目前脱细胞基质是一种治疗皮肤损伤的有效修复替代材料，但是关于其性能的系统性评价研究较少。本研究实验组采用两种脱细胞方法制备基质：一种是过氧乙酸（0.2% PAA/4% 乙醇溶液）灭菌后高渗盐水脱细胞（A 组）；另一种是 γ 射线灭菌后 0.05% Trypsin 酶/EDTA 脱细胞（B 组）；对照组进行 PBS 浸泡（C 组），检测三组组织物理特性和化学成分。不同方法处理后，苏木精伊红（HE）染色表明 B 组脱细胞效果良好；A、B 组组织孔隙率均在 84.9% 以上；A 组压缩弹性模量（9.94 ± 3.81）MPa、B 组压缩弹性模量（12.59 ± 5.50）MPa 分别与 C 组相比差异无统计学意义；A、B 组脱细胞基质中胶原蛋白总含量均显著低于 C 组含量（1.662 ± 0.229）mg/g，但胶原Ⅰ/Ⅲ的比值 B 组与 C 组相比差异无统计学意义；扫描电镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）观测组织微观结构无明显差异；定性检测各组纤连蛋白和弹性蛋白与 C 组材料基本一致。因此，B 组脱细胞基质作为支架材料性能更好。实验结果说明，采用 γ 射线灭菌、0.05% Trypsin 酶/EDTA 制备的脱细胞基质可用于组织工程皮肤的构建，还可为异种真皮脱细胞基质的制备及裱衬提供参考，为静电纺丝或三维打印组织工程皮肤支架提供理化参数。
引用本文： 杨彩仙, 郭继强, 王景辉, 范佳玉, 邢彦雪, 张利, 安美文. 两种常见的脱细胞法对真皮脱细胞基质理化特性的影响. 生物医学工程学杂志, 2021, 38(5): 911-918. doi: 10.7507/1001-5515.202103019 复制
引言
脱细胞基质是一种治疗皮肤损伤的有效修复替代材料[1]，制备与人体真皮结构相近的脱细胞基质是当前研究的难点。真皮损伤修复手段主要有自体移植、异种真皮脱细胞基质移植、同种异体真皮脱细胞基质移植，但临床效果不一。目前，国外有关真皮脱细胞基质的主要产品有 AlloDerm 和 AlloDerm RTU 等，国内有“瑞诺”和“桀亚”等，但关于理化性质方面的系统性评价研究较少。
常用的脱细胞基质制备方法包括物理处理、化学处理、生物酶处理或以上几种方法结合起来对组织进行脱细胞处理[2-3]。由于细胞密度、基质密度、组织厚度和形状等原因，不同组织和器官脱细胞的最佳方法不同[4-7]，针对皮肤组织的最优、最快组织工程皮肤构建方法报道较少[8-9]。单纯的物理脱细胞方法对细胞内容物去除效果不佳[10]；化学处理方法中去垢剂如十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）脱细胞效果较强，可以完全去核[11]，但存在细胞外基质（extracellular matrix，ECM）超微结构破坏、生长因子消除和化学试剂残留等问题[12-14]；生物酶处理如 Trypsin 酶可以使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散，可以高特异性地去除细胞残留或不良的 ECM 成分，从致密组织中完全去除细胞核[15-18]。
本研究在前期研究的基础上，简化处理步骤，防止氢氧化钠等对人体会产生危害的试剂残留，选用对人体较安全的酶或高渗盐水进行脱细胞[8, 19-22]，并且增加灭菌的步骤以避免未灭菌人体真皮具有传染性疾病的危害[8]。两步法处理脱细胞基质如下：采用 γ 射线和过氧乙酸（peroxyacetic acid，PAA）两种方法分别对人体皮肤组织进行灭菌[23]，采用 Trypsin 酶和高渗盐水分别进行脱细胞处理。将两组材料理化参数与正常皮肤组织对比分析，得出脱细胞基质的物理结构、生物化学成分等参数，可为异种真皮脱细胞基质的制备及裱衬提供参考，为静电纺丝或三维（three-dimensional，3D）打印组织工程皮肤支架提供理化参数。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
主要试剂为 DMEM 培养液（HyClone，美国）、DMSO（生工，上海）、4% 多聚甲醛（C0402，Sigma，美国）、Trypsin 酶/EDTA 液（ScienCell，美国）、过氧乙酸 AB 型（瑞泰奇，山东）、苦味酸天狼星红染液（Sirius Red，F3D，美国）、纤连蛋白染色抗体（Anti-Fibronectin Rabbit pAb，山羊抗兔二抗，赛维尔，武汉）、羟脯氨酸试剂盒（凡科维，青岛）、CCK-8（碧云天，上海）等。主要仪器为超低温冰箱（Eppendorf，德国）、CO2 培养箱（Thermo Forma，美国）、扫描电子显微镜（JSM-7100F，Jeol，日本）、原子力显微镜（L01K180，BRUKE，德国）、荧光显微成像系统（iX70，Olympus，日本）、电热鼓风干燥箱（GZX-9240MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂，中国）、万能试验机（Instron 5544，英斯特朗上海材料试验机公司，中国）、酶标检测仪（Rayto Rt2100c，Rayto，美国）、红外光谱仪（Bruker，德国）等。
1.2 支架材料制备
经过太原理工大学伦理委员会批准，收集山西白求恩医院门诊行包皮环切术的包皮标本。取样后用生理盐水反复冲洗，碘伏消毒，使用含 1% 青-链霉素的 PBS（青霉素及链霉素浓度分别为 10 000 U/mL、10 000 µg/mL）浸润消毒 30 min，PBS 洗 3 遍。随机将 30 例包皮分为 3 组，A 组为过氧乙酸（0.2% PAA/4% 乙醇溶液）灭菌、高渗盐水脱细胞；B 组为 γ 射线灭菌、0.05%Trypsin 酶/EDTA 脱细胞；C 组为对照组，进行 PBS 浸泡处理。
