Documento

 

Guías Latinoamericanas de la RIICER para el diagnóstico de las rickettsiosis transmitidas por garrapatas

Latinamerican guidelines of RIICER for diagnosis of tick-borne rickettsioses

 

José A. Oteo, Santiago Nava, Rita de Sousa, Salim Mattar, José M. Venzal, Katia Abarca, Marcelo B. Labruna y Jorge Zavala-Castro, por la RIICER

Hospital San Pedro-CIBIR. Logroño, España.
Departamento de Enfermedades Infecciosas.
Centro de Rickettsiosis y Enfermedades Transmitidas por Artrópodos Vectores (JAO).
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria.
Rafaela, Argentina (SN).
Centro de Estudos de Vectores e Doenças Infecciosas. Águas de Moura, Portugal (RS).
Universidad de Córdoba.
Colombia. Instituto de Investigaciones Biológicas del Trópico (SM).
Universidad de la República.
Salto, Uruguay.
Laboratorio de Vectores y Enfermedades Transmitidas, Regional Norte (JMV).
Pontificia Universidad Católica, Santiago, Chile.
Facultad de Medicina. División de Pediatría (KA).
Universidad de Sao Paulo, Brasil.
Departamento de Medicina Veterinaria Preventiva e Saúde Animal (ML).
Centro de Investigación Regional Dr. Hideyo Noguchi. Mérida, México (JZ-C).

*Por la RIICER (Red Iberoamericana para la Investigación y Control de las Enfermedades Rickettsiales) del Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED)

**Miembros de la RIICER en orden alfabético: Katia Abarca (Pontificia Universidad Católica de Chile; Chile), Sergio Bermúdez (Instituto Gorgas; Panamá), Gaby Dolz (Universidad Nacional; Costa Rica), Marcelo B. Labruna (Universidad de Sao Paulo; Brasil), Salim Mattar (Universidad de Córdoba; Colombia), Santiago Nava (Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria; Argentina), José A. Oteo (Hospital San Pedro-CIBIR; España), Luis Romero (Ministerio de Agricultura y Ganadería; El Salvador), Rita de Sousa (Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge; Portugal), José M. Venzal (Universidad de la República; Uruguay), Jorge Zavala-Castro (Centro de Investigación Regional Dr. Hideyo Noguchi; México).

Conflictos de interés: Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés.

Financiamiento: RIICER (Red Iberoamericana para la Investigación y Control de las Enfermedades Rickettsiales) del Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo (CYTED).

Correspondencia a:

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Tick-borne rickettsioses are worldwide infectious diseases that are considered emerging and re-emerging. Until recently the only tick-borne rickettsiosis present in Latin America was Rickettsia rickettsii infection, but to date, with the incorporation of new tools as PCR and sequencing and the quick cellular close tube cultures (Shell-vial), new species has been involved as human pathogens. In these guidelines, we offer an update of the microbiological assays for diagnosing rickettsioses. Besides we have included a section in which the most important hard ticks involved in human rickettsioses in Latinoamerica are detailed.

Key words: Rickettsioses; guidelines; Latin America; ticks; indirect immunofluorescence; PCR; cellular culture.

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Resumen

Las rickettsiosis transmitidas por garrapatas son afecciones de distribución mundial, que por diferentes motivos se pueden considerar emergentes y reemergentes. Hasta hace escasos años la única rickettsiosis transmitida por garrapatas en Latinoamérica era la infección por Rickettsia rickettsii, pero en la actualidad y fundamentalmente, gracias a la incorporación de nuevas herramientas para el diagnóstico microbiológico como la reacción en cadena de la polimerasa y secuenciación o el cultivo celular rápido en tubo cerrado, se han descrito e involucrado otras especies de Rickettsia en la producción de patología humana. En estas guías se detallan y describen las diferentes técnicas utilizadas para el diagnóstico microbiológico de las rickettsiosis. Además, se incluye una sección en la que se detallan las especies más importantes de garrapatas duras relacionadas con las rickettsiosis en Latinoamérica, con claves para su clasificación taxonómica.

