 浓度显著低于 B、C 组,C 组显著低于 B 组,差异均有统计学意义(P<0.05)。
2.3 Western blot 检测
A 组 NF-κB P65、NF-κB P-P65 和 AQP4 蛋白相对表达量均显著低于 B、C 组,C 组均显著低于 B 组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图 3、表 1。
2.4 HE 染色观察
A 组脊髓中神经细胞正常,无明显病变;B 组脊髓中损伤部位可见神经元细胞,损伤处有出血、中性粒细胞浸润、神经细胞水肿;C 组脊髓中可见神经元细胞,小胶质细胞轻度增生,病变较 B 组好转。见图 4。
3 讨论
脊髓受损后一定程度的炎性反应对机体可起到一定的防御保护作用[10]。然而,包括脊髓在内的中枢神经系统轴突再生及受损神经元的补充能力有限;因此脊髓损伤后炎症所产生的不利影响比其他组织更明显[11]。有研究指出,TNF-α 和 IL-6 是重要的促炎因子,其中 TNF-α 是一个关键性因子,介导上游下游多种炎症信号通路[12-13]。徐玉生等[14]研究表明,脊髓损伤后 1 h,TNF-α 表达显著增强,损伤后 12 h 表达最高。TNF-α、IL-6 等炎性因子大量表达后,进一步加重局部炎性反应,导致细胞凋亡[2, 15]。本研究发现,与 A 组相比较,B 组 TNF-α、IL-6 表达水平明显升高(P<0.05),说明脊髓损伤后发生炎性反应。进行 SSa 治疗后,C 组 TNF-α、IL-6 表达水平较 B 组降低(P<0.05),说明 SSa 可抑制脊髓损伤后炎性反应,从而改善机体炎性反应,发挥神经保护作用。
由同源和异源二聚体组成的 NF-κB 是一种参与调节炎症和细胞存活反应相关基因表达的转录因子[16]。正常情况下,NF-κB 普遍存在于真核细胞,经一定刺激后可迅速对有害细胞作出反应,参与炎性反应,上调包括 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 及氧自由基等一系列炎性介质[15, 17]。有文献报道,在脊髓损伤中 NF-κB 信号通路是调控炎性反应的主要影响信号途径,从而影响炎性反应的进程[2]。Bethea 等[18]发现在脊髓损伤后 30 min NF-κB 开始异常活化,24 h 达高峰,并且在神经元中发现了 NF-κB 和其目标基因产物诱导型 NO 合成酶的共定位染色。因此,抑制 NF-κB 信号通路蛋白基因表达可减轻脊髓损伤后炎性反应,从而改善脊髓损伤后的功能恢复[19]。本实验研究发现,B 组 NF-κB 信号通路蛋白 P65 和 P-P65 表达水平较A组明显提高(P<0.05);对 C 组进行 SSa 治疗后,NF-κB 信号通路蛋白 P65 和 P-P65 表达水平较 B 组降低(P<0.05)。综上,实验结果提示 SSa 可通过抑制 NF-κB 炎性信号通路减轻脊髓损伤后炎性反应,从而发挥保护神经作用。
AQP4 是中枢神经系统调节水通透性的主要分子途径,主要分布于星形胶质细胞的终足和血管内皮细胞,目前已成为脊髓损伤的研究热点[20]。无论是脑还是脊髓损伤后,AQP4 的表达都会发生明显变化,从而影响组织中的血管源性水肿和细胞毒性水肿的发生、发展[21]。Ito 等[22]等研究表明,NF-κB 作为重要的核转录因子,阻断其信号通路能明显抑制 IL-1β 诱导的脑 AQP4 蛋白及其 mRNA 的表达,说明 NF-κB 活性的改变参与了 AQP4 的表达调控。此外,李野[23]在大鼠脊髓损伤实验研究中证明,NF-κB 信号通路参与了脊髓损伤后 AQP4 的表达调节以及脊髓水肿的形成。本实验 AQP4 的表达结果与上述文献一致,与 A 组正常脊髓组织比较,脊髓损伤后 B 组 AQP4 表达水平明显提高(P<0.05);给予 SSa 治疗后,C 组 AQP4 表达水平较 B 组下降(P<0.05),说明该药物可减轻脊髓损伤后组织水肿,从而发挥神经保护作用。