取 A 组样品在摇床上用 0.2% PAA/4% 乙醇溶液灭菌 6 h，用含 1% 青-链霉素的无菌 PBS 冲洗，然后加入浓度为 58.5 g/L 的 NaCl 溶液 100 mL，置于 4℃ 冰箱中 24 h，最后使用含 1% 青-链霉素的无菌 PBS 摇床清洗 24 h。B 组样品使用剂量率为 1 000 Gy/h，总剂量 25 kGy 的 γ 射线照射，再以 0.05% Trypsin 酶/EDTA 液孵育 24 h，最后使用含 1% 青-链霉素的无菌 PBS 摇床清洗 24 h。C 组仅使用含 1% 青-链霉素的无菌 PBS 摇床清洗 24 h。以下检测全部在真皮上进行。
1.3 检测指标
1.3.1 支架显微结构检测
将 3 组样品切下后用 PBS 洗涤，甲醛溶液固定，常规乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片，苏木精伊红（hematoxylin eosin，HE）染色，光学显微镜观察脱细胞情况。将 3 组组织使用 2.5% 戊二醛磷酸缓冲液室温固定 4 h，乙醇梯度脱水后冷冻干燥样品，扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM）观察并拍照，使用 Image J 统计纤维直径数值。原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM）检测：将 2 种（n = 3）脱细胞基质以及对照组样品风干后贴附在直径 35 mm 的培养皿上，室温空气中使用一个探针（模型 NCHV，BRUKER，美国）和 1 Hz 扫描频率在轻敲模式下扫描组织表面，扫描面尺寸为 10 µm × 10 µm。使用 Nanoscope 软件对结果进行评估。
1.3.2 孔隙率测量及生物力学压缩性能
每组支架（n = 3）冷冻干燥，每个支架干燥后称重记为 m1，置入 50 mL 含体积分数 75% 的乙醇离心管。抽真空至不再有气泡溢出，称含有乙醇和支架材料离心管 m2，将含有乙醇的支架材料取出，称剩余的乙醇及离心管 m3。按式（1）计算孔隙率（P）：
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将各组支架（n = 3）制成适当尺寸，每个样品三次测量其厚度，取平均值计算其应变达到 80% 的位移，采用 Instron 5544 万能试验机，设置下降速率为 1 mm/min，结束条件为应变达到 80%。使用文献报道的模型对实验获得的载荷-位移曲线进行分析，按照式（2）计算获得皮肤的整体刚度，其中 F 表示载荷，E 为皮肤的整体刚度，a 为探针半径，s 表示位移，
表示泊松比，此处取值为 0.5。
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1.3.3 胶原总含量和胶原成分比例测定
根据凡科维试剂盒组织样品处理方法处理组织并检测各组样品（n = 3）中羟脯氨酸含量，同时与标准液吸光度值绘制出的标准曲线相比，按羟脯氨酸含量占胶原总含量约 10% 换算出测试样品的胶原总含量。将石蜡切片脱蜡，苦味酸天狼星红染液浸染 1 h，苏木精复染。偏振光显微镜观察三组样品中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原分布情况，通过 Image J 分析各组样品Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的比例。
1.3.4 纤连蛋白和弹性蛋白检测
将石蜡切片按照操作规程进行脱蜡和水化后，高温修复抗原；滴加 H2O2，室温孵育；滴加一滴非免疫动物血清，室温孵育；滴加一抗和二抗，室温孵育后 DAB 显色和苏木素复染。采用衰减全反射法（attenuated total refraction，ATR），在红外光谱仪波数 4 000～400 cm–1的测试条件下扫描每组样品（n = 3），采集样品的红外光谱。
1.3.5 细胞活性检测
设置对照孔（仅有细胞），把人真皮成纤维细胞 4～6 代与脱细胞基质（n = 3）共培养于 24 孔板，接种密度为 1 000 个/孔，使用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养细胞 24 h 后，采用 CCK-8 孵育 1 h，在酶标仪 450 nm 处检测对照孔及各组基质的培养液吸光度值。
1.4 统计学方法
采用 SPSS24.0 软件进行统计学分析。定量数据采用平均值 ± 标准差表示，测试样本为 3，组间比较采用单因素方差分析，检验水准为 0.05。
2 结果
2.1 真皮脱细胞效果及脱细胞基质的显微结构
HE 染色中苏木精使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着蓝紫色，伊红使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。各组材料 HE 染色结果见图 1a。C 组作为阴性对照组，真皮中存在大量细胞，A 组基质脱细胞效果较差，分布着较多核酸成分；B 组脱细胞效果良好，基本无核酸成分。SEM 是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态。使用 SEM 观察了三组材料内部结构（从表面裂缝观察），由图 1b 可见三种材料内部纵横交错的纤维，呈现孔隙较均匀的三维网状结构。
图1
各组材料脱细胞效果及基质内部结构（
± SD）
a. HE 染色图（Bar = 50 μm）；b. SEM 观察材料内部图（Bar = 10 μm）；c.各组材料纤维直径；d.各组材料纤维直径分布情况
Figure1. Acellularization effect and matrix internal structure of each group (
± SD)