Palabras clave: Rickettsiosis; guías; Latinoamérica; garrapatas; inmunofluorescencia indirecta; RPC; cultivo celular.

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Introducción

Las rickettsiosis o enfermedades provocadas por Rickettsia spp., son afecciones de distribución mundial transmitidas por artrópodos vectores que por diferentes motivos tienen un carácter emergente y re-emergente^1-4. Algunos autores han querido ver en las rickettsiosis, y específicamente en el tifus exantemático o epidémico transmitido por piojos, el origen de las grandes plagas que asolaron Europa y el Nuevo Mundo. La Paleomicrobiología ha dado respuesta a muchas de estas cuestiones históricas, y aunque dudosamente fue causa de estas plagas, sabemos a ciencia cierta que Rickettsia prowazeki ha sido causante de millones de muertes hasta el siglo pasado. Si fue introducida en el siglo XV por los españoles en el "Nuevo Mundo" o existía ya en América es un tema de debate. Hubo que esperar hasta 1909 para que Charles Nicolle diera a conocer que el piojo era el vector de esta terrible infección, y que con simples medidas higiénicas, como cambiarse de ropa y lavarla con cierta frecuencia, se rompía la cadena de transmisión. Casi paralelamente, en los Estados Unidos de América (E.U.A.), Howard T. Ricketts describió entre 1906 y 1909 las características del agente causal de la fiebre manchada de las Montañas Rocosas, Rickettsia rickettsii, en este caso, transmitida por garrapatas. A partir de aquí, comenzó una carrera por la descripción de estos agentes y los diferentes vectores implicados en su transmisión. No obstante, ha sido en los últimos 20 años cuando se ha dado un gran empuje al conocimiento de estas infecciones. Este empuje se ha propiciado gracias a la incorporación de las técnicas de biología molecular y a la extensión del uso de los medios de cultivo celular en tubo cerrado o shell-vial que han permitido describir nuevas especies de Rickettsia e implicarlas en diferentes cuadros clínicos⁵.

A pesar de que el riesgo de una posible epidemia de tifus exantemático relacionada con focos de pobreza, hacinamiento, o falta de higiene en el contexto de una guerra o desastre natural, no se puede descartar, en la actualidad son las rickettsiosis transmitidas por garrapatas las que por su carácter endémico y emergente nos preocupan. A este respecto, hasta hace escasos años, la única rickettsiosis transmitida por garrapatas en el continente americano era la provocada por R. rickettsii (fiebre manchada de las Montañas Rocosas, fiebre de Tobía, fiebre maculosa brasilera, etc.) ya que Rickettsia africae quedaba confinada a algunas islas del Caribe³. La reciente implicación de Rickettsia parkeri como agente causal de fiebres manchadas en América^6,7 y la descripción de otras especies de Rickettsia con poder patógeno ha cambiado nuestra percepción del riesgo y extensión de estas afecciones^8,9.

El continente americano, sobre todo Centroamérica y algunos países de Sudamérica, está sufriendo una gran epidemia de dengue. Considerando que la clínica de ambas afecciones puede ser similar (fiebre con o sin exantema y signos pseudo-gripales), y que en algunos casos la confusión o un retraso en el diagnóstico puede resultar fatal, es altamente necesario que los clínicos posean herramientas para distinguir una rickettsiosis de ésta u otras entidades.