综上述,本研究发现 SSa 对脊髓损伤后的脊髓具有一定神经保护作用。其可能作用机制是通过抑制 NF-κB 信号通路和 AQP4 蛋白的表达,降低脊髓损伤后早期机体炎性因子的水平,从而减轻机体炎性反应和组织水肿。本研究结果能够对脊髓损伤的治疗提供一定思路和依据。
近年来,脊髓损伤发病率不断增加,临床上对脊髓损伤病理机制的理解和早期治疗等方面取得了一些进展,但成果均不理想[1]。目前观点认为,脊髓损伤后引起的继发性损伤导致的组织出血、水肿、细胞凋亡、免疫炎症等级联反应对脊髓神经组织的破坏具有重要作用并影响预后,其中炎性反应在脊髓继发性损伤中扮演了重要角色[2]。脊髓损伤后组织水肿、血管-脊髓屏障损伤和神经元坏死与炎性反应密切相关,神经再生被抑制[3]。炎性反应刺激以及微血管破坏激发了水通道蛋白 4(aqua-porin 4,AQP4)高表达,加重了神经细胞水肿,加速细胞凋亡[4]。
随着我国传统中医学的发展,中医药对脊髓损伤治疗的作用越来越被重视[5-7]。柴胡皂苷 a(saiko-saponin a,SSa)是源自柴胡的主要活性成分,分子式为 C42H68O13,相对分子质量为 780.98,其药理学作用广泛,具有抗炎、免疫调节及抗菌等作用[8]。近年研究发现,SSa 在颅脑创伤后能显著降低脑组织水肿蛋白 AQP4 表达,具有抗氧化应激反应和抗炎性反应,从而促进神经功能恢复,但相关作用机制仍未明确[9]。
本实验通过建立大鼠脊髓损伤模型,腹腔注射 SSa,观察比较损伤脊髓组织形态结构变化以及水肿蛋白 AQP4、蛋白 NF-κB P65、蛋白 NF-κB P-P65、炎性因子表达情况,探讨 SSa 对大鼠脊髓损伤后的保护作用机制,为预防和治疗脊髓损伤提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
健康成年雌性 SD 大鼠 72 只,体质量 220~250 g,由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所提供。
一抗大鼠 NF-κB P65、NF-κB P-P65、AQP4 抗体(Abcam 公司,美国);SSa(上海源叶生物科技有限公司);TNF-α ELISA、IL-6 ELISA 抗体和相关试剂盒(武汉六合生物技术有限公司)。4℃ 低温离心机(Eppendorf 公司,德国);酶标仪(Thermo Fisher Scientific 公司,芬兰);CO2 细胞培养箱(Forma Scientifis 公司,美国);高压灭菌箱(山东新华医疗器械有限公司);快速组织细胞破碎仪(上海净信科技有限公司);倒置相差显微镜(Nikon 公司,日本)。
1.2 实验分组及方法
将 SD 大鼠随机分为 3 组:假手术组(A 组)、脊髓损伤组(B 组)和 SSa 处理组(C 组),每组 24 只。A 组大鼠以 5% 水合氯醛(0.6 mL/100 g)腹腔注射麻醉后,仅切除 T9~T11 椎板,不作其他处理。B、C 组参考文献[2,6]方法,利用改良 Allen 重物打击法制作大鼠脊髓损伤模型:同上法麻醉大鼠后,沿肩胛骨向下逐个计数直至定位 T10;以 T10 为中心逐层分离,暴露 T9~T11 节段,使用微型咬骨钳咬除 1/2(T9~T11)棘突及其两侧椎板暴露脊髓。将重 10 g、直径 2.5 mm 打击锤定位打击位置于 T10 节段,高度调整为 5 cm 后打击;打击后见大鼠双后肢抽动、甩尾,随后完全松弛,提示造模成功。