a. HE staining diagram (Bar = 50 μm); b. SEM to observe the internal drawing of the material (Bar = 10 μm); c. fiber diameter of each group; d. fiber diameter distribution of each group
统计胶原纤维的直径，A 组为（1.2 ± 0.4）μm，B 组为（1.7 ± 0.7）μm，C 组为（1.7 ± 0.2）μm，直方图如图 1c 所示。每张图统计与随机直线相交的前 5 条纤维，每组共有 15 条纤维，分别按纤维直径小于 1、2、3、4、5 μm 统计各段的纤维直径出现的总频数，得到各组纤维分布情况如图 1d 所示。
从图 1c 和图 1d 中纤维直径分布可以看出，与 C 组纤维直径相比，A 组较大直径的胶原纤维损失严重，表现为仅存在直径 ≤ 3 μm 的纤维，统计纤维分布发现 A 组纤维直径主要集中在 1～2 μm。从不同直径的分布情况看，不同组别之间存在一定的趋势，A 组处理方法纤维直径平均值具有低于其他组的趋势。
AFM 的分辨率为纳米量级，图 2a 是使用 AFM 观察到的三组材料表面微形貌，图 2b 是各组材料微观表面高度，图 2c 是各组材料表面粗糙度结果。A、B、C 组高度分别为（1 577.3 ± 1 204.4）、（2 451.0 ± 404.4）、（1 659.3 ± 605.4）nm；粗糙度分别为 0.746 ± 0.047、0.819 ± 0.007、0.790 ± 0.035。原子力检测支架表面 100 μm2的面积内发现最高高度和粗糙度在 A、B 与 C 组之间差异无统计学意义，即 A、B 组处理方法均未改变基质的微观结构。
图2
各组材料表面微结构（
± SD）
a. AFM 高度模式图；b.各组材料表面微区高度平均值；c.各组材料表面粗糙度值
Figure2. Surface microstructure of each group (
± SD)
a. AFM height pattern diagram; b. average height of microzone on the surface of each group of materials; c. surface roughness of each group of materials
2.2 脱细胞基质的孔隙率及生物力学压缩性能测试结果
固体材料孔隙率可反映材料的疏密程度。通过测量支架孔隙率，本文发现 A 组（84.9 ± 5.0）%、B 组（86.7 ± 2.1）% 相比 C 组的孔隙率（59.2 ± 9.9）% 均上升，差异有统计学意义，分别为 P = 0.001、P = 0.000。表明细胞脱除使得组织孔隙率增大，具体数值如图 3a 所示。A 组材料的压缩弹性模量最小，为（9.94 ± 3.81）MPa；B 组材料压缩弹性模量最大，为（12.59 ± 5.50）MPa。A 组和 B 组材料的压缩弹性模量与 C 组压缩弹性模量（6.75 ± 2.20）MPa 相比差异无统计学意义（P > 0.05），结果如图 3b 所示。
图3
各组材料孔隙率及压缩弹性模量（
± SD）
a.各组材料孔隙率；b.各组材料压缩弹性模量。**表示
± SD)
a. void ratio of each group of materials; b. modulus of compression elasticity of each group of materials. **
2.3 脱细胞基质的胶原总含量及胶原Ⅰ/Ⅲ的比值
检测 A、B、C 组胶原总含量分别为（1.227 ± 0.061）、（1.255 ± 0.025）、（1.662 ± 0.229）mg/g，A、B 组中胶原蛋白总含量均低于 C 组含量，且与 C 组相比差异具有统计学意义，分别为 P = 0.003、P = 0.004，结果如图 4b 所示。在偏振光显微镜下观察，Ⅰ型胶原纤维显示很强的双折光性，为红色或黄色纤维，Ⅲ型胶原显示弱的双折光性，为绿色细纤维，染色结果如图 4a 所示。统计胶原Ⅰ/Ⅲ的比值，发现 B 组（1.003 ± 0.002）与 C 组（1.006 ± 0.007）相比无显著差异，但 A 组（0.999 ± 0.003）与 C 组相比，差异具有统计学意义（P = 0.004），直方图如图 4c 所示。
图4
各组材料的胶原总含量及胶原比值（
± SD）
a.各组材料天狼星红染色图（Bar = 50 μm）；b.各组材料胶原总含量；c.各组材料胶原比例。*表示
± SD)
a. Sirius red staining of each group of materials (Bar = 50 μm); b. total collagen content in each group; c. proportion of collagen in each group. *
2.4 脱细胞基质的纤连蛋白染色及弹性蛋白定性
三组材料纤连蛋白均表现阳性结果，B 组阳性结果较弱，说明 B 组处理方法导致纤连蛋白含量下降，A 组阳性与 C 组程度一致，说明 A 组处理过程中未显著破坏组织的纤连蛋白，染色结果如图 5a 所示。红外谱图中存在弹性蛋白与胶原蛋白、糖胺聚糖、纤连蛋白等蛋白质都有的 1 650 cm–1附近酰胺Ⅰ、1 550 cm–1附近酰胺Ⅱ的特征峰外，还存在弹性蛋白在 3 309.8、1 651、1 539.1、1 238.2 cm–1处的四个特征吸收峰，分别对应于酰胺-A 带中的 N－H 伸缩振动吸收峰、酰胺-Ⅰ带中的 C=O 伸缩振动吸收峰、酰胺-Ⅱ带的 C－N 伸缩振动吸收峰和酰胺-Ⅲ带的 N－H 弯曲振动吸收峰，说明三组材料均存在弹性蛋白，结果如图 5b 所示。
图5
各组材料纤连蛋白染色及弹性蛋白定性检测结果