El género Rickettsia incluye las bacterias del phylum Proteobacteria, subclase α-1 del orden Rickettsiales. Viven en el citoplasma y con menos frecuencia en el núcleo de las células que infectan y se caracterizan por ser pequeños cocobacilos (0,3 a 1 μm) de crecimiento obligado intracelular. Tienen un genoma que oscila entre 1,1 y 1,6 Mb. A pesar de ser clasificadas como gramnegativas, se tiñen mal mediante esta tinción, pudiéndose poner de manifiesto mediante la tinción de Giménez, Giemsa y naranja de acridina^10,11. En su pared poseen lipopolisacárido (LPS) y peptidoglicano. No crecen en los medios de cultivo habituales, precisando animales de laboratorio, huevos embrionados o líneas celulares como Vero, HEL, L-929 o líneas celulares de artrópodos. Presentan además diferentes proteínas mayores de superficie, entre las que destacan la OmpA (190 kDa) que está presente fundamentalmente en las rickettsias del grupo de las fiebres manchadas (rickettsiosis transmitidas por garrapatas y Rickettsia felis) y la OmpB (135 kDa), presente en todas las especies de Rickettsia. Estas proteínas de superficie son importantes dianas para la inmunidad humoral y también se utilizan para la serotipificación. El LPS de las rickettsias contiene zonas altamente antigénicas que son responsables de las reacciones cruzadas observadas entre las diferentes especies de Rickettsia.

Las especies de Rickettsia pasan, al menos parte de su ciclo vital, en un artrópodo que puede actuar a su vez como reservorio y/o como vector¹¹, y han sido clasificadas en dos grupos: grupo tifus (GT) que incluye Rickettsia typhi y R. prowazekii cuyos vectores son pulgas y piojos respectivamente; y el grupo de las fiebres manchadas (GFM) que incluye más de 20 especies y tienen como principales vectores a las garrapatas duras (Ixodidae)¹⁰. No obstante, estudios basados en las secuencias genómicas han definido otros dos grupos (ancestral y transicional)¹².

Muchas rickettsias del GT y GFM causan enfermedades en humanos y posiblemente en animales en diferentes partes del mundo. El tifus exantemático o epidémico, transmitido por el piojo corporal (Pediculus humanus corporis) y el tifus murino o endémico, transmitido por la pulga de la rata (Xenopsylla cheopis) y por la pulga del gato (Ctenocephalides felis), están o han estado presentes en todo el mundo¹³. En contraste, las rickettsias del GFM, si bien se han descrito también en todo el mundo, tienen su distribución íntimamente relacionada con la distribución de las diferentes especies de garrapatas. Una excepción del GFM es la fiebre manchada transmitida por pulgas, provocada por R. felis, que tiene una distribución prácticamente universal al igual que su vector (C. felis)¹⁴. Existen otras rickettsiosis que son transmitidas por ácaros como es el caso de Rickettsia akari, vehiculada por el ácaro del ratón común (Allodermanyssus sanguineus) y distribuida por todo el mundo, o el caso de Orientia tsutsugamushi (antes Rickettsia tsutsugamushi) vehiculada por diferentes especies de trombicúlidos y causante de la fiebre de los matorrales en diferentes zonas de Oriente^1,4,10. Esta última ha sido recientemente diagnosticada por primera vez en América, específicamente en Chile¹⁵.

Gracias a las técnicas de biología molecular y al desarrollo del cultivo de estos agentes en tubo cerrado (shell-vial), en las últimas décadas se ha producido un incremento en la descripción de nuevas especies y de Candidatus a nuevas especies. Algunas de ellas, previamente consideradas no patógenas, han demostrado su patogenicidad en humanos. Es el caso en Europa de Rickettsia slovaca, Rickettsia aeschlimannii, Rickettsia massiliae y Rickettsia monacensis o 'Candidatus Rickettsia rioja'². En América, el ejemplo es R. parkeri, un viejo miembro del GFM, descrito por primera vez en 1939, que 65 años más tarde ha resultado ser patógena⁷. Estos hechos demuestran que cualquier especie nueva de Ricketsia descrita en garrapatas, debe ser considerada potencialmente patógena para los humanos. Así, en los próximos años habrá que poner atención a lo que suceda con las especies y candidatas a especies que están siendo descritas en Latinoamérica como Rickettsia sp. cepa colombianense, variantes de R. parkeri o 'Candidatus Rickettsia andeanae,^8,16,17.