C 组于造模后即刻用 5 mL 无菌注射器经腹部表皮斜刺进针,之后垂直入针,回抽判断是否回血,无回血则给予大鼠腹腔注射 SSa(10 mg/kg)1 次(根据文献[9],本实验选择 5、10、20 mg/kg 药物浓度进行比较,确定 10 mg/kg 为最优药物浓度选择);BBB 评分和斜板实验大鼠每天腹腔注射 1 次,连续 1 周。B 组注入等量生理盐水。术后大鼠单笼饲养,防止感染。术后 24 h 各组分别取 18 只大鼠同上法麻醉后,取损伤节段脊髓组织保存待测;每组其余 6 只大鼠采用 BBB 评分和斜板实验评价双下肢运动恢复情况。
1.3 观测指标
1.3.1 BBB 评分 术后 1、3、7、14、21、28 d 采用 BBB 评分评价各组大鼠后肢运动功能,取每只大鼠左右侧肢体评分均值作为最终评分。
1.3.2 斜板实验 术后 1、3、7、14、21、28 d 进行斜板实验,在斜板上将鼠头朝向上、下、左、右,记录其保持 5 s 的最大角度。
1.3.3 ELISA 检测 取出保存的各组脊髓组织,加入 PBS 溶液后,在组织细胞破碎仪中以 900×g 匀浆 6 min,低温条件下(4℃)以 450×g 离心 20 min;取上清液,按照 TNF-α、IL-6 ELISA 试剂盒说明书进行操作,加终止液后混匀,酶标仪进行检测,测量脊髓组织中炎性因子 TNF-α、IL-6 表达浓度。
1.3.4 Western blot 检测 取出保存的各组脊髓组织,称重后加入一定量蛋白裂解液,放置于组织细胞破碎仪中研磨,充分裂解;以 12 000×g 离心 15 min,取出上清,BCA 法测定总蛋白浓度。经过加样、电泳、转膜、封闭、一抗 1∶5 000 孵育过夜,二抗 1∶10 000 孵育 1 h,加入显色剂显色,以 GAPDH 作为内参。显影仪显影,Image J 软件测算蛋白灰度值,计算目的蛋白 NF-κB P65、NF-κB P-P65 和 AQP4 蛋白与 GAPDH 灰度值的比值,作为其相对表达量。
1.3.5 HE 染色观察 术后 24 h 采用多聚甲醛灌注,取出各实验组脊髓组织,置于 4% 多聚甲醛固定 48 h,石蜡包埋,从损伤脊髓中心部位连续切片,片厚 5 μm,行 HE 染色,倒置相差显微镜下观察脊髓损伤处灰质区的形态学改变。
1.4 统计学方法
采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用 LSD 检验;检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 BBB 评分和斜板实验
术后各组大鼠均顺利存活至实验完成,切口无红肿等感染表现。术后各时间点 A 组 BBB 评分和斜板实验最大角度均显著高于 B、C 组,差异有统计学意义(P<0.05);术后 14、21、28 d C 组上述指标显著高于 B 组,差异有统计学意义(P<0.05)。见图 1、2。
2.2 ELISA 检测
A、B、C 组 TNF-α 浓度分别为(124.90±16.16)、(622.30±21.61)、(384.50±16.22)pg/mL,IL-6 浓度分别为(77.30±16.41)、(197.50±4.59)、(127.10±10.69)pg/mL。A 组 TNF-α、IL-6 浓度显著低于 B、C 组,C 组显著低于 B 组,差异均有统计学意义(P<0.05)。
2.3 Western blot 检测
A 组 NF-κB P65、NF-κB P-P65 和 AQP4 蛋白相对表达量均显著低于 B、C 组,C 组均显著低于 B 组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见图 3、表 1。
2.4 HE 染色观察