a.纤连蛋白免疫组化染色（Bar = 50 μm）；b.各组材料弹性蛋白红外检测结果
Figure5. The results of fibronectin staining and elastin qualitative determinationa. fibronectin immunohistochemical staining (Bar = 50 μm); b. infrared detection results of elastin in each group
2.5 成纤维细胞在脱细胞基质中的增殖情况
接种人真皮成纤维细胞后，对照组（C 组）及 A、B 组材料周围细胞生长状况如图 6a 所示，CCK-8 检测细胞活性直方图如图 6b 所示。24 h 细胞活性检测 A、B 组与对照孔差异无统计学意义。
图6
对照孔及各组材料周围细胞活性
a.对照孔及各组材料周围细胞生长状况（Bar = 100 μm）；b.对照组与各组材料 CCK-8 细胞活力检测结果
Figure6. Cell activity around the control hole and materials of each groupa. growth of cells around the control hole and each group of materials (Bar = 100 μm); b. CCK-8 cell viability test results of control group and each group
3 讨论
在调节生物物理刺激、生物化学和分子信号以及空间结构方面，天然 ECM 发挥着重要作用。脱细胞组织来自天然 ECM，在植入体内后，随时间延长可逐渐被患者自身的组织所取代[1]。脱细胞方案的理想目标是去除所有的细胞物质，而不影响剩余 ECM 的组成、机械完整性和生物化学活性[22]，但是脱细胞过程总会造成 ECM 的改变。为了研究这种改变，本研究将脱细胞真皮基质与未脱除细胞的皮肤组织进行对比，筛选出理化性能最接近人体正常皮肤的脱细胞基质，其可用于组织工程皮肤的构建，还可为异种真皮脱细胞基质的制备及裱衬提供参考，为静电纺丝或 3D 打印组织工程皮肤支架提供理化参数。
本文使用了两种常用的组织移植物灭菌方法：γ 射线和 PAA。这两种方法灭菌操作简便、高效、安全。γ 射线照射可去除细胞中易引起免疫排斥反应的成分，被广泛应用于药物和脱细胞猪角膜等材料的灭菌[24-26]。由于 γ 射线穿透性强，灭菌同时可因电离作用使细胞死亡。已有研究表明 PAA 可以在低浓度下灭活病毒、真菌和细菌，同时可通过电子转移氧化细胞膜上的基团，从而引发细胞死亡，产生的副产物为水、氧和二氧化碳[3]，对人体较安全。此外，有研究指出先灭菌有利于提高细胞的脱除效率[8]，故本文使用这两种灭菌方法作为脱细胞的前处理。
脱细胞真皮基质要脱除具有免疫抗原性的细胞，本文通过 HE 染色发现 B 组无核酸成分，脱细胞效果优于 A 组，说明酶对细胞脱除具有显著的效果。使用 SEM 和 AFM 观察材料微观结构[27-31]，结果显示 A、B 组材料在微观结构方面与 C 组相比差异均无统计学意义，但 A 组纤维直径相对 B 组与 C 组较小，提示 PAA 灭菌后高渗盐处理对纤维直径的破坏较大。
孔隙率反映材料内部的疏松程度，孔隙率越大，材料内部越疏松，细胞越容易长入材料内部。A、B 组孔隙率均远大于对照组 C 组，而 A 组与 B 组孔隙率相比差异无统计学意义，提示两种方法处理的基质内部孔隙基本一致。一般方法的支架孔隙率约为（74.28 ± 2.06）%[32-34]，而本研究的脱细胞真皮基质孔隙率为（84.9 ± 5.0）% 和（86.7 ± 2.1）%，高于传统方法。检测发现正常组织中间也存在空隙，对比正常组织孔隙率可间接证明本文细胞脱除的有效性。较大的孔隙率初步表明本文脱细胞真皮基质的结构便于细胞长入[35-36]。支架移植后需要包扎治疗，承受压力，故本研究检测脱除细胞前、后的支架压缩弹性模量[37]，结果表明 A 组高渗盐水处理、B 组酶处理后脱细胞真皮基质的压缩弹性模量接近正常皮肤，说明脱细胞处理未影响基质压缩弹性模量。
为了探索本文脱细胞基质在化学组分上是否有利于细胞长入，我们检测了样品脱细胞前、后的组分及含量变化。检测胶原总含量变化发现，与 C 组相比，A、B 组胶原总含量下降，差异具有统计学意义（均为 P < 0.01）。A 组或许是酸性环境加速了胶原蛋白的水解，B 组或许是 γ 射线使胶原缺失[3]。Ⅰ、Ⅲ型胶原是皮肤中含量最多的两种胶原成分，分别占皮肤胶原总量的 80%～85% 和 10%～15%[38]，据文献报道胶原比例与人的年龄与取皮位置有关[39-41]，成人Ⅰ/Ⅲ型胶原比值范围为 1～2。本研究检测这两种胶原比例比值约为 1，与邱林[42]报道的比值 1.2～1.3 相近，且经处理后胶原比例在 B 组与对照组之间差异无统计学意义。说明 B 组很好地保留了胶原比例，即 γ 射线灭菌、酶处理未显著破坏胶原Ⅰ/Ⅲ的比例。两组基质脱细胞后胶原蛋白总含量均有所下降，但是 B 组Ⅰ/Ⅲ型胶原的比例与对照组相比差异无统计学意义，说明 B 组脱细胞后细胞外基质的改变较小。
纤连蛋白可影响细胞的黏附、迁移，本文 B 组纤连蛋白明显少于 C 组，暗示 γ 射线照射和酶处理会使基质损失一部分纤连蛋白，而 PAA 灭菌、高渗盐水脱细胞的纤连蛋白保留效果较好。弹性纤维蛋白与支架弹性相关，故本文通过红外光谱图定性检测了脱细胞前、后各组弹性蛋白[43]，发现 A、B 组与对照组均出现弹性蛋白特征峰，说明两组脱细胞方法对弹性蛋白无影响。脱细胞支架使用目的是要植入人体，要求脱细胞基质对细胞无毒性。A、B 组材料的生物学活性差异无统计学意义，猜测与支架的微观形貌结构差异无统计学意义有关，与材料的化学组分结构、成分相近有关。