El diagnóstico de las rickettsiosis transmitidas por garrapatas sigue basándose fundamentalmente en la sospecha clínica (fiebre con o sin exantema y/o con o sin escara en el punto de picadura de la garrapata) y en la detección de anticuerpos mediante técnicas de serología como la inmunofluorescencia indirecta (IFI). Otras técnicas ya señaladas como el cultivo y sobre todo las técnicas de biología molecular, como la reacción de polimerasa en cadena (RPC) y posterior secuenciación, se van incorporando a la rutina de los laboratorios de microbiología clínica.

Recientemente, por mediación del CYTED (Programa Iberoamericano de Ciencia y Tecnología para el Desarrollo), se creó la Red Iberoamericana para la Investigación y Control de las Enfermedades Rickettsiales (RIICER). Una de sus primeras actividades fue la realización de un catálogo de las rickettsiosis presentes en Iberoamérica³. Cumpliendo con los objetivos de la red, los miembros de la RIICER ofrecemos estas guías consensuadas para el diagnóstico de las rickettsiosis transmitidas por garrapatas en Latinoamérica. Tras esta introducción se detallan y describen las diferentes técnicas utilizadas para el diagnóstico microbiológico de las rickettsiosis. Además, nos ha parecido interesante incluir una sección en la que se detallan las diferentes especies de garrapatas relacionadas con las rickettsiosis en Latinoamérica, con claves para su clasificación taxonómica.

Estamos convencidos de que un correcto diagnóstico puede salvar muchas vidas, y que es fundamental distinguir los diferentes cuadros clínicos causantes de fiebre y exantema. Al igual que otras sociedades científicas de E.U.A. y Europa que han elaborado sus guías^18-20, esperamos que éstas sean de utilidad para la comunidad científico-médica en Latinoamérica.

Diagnóstico microbiológico

Recolección, conservación y transporte de las muestras humanas y garrapatas

La selección de las muestras dependerá en cierta medida de los signos y síntomas con los que se presente el paciente, del tiempo de evolución de la enfermedad, así como de la infraestructura y capacidades de diagnóstico disponibles en el laboratorio de microbiología donde se vayan a procesar. Los especímenes más adecuados para el diagnóstico de rickettsiosis son: sangre con anticoagulante (heparina, EDTA y citrato); suero; biopsia cutánea de las pápulas, vesículas o escara de inoculación; hisopado de la escara; y la propia garrapata (Tabla 1)^19-21. La selección de la muestra dependerá del tipo de diagnóstico solicitado por el médico clínico (serología, técnicas moleculares o cultivo). En lo posible, siempre se debe recoger la mayor cantidad de la muestra o muestras a estudiar y guardar parte de las mismas para posteriores evaluaciones o empleo futuro de otras técnicas. En función de la muestra objeto de estudio, ésta se recogerá de forma estéril y, de ser posible, antes del inicio del tratamiento antibacteriano.

Tabla1. Recomendaciones para el diagnóstico de rickettsiosis, incluyendo tipo de muestra, conservación y transporte

 

Las muestras remitidas al laboratorio deben cumplir una serie de condiciones que determinarán, en cierto grado, la eficiencia y la calidad de los resultados obtenidos (Tabla 1). Además, para optimizar la rentabilidad microbiológica resulta de vital importancia transportar la muestra en unas determinadas condiciones de temperatura en el menor tiempo posible. Por ejemplo, en el caso de que se vaya a realizar cultivo, el procesamiento de la muestra no se debe demorar. En el caso de que no se pueda procesar de forma inmediata o en las próximas horas, y/o se vaya a enviar a un centro de referencia, se debe congelar a -80^OC lo antes posible. Las muestras se deben recoger y enviar en contenedores estériles con cierre hermético, mediante mensajería urgente en hielo seco para evitar la descongelación. Se debe tener siempre presente la legislación vigente en cada país sobre transporte de materiales biológicos y peligrosos²².