A 组脊髓中神经细胞正常,无明显病变;B 组脊髓中损伤部位可见神经元细胞,损伤处有出血、中性粒细胞浸润、神经细胞水肿;C 组脊髓中可见神经元细胞,小胶质细胞轻度增生,病变较 B 组好转。见图 4。
3 讨论
脊髓受损后一定程度的炎性反应对机体可起到一定的防御保护作用[10]。然而,包括脊髓在内的中枢神经系统轴突再生及受损神经元的补充能力有限;因此脊髓损伤后炎症所产生的不利影响比其他组织更明显[11]。有研究指出,TNF-α 和 IL-6 是重要的促炎因子,其中 TNF-α 是一个关键性因子,介导上游下游多种炎症信号通路[12-13]。徐玉生等[14]研究表明,脊髓损伤后 1 h,TNF-α 表达显著增强,损伤后 12 h 表达最高。TNF-α、IL-6 等炎性因子大量表达后,进一步加重局部炎性反应,导致细胞凋亡[2, 15]。本研究发现,与 A 组相比较,B 组 TNF-α、IL-6 表达水平明显升高(P<0.05),说明脊髓损伤后发生炎性反应。进行 SSa 治疗后,C 组 TNF-α、IL-6 表达水平较 B 组降低(P<0.05),说明 SSa 可抑制脊髓损伤后炎性反应,从而改善机体炎性反应,发挥神经保护作用。
由同源和异源二聚体组成的 NF-κB 是一种参与调节炎症和细胞存活反应相关基因表达的转录因子[16]。正常情况下,NF-κB 普遍存在于真核细胞,经一定刺激后可迅速对有害细胞作出反应,参与炎性反应,上调包括 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 及氧自由基等一系列炎性介质[15, 17]。有文献报道,在脊髓损伤中 NF-κB 信号通路是调控炎性反应的主要影响信号途径,从而影响炎性反应的进程[2]。Bethea 等[18]发现在脊髓损伤后 30 min NF-κB 开始异常活化,24 h 达高峰,并且在神经元中发现了 NF-κB 和其目标基因产物诱导型 NO 合成酶的共定位染色。因此,抑制 NF-κB 信号通路蛋白基因表达可减轻脊髓损伤后炎性反应,从而改善脊髓损伤后的功能恢复[19]。本实验研究发现,B 组 NF-κB 信号通路蛋白 P65 和 P-P65 表达水平较A组明显提高(P<0.05);对 C 组进行 SSa 治疗后,NF-κB 信号通路蛋白 P65 和 P-P65 表达水平较 B 组降低(P<0.05)。综上,实验结果提示 SSa 可通过抑制 NF-κB 炎性信号通路减轻脊髓损伤后炎性反应,从而发挥保护神经作用。
AQP4 是中枢神经系统调节水通透性的主要分子途径,主要分布于星形胶质细胞的终足和血管内皮细胞,目前已成为脊髓损伤的研究热点[20]。无论是脑还是脊髓损伤后,AQP4 的表达都会发生明显变化,从而影响组织中的血管源性水肿和细胞毒性水肿的发生、发展[21]。Ito 等[22]等研究表明,NF-κB 作为重要的核转录因子,阻断其信号通路能明显抑制 IL-1β 诱导的脑 AQP4 蛋白及其 mRNA 的表达,说明 NF-κB 活性的改变参与了 AQP4 的表达调控。此外,李野[23]在大鼠脊髓损伤实验研究中证明,NF-κB 信号通路参与了脊髓损伤后 AQP4 的表达调节以及脊髓水肿的形成。本实验 AQP4 的表达结果与上述文献一致,与 A 组正常脊髓组织比较,脊髓损伤后 B 组 AQP4 表达水平明显提高(P<0.05);给予 SSa 治疗后,C 组 AQP4 表达水平较 B 组下降(P<0.05),说明该药物可减轻脊髓损伤后组织水肿,从而发挥神经保护作用。
综上述,本研究发现 SSa 对脊髓损伤后的脊髓具有一定神经保护作用。其可能作用机制是通过抑制 NF-κB 信号通路和 AQP4 蛋白的表达,降低脊髓损伤后早期机体炎性因子的水平,从而减轻机体炎性反应和组织水肿。本研究结果能够对脊髓损伤的治疗提供一定思路和依据。