综上所述，A 组与 B 组性能对比发现，A 组纤连蛋白保留较好，但细胞脱除效果不如 B 组；B 组对胶原比例的破坏低于 A 组，且细胞脱除效果优于 A 组；基质与细胞共培养 24 h 以上发现，A、B 组基质对细胞生长的影响差异无统计学意义，但这只是短期的培养，若要应用于人体，后期需要检测材料与细胞共培养较长时间细胞的生长状态。
4 结论
本文认为 γ 射线灭菌后，Trypsin 酶脱细胞对脱细胞真皮基质的理化特性无显著破坏作用，其制备的脱细胞真皮基质的理化特性较 PAA 灭菌后高渗盐脱细胞更接近于对照组。故本文认为 γ 射线灭菌、0.05% Trypsin 酶/EDTA 脱细胞制备脱细胞基质性能较好。本文中 γ 射线灭菌后，Trypsin 酶脱细胞构建的脱细胞基质不仅可以直接用于组织工程皮肤的构建，还可为异种真皮脱细胞基质的制备及裱衬提供参考，为静电纺丝或 3D 打印组织工程皮肤支架提供理化参数。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
引言
脱细胞基质是一种治疗皮肤损伤的有效修复替代材料[1]，制备与人体真皮结构相近的脱细胞基质是当前研究的难点。真皮损伤修复手段主要有自体移植、异种真皮脱细胞基质移植、同种异体真皮脱细胞基质移植，但临床效果不一。目前，国外有关真皮脱细胞基质的主要产品有 AlloDerm 和 AlloDerm RTU 等，国内有“瑞诺”和“桀亚”等，但关于理化性质方面的系统性评价研究较少。
常用的脱细胞基质制备方法包括物理处理、化学处理、生物酶处理或以上几种方法结合起来对组织进行脱细胞处理[2-3]。由于细胞密度、基质密度、组织厚度和形状等原因，不同组织和器官脱细胞的最佳方法不同[4-7]，针对皮肤组织的最优、最快组织工程皮肤构建方法报道较少[8-9]。单纯的物理脱细胞方法对细胞内容物去除效果不佳[10]；化学处理方法中去垢剂如十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）脱细胞效果较强，可以完全去核[11]，但存在细胞外基质（extracellular matrix，ECM）超微结构破坏、生长因子消除和化学试剂残留等问题[12-14]；生物酶处理如 Trypsin 酶可以使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散，可以高特异性地去除细胞残留或不良的 ECM 成分，从致密组织中完全去除细胞核[15-18]。
本研究在前期研究的基础上，简化处理步骤，防止氢氧化钠等对人体会产生危害的试剂残留，选用对人体较安全的酶或高渗盐水进行脱细胞[8, 19-22]，并且增加灭菌的步骤以避免未灭菌人体真皮具有传染性疾病的危害[8]。两步法处理脱细胞基质如下：采用 γ 射线和过氧乙酸（peroxyacetic acid，PAA）两种方法分别对人体皮肤组织进行灭菌[23]，采用 Trypsin 酶和高渗盐水分别进行脱细胞处理。将两组材料理化参数与正常皮肤组织对比分析，得出脱细胞基质的物理结构、生物化学成分等参数，可为异种真皮脱细胞基质的制备及裱衬提供参考，为静电纺丝或三维（three-dimensional，3D）打印组织工程皮肤支架提供理化参数。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
主要试剂为 DMEM 培养液（HyClone，美国）、DMSO（生工，上海）、4% 多聚甲醛（C0402，Sigma，美国）、Trypsin 酶/EDTA 液（ScienCell，美国）、过氧乙酸 AB 型（瑞泰奇，山东）、苦味酸天狼星红染液（Sirius Red，F3D，美国）、纤连蛋白染色抗体（Anti-Fibronectin Rabbit pAb，山羊抗兔二抗，赛维尔，武汉）、羟脯氨酸试剂盒（凡科维，青岛）、CCK-8（碧云天，上海）等。主要仪器为超低温冰箱（Eppendorf，德国）、CO2 培养箱（Thermo Forma，美国）、扫描电子显微镜（JSM-7100F，Jeol，日本）、原子力显微镜（L01K180，BRUKE，德国）、荧光显微成像系统（iX70，Olympus，日本）、电热鼓风干燥箱（GZX-9240MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂，中国）、万能试验机（Instron 5544，英斯特朗上海材料试验机公司，中国）、酶标检测仪（Rayto Rt2100c，Rayto，美国）、红外光谱仪（Bruker，德国）等。
1.2 支架材料制备
经过太原理工大学伦理委员会批准，收集山西白求恩医院门诊行包皮环切术的包皮标本。取样后用生理盐水反复冲洗，碘伏消毒，使用含 1% 青-链霉素的 PBS（青霉素及链霉素浓度分别为 10 000 U/mL、10 000 µg/mL）浸润消毒 30 min，PBS 洗 3 遍。随机将 30 例包皮分为 3 组，A 组为过氧乙酸（0.2% PAA/4% 乙醇溶液）灭菌、高渗盐水脱细胞；B 组为 γ 射线灭菌、0.05%Trypsin 酶/EDTA 脱细胞；C 组为对照组，进行 PBS 浸泡处理。
取 A 组样品在摇床上用 0.2% PAA/4% 乙醇溶液灭菌 6 h，用含 1% 青-链霉素的无菌 PBS 冲洗，然后加入浓度为 58.5 g/L 的 NaCl 溶液 100 mL，置于 4℃ 冰箱中 24 h，最后使用含 1% 青-链霉素的无菌 PBS 摇床清洗 24 h。B 组样品使用剂量率为 1 000 Gy/h，总剂量 25 kGy 的 γ 射线照射，再以 0.05% Trypsin 酶/EDTA 液孵育 24 h，最后使用含 1% 青-链霉素的无菌 PBS 摇床清洗 24 h。C 组仅使用含 1% 青-链霉素的无菌 PBS 摇床清洗 24 h。以下检测全部在真皮上进行。
1.3 检测指标
1.3.1 支架显微结构检测