Aunque hay pocos estudios sobre la disminución de la viabilidad de las rickettsias a temperatura ambiente o por la acción de la congelación-descongelación de la muestra, es conocida la dificultad de aislar estos agentes a partir de muestras en las que se demora el cultivo celular. Factores como la temperatura elevada (> 37°C), el sobre-crecimiento de otras bacterias y la refrigeración prolongada, pueden comprometer el aislamiento de las rickettsias²³. Menos requerimientos se precisan para el diagnóstico molecular, puesto que los ácidos nucleicos permanecen estables aun cuando la bacteria no es viable. Por tanto, en estos casos las muestras se enviarán refrigeradas. En el caso de que el procesamiento se vaya a demorar más de 24 h, las muestras se deben congelar a -20^oC. El recipiente de recogida se identificará con los datos del paciente (nombre y localización), y debe estar protegido para que no se rompa en el transporte.

Los utensilios y envases con los que se recogerán y transportarán las muestras dependen del tipo de la misma (Tabla 1). Básicamente pueden ser: tubos estériles con tapón para sangre, frascos estériles para fragmentos de tejidos y garrapatas, o hisopos de algodón estériles para la toma de muestras de superficies corporales (secreciones de pápulas y máculas, o las tomadas directamente sobre la escara de inoculación).

Al llegar al laboratorio se debe tener en cuenta que todas las muestras clínicas deben manejarse como si tuvieran microorganismos potencialmente peligrosos. Antes de procesarse deben someterse a una inspección ocular para asegurarse que han sido bien seleccionadas, recolectadas y transportadas. En función del examen solicitado la muestra se procesará en un laboratorio con un nivel de bioseguridad 2 ó 3.

Diagnóstico serológico de las rickettsiosis mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI)

La IFI es la técnica más utilizada para el diagnóstico de las rickettsiosis. Se basa en la detección de anticuerpos (Ac) en el suero del paciente, puestos de manifiesto mediante una anti-globulina humana marcada con fluoresceína y que, en caso de una reacción positiva, permite la visualización de las rickettsias mediante el microscopio de fluorescencia (Figura 1). La muestra a estudiar es el suero, el cual se puede mantener a temperatura ambiente por corto tiempo o refrigerado durante varios días. En el caso de que no se vaya a procesar en las siguientes 48 horas, se debe congelar (mínimo a -20^oC). Debido a que la producción de Ac en un paciente afecto de rickettsiosis puede tardar varias semanas, se debe obtener suero en el momento agudo de la enfermedad y en la fase de convalecencia (al menos tras dos semanas)^19,20. La IFI es usada para detectar las inmunoglobulinas IgM e IgG, tanto en fase aguda como en la convalecencia. En general, están establecidos como punto de corte títulos de IgG ≥ 1: 64 e IgM ≥ 1: 32¹⁹. Dado que la prevalencia de Ac en la población sana puede ser elevada, un simple título de Ac no debe considerarse, por sí solo, diagnóstico de infección activa. La confirmación del diagnóstico de rickettsiosis requiere una seroconversión (es decir pasar de la no detección de Ac a ser detectados) o un sero-refuerzo (aumento mínimo de cuatro veces del título entre el primer suero y el de convalecencia). En el contexto de un síndrome clínico compatible con rickettsiosis una determinación de Ac de tipo IgM puede ser muy sugestiva de rickettsiosis, aunque también se debe considerar que la detección de Ac de tipo IgM puede ser un falso positivo por la presencia de factores reumatoides tipo IgM y otras múltiples reacciones cruzadas. Existen en el mercado varios kits comerciales que utilizan antígenos de diferentes especies. Los más utilizados emplean R. rickettsii, R. conorii y R. typhi. En algunos laboratorios y en centros de referencia se pueden conseguir portaobjetos con otras especies de Rickettsia.