将 3 组样品切下后用 PBS 洗涤，甲醛溶液固定，常规乙醇梯度脱水，石蜡包埋，切片，苏木精伊红（hematoxylin eosin，HE）染色，光学显微镜观察脱细胞情况。将 3 组组织使用 2.5% 戊二醛磷酸缓冲液室温固定 4 h，乙醇梯度脱水后冷冻干燥样品，扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM）观察并拍照，使用 Image J 统计纤维直径数值。原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM）检测：将 2 种（n = 3）脱细胞基质以及对照组样品风干后贴附在直径 35 mm 的培养皿上，室温空气中使用一个探针（模型 NCHV，BRUKER，美国）和 1 Hz 扫描频率在轻敲模式下扫描组织表面，扫描面尺寸为 10 µm × 10 µm。使用 Nanoscope 软件对结果进行评估。
1.3.2 孔隙率测量及生物力学压缩性能
每组支架（n = 3）冷冻干燥，每个支架干燥后称重记为 m1，置入 50 mL 含体积分数 75% 的乙醇离心管。抽真空至不再有气泡溢出，称含有乙醇和支架材料离心管 m2，将含有乙醇的支架材料取出，称剩余的乙醇及离心管 m3。按式（1）计算孔隙率（P）：
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将各组支架（n = 3）制成适当尺寸，每个样品三次测量其厚度，取平均值计算其应变达到 80% 的位移，采用 Instron 5544 万能试验机，设置下降速率为 1 mm/min，结束条件为应变达到 80%。使用文献报道的模型对实验获得的载荷-位移曲线进行分析，按照式（2）计算获得皮肤的整体刚度，其中 F 表示载荷，E 为皮肤的整体刚度，a 为探针半径，s 表示位移， 表示泊松比，此处取值为 0.5。
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1.3.3 胶原总含量和胶原成分比例测定
根据凡科维试剂盒组织样品处理方法处理组织并检测各组样品（n = 3）中羟脯氨酸含量，同时与标准液吸光度值绘制出的标准曲线相比，按羟脯氨酸含量占胶原总含量约 10% 换算出测试样品的胶原总含量。将石蜡切片脱蜡，苦味酸天狼星红染液浸染 1 h，苏木精复染。偏振光显微镜观察三组样品中Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原分布情况，通过 Image J 分析各组样品Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的比例。
1.3.4 纤连蛋白和弹性蛋白检测
将石蜡切片按照操作规程进行脱蜡和水化后，高温修复抗原；滴加 H2O2，室温孵育；滴加一滴非免疫动物血清，室温孵育；滴加一抗和二抗，室温孵育后 DAB 显色和苏木素复染。采用衰减全反射法（attenuated total refraction，ATR），在红外光谱仪波数 4 000～400 cm–1的测试条件下扫描每组样品（n = 3），采集样品的红外光谱。
1.3.5 细胞活性检测
设置对照孔（仅有细胞），把人真皮成纤维细胞 4～6 代与脱细胞基质（n = 3）共培养于 24 孔板，接种密度为 1 000 个/孔，使用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养细胞 24 h 后，采用 CCK-8 孵育 1 h，在酶标仪 450 nm 处检测对照孔及各组基质的培养液吸光度值。
1.4 统计学方法
采用 SPSS24.0 软件进行统计学分析。定量数据采用平均值 ± 标准差表示，测试样本为 3，组间比较采用单因素方差分析，检验水准为 0.05。
2 结果
2.1 真皮脱细胞效果及脱细胞基质的显微结构
HE 染色中苏木精使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着蓝紫色，伊红使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。各组材料 HE 染色结果见图 1a。C 组作为阴性对照组，真皮中存在大量细胞，A 组基质脱细胞效果较差，分布着较多核酸成分；B 组脱细胞效果良好，基本无核酸成分。SEM 是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态。使用 SEM 观察了三组材料内部结构（从表面裂缝观察），由图 1b 可见三种材料内部纵横交错的纤维，呈现孔隙较均匀的三维网状结构。
图1
各组材料脱细胞效果及基质内部结构（ ± SD）
a. HE 染色图（Bar = 50 μm）；b. SEM 观察材料内部图（Bar = 10 μm）；c.各组材料纤维直径；d.各组材料纤维直径分布情况
Figure1. Acellularization effect and matrix internal structure of each group ( ± SD)
a. HE staining diagram (Bar = 50 μm); b. SEM to observe the internal drawing of the material (Bar = 10 μm); c. fiber diameter of each group; d. fiber diameter distribution of each group
统计胶原纤维的直径，A 组为（1.2 ± 0.4）μm，B 组为（1.7 ± 0.7）μm，C 组为（1.7 ± 0.2）μm，直方图如图 1c 所示。每张图统计与随机直线相交的前 5 条纤维，每组共有 15 条纤维，分别按纤维直径小于 1、2、3、4、5 μm 统计各段的纤维直径出现的总频数，得到各组纤维分布情况如图 1d 所示。
从图 1c 和图 1d 中纤维直径分布可以看出，与 C 组纤维直径相比，A 组较大直径的胶原纤维损失严重，表现为仅存在直径 ≤ 3 μm 的纤维，统计纤维分布发现 A 组纤维直径主要集中在 1～2 μm。从不同直径的分布情况看，不同组别之间存在一定的趋势，A 组处理方法纤维直径平均值具有低于其他组的趋势。
AFM 的分辨率为纳米量级，图 2a 是使用 AFM 观察到的三组材料表面微形貌，图 2b 是各组材料微观表面高度，图 2c 是各组材料表面粗糙度结果。A、B、C 组高度分别为（1 577.3 ± 1 204.4）、（2 451.0 ± 404.4）、（1 659.3 ± 605.4）nm；粗糙度分别为 0.746 ± 0.047、0.819 ± 0.007、0.790 ± 0.035。原子力检测支架表面 100 μm2的面积内发现最高高度和粗糙度在 A、B 与 C 组之间差异无统计学意义，即 A、B 组处理方法均未改变基质的微观结构。
图2
各组材料表面微结构（ ± SD）
a. AFM 高度模式图；b.各组材料表面微区高度平均值；c.各组材料表面粗糙度值
Figure2. Surface microstructure of each group ( ± SD)
a. AFM height pattern diagram; b. average height of microzone on the surface of each group of materials; c. surface roughness of each group of materials
2.2 脱细胞基质的孔隙率及生物力学压缩性能测试结果
固体材料孔隙率可反映材料的疏密程度。通过测量支架孔隙率，本文发现 A 组（84.9 ± 5.0）%、B 组（86.7 ± 2.1）% 相比 C 组的孔隙率（59.2 ± 9.9）% 均上升，差异有统计学意义，分别为 P = 0.001、P = 0.000。表明细胞脱除使得组织孔隙率增大，具体数值如图 3a 所示。A 组材料的压缩弹性模量最小，为（9.94 ± 3.81）MPa；B 组材料压缩弹性模量最大，为（12.59 ± 5.50）MPa。A 组和 B 组材料的压缩弹性模量与 C 组压缩弹性模量（6.75 ± 2.20）MPa 相比差异无统计学意义（P > 0.05），结果如图 3b 所示。
图3
各组材料孔隙率及压缩弹性模量（ ± SD）
a.各组材料孔隙率；b.各组材料压缩弹性模量。**表示
± SD)
a. void ratio of each group of materials; b. modulus of compression elasticity of each group of materials. **
2.3 脱细胞基质的胶原总含量及胶原Ⅰ/Ⅲ的比值
检测 A、B、C 组胶原总含量分别为（1.227 ± 0.061）、（1.255 ± 0.025）、（1.662 ± 0.229）mg/g，A、B 组中胶原蛋白总含量均低于 C 组含量，且与 C 组相比差异具有统计学意义，分别为 P = 0.003、P = 0.004，结果如图 4b 所示。在偏振光显微镜下观察，Ⅰ型胶原纤维显示很强的双折光性，为红色或黄色纤维，Ⅲ型胶原显示弱的双折光性，为绿色细纤维，染色结果如图 4a 所示。统计胶原Ⅰ/Ⅲ的比值，发现 B 组（1.003 ± 0.002）与 C 组（1.006 ± 0.007）相比无显著差异，但 A 组（0.999 ± 0.003）与 C 组相比，差异具有统计学意义（P = 0.004），直方图如图 4c 所示。
图4
各组材料的胶原总含量及胶原比值（ ± SD）
a.各组材料天狼星红染色图（Bar = 50 μm）；b.各组材料胶原总含量；c.各组材料胶原比例。*表示
± SD)
a. Sirius red staining of each group of materials (Bar = 50 μm); b. total collagen content in each group; c. proportion of collagen in each group. *
2.4 脱细胞基质的纤连蛋白染色及弹性蛋白定性
三组材料纤连蛋白均表现阳性结果，B 组阳性结果较弱，说明 B 组处理方法导致纤连蛋白含量下降，A 组阳性与 C 组程度一致，说明 A 组处理过程中未显著破坏组织的纤连蛋白，染色结果如图 5a 所示。红外谱图中存在弹性蛋白与胶原蛋白、糖胺聚糖、纤连蛋白等蛋白质都有的 1 650 cm–1附近酰胺Ⅰ、1 550 cm–1附近酰胺Ⅱ的特征峰外，还存在弹性蛋白在 3 309.8、1 651、1 539.1、1 238.2 cm–1处的四个特征吸收峰，分别对应于酰胺-A 带中的 N－H 伸缩振动吸收峰、酰胺-Ⅰ带中的 C=O 伸缩振动吸收峰、酰胺-Ⅱ带的 C－N 伸缩振动吸收峰和酰胺-Ⅲ带的 N－H 弯曲振动吸收峰，说明三组材料均存在弹性蛋白，结果如图 5b 所示。
图5
各组材料纤连蛋白染色及弹性蛋白定性检测结果
a.纤连蛋白免疫组化染色（Bar = 50 μm）；b.各组材料弹性蛋白红外检测结果
Figure5. The results of fibronectin staining and elastin qualitative determinationa. fibronectin immunohistochemical staining (Bar = 50 μm); b. infrared detection results of elastin in each group
2.5 成纤维细胞在脱细胞基质中的增殖情况
接种人真皮成纤维细胞后，对照组（C 组）及 A、B 组材料周围细胞生长状况如图 6a 所示，CCK-8 检测细胞活性直方图如图 6b 所示。24 h 细胞活性检测 A、B 组与对照孔差异无统计学意义。
图6
对照孔及各组材料周围细胞活性