Figura 1. Visualización de rickettsias mediante microscopía de fluorescencia.

 

Es importante tener en cuenta que la IFI no permite identificar la especie de Rickettsia que está provocando la reacción. Existen reacciones cruzadas entre las diferentes especies de Rickettsia e incluso con otros géneros bacterianos. Para una correcta interpretación de los resultados serológicos se debe tener en cuenta la historia clínica del paciente, así como los datos de reactividad basal de la población (sobre todo en zonas endémicas).

Para aumentar la especificidad de la técnica se ha recomendado la absorción de los Ac del suero provocados por infecciones previas con otras especies de Rickettsia (absorción cruzada), y posteriormente realizar la IFI, o utilizar diferentes antígenos y, en función de los títulos que se obtengan en la IFI, otorgar la responsabilidad de la infección a la especie que más reactividad provoque. El problema es que existe un gran número de "nuevas" especies y que habría que disponer de una gran cantidad de antígenos. En todo caso, los costos serían muy elevados y la técnica nunca será tan específica como el cultivo o los métodos moleculares. Existen otras técnicas serológicas basadas en la detección de Ac (ej: ELISA, Western-blot) que no se encuentran bien estandarizadas y que de momento no se han incorporado a la rutina de los laboratorios de microbiología clínica. En el anexo 1 se explica de forma detallada la metodología de realización de una IFI.

Cultivo de Rickettsia

El cultivo es la técnica diagnóstica más específica y, como tal, se considera la prueba de referencia o estándar de oro. Además, resulta fundamental para la obtención de antígenos y para estudiar la sensibilidad a los antimicrobianos. También es necesaria para establecer una nueva especie de Rickettsia. Sin embargo, el aislamiento de rickettsias mediante cultivo celular convencional a partir de una muestra procedente de un paciente con rickettsiosis, es un proceso muy laborioso y solamente realizado en laboratorios especializados. Las muestras deben manejarse como potencialmente peligrosas y se requiere un nivel 3 de bioseguridad.

La muestra más adecuada para el cultivo de rickettsias es la sangre tratada con citrato o heparina (plasma y/o buffy coat o capa leucocitaria), pero también se pueden utilizar muestras de tejido (biopsias), otros líquidos estériles (LCR, etc.) o la propia garrapata^19,20. La muestra se debe recoger en tubos estériles (ej: Vacutainer) y mantenerla refrigerada el mismo día de la extracción y sin congelar. Si la muestra no se va a procesar de forma inmediata, se debe congelar a -80^oC hasta su procesamiento (Tabla 1). No todas las especies de Rickettsia crecen con la misma facilidad. Así, mientras que R. rickettsii y R. parkeri son fáciles de aislar, otras especies son cultivadas con mucha dificultad y en raras ocasiones. La rentabilidad del cultivo se ve enormemente disminuida si las muestras se han obtenido una vez comenzado el tratamiento antimicrobiano. A lo largo de la historia, para llevar a cabo el crecimiento de las rickettsias en el laboratorio, se han empleado animales de laboratorio o huevos embrionarios, aunque en la actualidad se trabaja con líneas celulares. A este respecto, las líneas celulares más utilizadas son las VERO-E6 (ATCC CCL-81), fibroblastos L929 y también diferentes líneas celulares derivadas de artrópodos. El crecimiento de las rickettsias en estas líneas celulares es un proceso lento y además, el efecto citopático no es siempre visible, y en el caso de que se produzca, no es específico de especie. Se recomienda un equipamiento especial (laboratorio de bioseguridad 3) y personal muy entrenado. En la actualidad, el cultivo se debe complementar con técnicas moleculares para determinar específicamente la especie de Rickettsia aislada.