a.对照孔及各组材料周围细胞生长状况（Bar = 100 μm）；b.对照组与各组材料 CCK-8 细胞活力检测结果
Figure6. Cell activity around the control hole and materials of each groupa. growth of cells around the control hole and each group of materials (Bar = 100 μm); b. CCK-8 cell viability test results of control group and each group
3 讨论
在调节生物物理刺激、生物化学和分子信号以及空间结构方面，天然 ECM 发挥着重要作用。脱细胞组织来自天然 ECM，在植入体内后，随时间延长可逐渐被患者自身的组织所取代[1]。脱细胞方案的理想目标是去除所有的细胞物质，而不影响剩余 ECM 的组成、机械完整性和生物化学活性[22]，但是脱细胞过程总会造成 ECM 的改变。为了研究这种改变，本研究将脱细胞真皮基质与未脱除细胞的皮肤组织进行对比，筛选出理化性能最接近人体正常皮肤的脱细胞基质，其可用于组织工程皮肤的构建，还可为异种真皮脱细胞基质的制备及裱衬提供参考，为静电纺丝或 3D 打印组织工程皮肤支架提供理化参数。
本文使用了两种常用的组织移植物灭菌方法：γ 射线和 PAA。这两种方法灭菌操作简便、高效、安全。γ 射线照射可去除细胞中易引起免疫排斥反应的成分，被广泛应用于药物和脱细胞猪角膜等材料的灭菌[24-26]。由于 γ 射线穿透性强，灭菌同时可因电离作用使细胞死亡。已有研究表明 PAA 可以在低浓度下灭活病毒、真菌和细菌，同时可通过电子转移氧化细胞膜上的基团，从而引发细胞死亡，产生的副产物为水、氧和二氧化碳[3]，对人体较安全。此外，有研究指出先灭菌有利于提高细胞的脱除效率[8]，故本文使用这两种灭菌方法作为脱细胞的前处理。
脱细胞真皮基质要脱除具有免疫抗原性的细胞，本文通过 HE 染色发现 B 组无核酸成分，脱细胞效果优于 A 组，说明酶对细胞脱除具有显著的效果。使用 SEM 和 AFM 观察材料微观结构[27-31]，结果显示 A、B 组材料在微观结构方面与 C 组相比差异均无统计学意义，但 A 组纤维直径相对 B 组与 C 组较小，提示 PAA 灭菌后高渗盐处理对纤维直径的破坏较大。
孔隙率反映材料内部的疏松程度，孔隙率越大，材料内部越疏松，细胞越容易长入材料内部。A、B 组孔隙率均远大于对照组 C 组，而 A 组与 B 组孔隙率相比差异无统计学意义，提示两种方法处理的基质内部孔隙基本一致。一般方法的支架孔隙率约为（74.28 ± 2.06）%[32-34]，而本研究的脱细胞真皮基质孔隙率为（84.9 ± 5.0）% 和（86.7 ± 2.1）%，高于传统方法。检测发现正常组织中间也存在空隙，对比正常组织孔隙率可间接证明本文细胞脱除的有效性。较大的孔隙率初步表明本文脱细胞真皮基质的结构便于细胞长入[35-36]。支架移植后需要包扎治疗，承受压力，故本研究检测脱除细胞前、后的支架压缩弹性模量[37]，结果表明 A 组高渗盐水处理、B 组酶处理后脱细胞真皮基质的压缩弹性模量接近正常皮肤，说明脱细胞处理未影响基质压缩弹性模量。
为了探索本文脱细胞基质在化学组分上是否有利于细胞长入，我们检测了样品脱细胞前、后的组分及含量变化。检测胶原总含量变化发现，与 C 组相比，A、B 组胶原总含量下降，差异具有统计学意义（均为 P < 0.01）。A 组或许是酸性环境加速了胶原蛋白的水解，B 组或许是 γ 射线使胶原缺失[3]。Ⅰ、Ⅲ型胶原是皮肤中含量最多的两种胶原成分，分别占皮肤胶原总量的 80%～85% 和 10%～15%[38]，据文献报道胶原比例与人的年龄与取皮位置有关[39-41]，成人Ⅰ/Ⅲ型胶原比值范围为 1～2。本研究检测这两种胶原比例比值约为 1，与邱林[42]报道的比值 1.2～1.3 相近，且经处理后胶原比例在 B 组与对照组之间差异无统计学意义。说明 B 组很好地保留了胶原比例，即 γ 射线灭菌、酶处理未显著破坏胶原Ⅰ/Ⅲ的比例。两组基质脱细胞后胶原蛋白总含量均有所下降，但是 B 组Ⅰ/Ⅲ型胶原的比例与对照组相比差异无统计学意义，说明 B 组脱细胞后细胞外基质的改变较小。
纤连蛋白可影响细胞的黏附、迁移，本文 B 组纤连蛋白明显少于 C 组，暗示 γ 射线照射和酶处理会使基质损失一部分纤连蛋白，而 PAA 灭菌、高渗盐水脱细胞的纤连蛋白保留效果较好。弹性纤维蛋白与支架弹性相关，故本文通过红外光谱图定性检测了脱细胞前、后各组弹性蛋白[43]，发现 A、B 组与对照组均出现弹性蛋白特征峰，说明两组脱细胞方法对弹性蛋白无影响。脱细胞支架使用目的是要植入人体，要求脱细胞基质对细胞无毒性。A、B 组材料的生物学活性差异无统计学意义，猜测与支架的微观形貌结构差异无统计学意义有关，与材料的化学组分结构、成分相近有关。
综上所述，A 组与 B 组性能对比发现，A 组纤连蛋白保留较好，但细胞脱除效果不如 B 组；B 组对胶原比例的破坏低于 A 组，且细胞脱除效果优于 A 组；基质与细胞共培养 24 h 以上发现，A、B 组基质对细胞生长的影响差异无统计学意义，但这只是短期的培养，若要应用于人体，后期需要检测材料与细胞共培养较长时间细胞的生长状态。
4 结论
本文认为 γ 射线灭菌后，Trypsin 酶脱细胞对脱细胞真皮基质的理化特性无显著破坏作用，其制备的脱细胞真皮基质的理化特性较 PAA 灭菌后高渗盐脱细胞更接近于对照组。故本文认为 γ 射线灭菌、0.05% Trypsin 酶/EDTA 脱细胞制备脱细胞基质性能较好。本文中 γ 射线灭菌后，Trypsin 酶脱细胞构建的脱细胞基质不仅可以直接用于组织工程皮肤的构建，还可为异种真皮脱细胞基质的制备及裱衬提供参考，为静电纺丝或 3D 打印组织工程皮肤支架提供理化参数。
利益冲突声明：本文全体作者均声明不存在利益冲突。