En los últimos años se está utilizando una adaptación del cultivo celular tradicional (centrifugación en shell-vial o cultivo celular rápido en tubo cerrado) que consiste en inocular la muestra sobre una monocapa de células susceptibles previamente crecidas sobre un portaobjetos circular y, posteriormente, realizar una centrifugación para facilitar que las rickettsias penetren en las células. En el anexo 2 se detalla la técnica. Mediante esta técnica se consigue aumentar la sensibilidad del cultivo (ya que se inocula la misma cantidad de muestra pero en una superficie más pequeña) y acortar el tiempo de incubación. Después de 5-7 días de incubación se puede detectar la presencia de la bacteria mediante tinción de Giménez (Figura 2), IFI con anticuerpos específicos o mediante técnicas moleculares como la RPC y secuenciación. Esta técnica es más segura para el manipulador ya que se trabaja en un tubo cerrado y con menos volumen. En la actualidad se considera el método de elección si se pretende aislar una Rickettsia sp.

Figura 2. Rickettsia sp. en células Vero puestas de manifiesto mediante tinción de Giménez.

 

Detección molecular (RPC y secuenciación)

Los métodos moleculares basados en la RPC se han convertido en herramientas rápidas, sensibles y específicas para la detección e identificación de rickettsias en distintos tipos de muestras (sangre, biopsias cutáneas, LCR, exudados, raspado de escaras y garrapatas). Los genes más comúnmente analizados son el gen gltA, que codifica la enzima citrato sintetasa (presente en todas la rickettsias) y los que codifican dos proteínas de la membrana externa: OmpA (presente en todas las especies del GFM) y OmpB (presente en todas las especies excepto R. bellii). Existen otras posibles dianas diagnósticas más o menos específicas de Rickettsia spp., como el gen htrA, que codifica la proteína de superficie de 17kDa, el gen sca4, o el menos específico pero siempre presente gen ARNr 16S. En la Tabla 2 se muestran las secuencias de los iniciadores (primers) utilizados en la identificación del género Rickettsia con sus correspondientes referencias (24-33). Una vez que se obtiene un resultado positivo se debe proceder a la secuenciación. Para llegar a la especie implicada resulta necesaria la utilización de más de una diana, sobre todo cuando se utilizan fragmentos cortos o dianas poco específicas. Inicialmente para el diagnóstico molecular se recomienda realizar un tamizaje con las dianas más sensibles (gltA y ompB). Por otro lado, las secuencias más específicas se obtienen mediante la utilización de ompA³⁴.

Tabla 2. Diagnóstico molecular de rickettsias. Dianas, iniciadores y condiciones de la reacción de polimerasa en cadena (RPC)

 

La secuencia de ácidos nucleicos se edita mediante el empleo de un software específico y se compara utilizando secuencias de referencia o bien directamente en GenBank mediante el programa BLAST, National Center for Biotechnology Information (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

En el caso de que la muestra clínica de la que dispongamos sea una garrapata, antes de su procesamiento para la búsqueda de patógenos, es recomendable congelar medio ejemplar por la posibilidad de necesitarla para posteriores estudios. Los pasos a seguir se describen en el anexo 3.

La posibilidad de una contaminación por la utilización de controles positivos se debe tener presente, por lo que es recomendable emplear una especie de Rickettsia que no circule en Latinoamérica, por ejemplo, una rickettsia que esté sólo presente en Europa.

En los últimos años también se ha utilizado la RPC a tiempo real o RPC cuantitativa para la detección de rickettsias en muestras clínicas²³. Esta variante de la RPC permite amplificar y cuantificar de manera absoluta el producto de la reacción.

Principales garrapatas vectores de rickettsia en Latinoamérica

Las garrapatas (Acari: Ixodida) son ectoparásitos hematófagos de vertebrados terrestres, incluyendo animales domésticos y al hombre. La importancia sanitaria de las garrapatas radica en su capacidad para actuar como vectores de microorganismos patógenos como protozoos, rickettsias, espiroquetas y virus, y por su potencial para provocar toxicosis, parálisis, irritación y alergia a sus hospedadores^35,36. Son consideradas, junto con los mosquitos, como los artrópodos vectores más importantes de agentes patógenos³⁵. Particularmente, en la región neotropical hay descritas 200 especies de garrapatas, de las cuales 116 pertenecen a la familia Ixodidae^37,38 y 84 a la familia Argasidae^37,39. En Latinoamérica y el Caribe, las especies de garrapatas implicadas como vectores comprobados o potenciales de rickettsias están incluidas dentro de los géneros Amblyomma, Rhipicephalus, Haemaphysalis y Dermacentor³, todos pertenecientes a la familia Ixodidae.

En el caso particular de las rickettsiosis humanas en Latinoamérica, las principales especies de garrapatas involucradas como vectores en la epidemiología de estas enfermedades son Amblyomma cajennense, Amblyomma triste, Amblyomma ovale, Amblyomma aureolatum y Rhipicephalus sanguineus^40,41. Uno de los principales vectores de R. rickettsii en Latinoamérica es A. cajennense (Figuras 3A, 3B)³, cuya distribución abarca distintos ambientes ecológicos desde el sur de E.U.A. al norte de Argentina³⁷. Otros vectores de R. rickettsii son A. aureolatum (Figuras 3C, 3D), registrada en Argentina, Brasil, Guyana Francesa, Paraguay, Surinam y Uruguay, y R. sanguineus (Figuras 3E, 3F), un taxón cosmopolita también con capacidad para transmitir R. massiliae^3,37. Otras dos especies de la familia Ixodidae, A. triste (Figuras 4A, 4B) y A. ovale (Figuras 4C, 4D), han sido determinadas como vectores de R. parkeri en Sudamérica³. La primera está presente en Argentina, Brasil, Chile, Colombia, Ecuador, Paraguay, Perú, Uruguay, Venezuela, México y E.U.A.^17,41,42, mientras que A. ovale se distribuye en Argentina, Belice, Bolivia, Brasil, Colombia, Costa Rica, Ecuador, Guyana Francesa, Guatemala, Guyana, México, Nicaragua, Panamá, Paraguay, Perú, Surinam, Trinidad y Tobago y Venezuela³⁷.

Figura 3. Garrapatas de la familia Ixodidae involucradas en la transmisión de rickettsias en Latinoamérica. A) Macho de Amblyomma cajennense sensu lato; B) Hembra de Amblyomma cajennense sensu lato; C) Macho de Amblyomma aureolatum; D) Hembra de Amblyomma aureolatum; E) Macho de Rhipicephalus sanguineus sensu lato; F) Hembra de Rhipicephalus sanguineus sensu lato.

Figura 4. Garrapatas de la familia Ixodidae involucradas en la transmisión de rickettsias en Latinoamérica. A) Macho de Amblyomma triste; B) Hembra de Amblyomma triste; C) Macho de Amblyomma ovale; D) Hembra de Amblyomma ovale.

 

En el anexo 4 se muestran unas claves básicas que permiten llegar al género de las garrapatas que actúan como vectores de rickettsiosis en Latinoamérica.

Anexo 1. Diagnóstico de Rickettsias. Protocolo para la realización del ensayo de IFI

Anexo 2. Diagnóstico de rickettsias. Cultivo celular rápido o centrifugación en shell-vial

Anexo 3. Diagnóstico de Rickettsias. Protocolo para la realización de la técnica de reacción de polimerasa en cadena (RPC)

Anexo 4. Clave para la identificación de los de los distintos géneros de garrapatas de la familia Ixodidae presentes en Latinoamérica y el Caribe1

 

Referencias bibliográficas

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Recibido: 17 de diciembre de 2013

Correspondencia a: José A. Oteo jaoteo@riojasalud.es