Artículo de Revisión

 

Principales factores de virulencia de Listeria monocytogenes y su regulación

Main virulence factors of Listeria monocytogenes and its regulation

 

Alejandra Vera, Gerardo González, Marlana Domínguez y Helia Bello

Universidad de Concepción, Concepción, Chile. Facultad de Ciencias Biológicas Departamento de Microbiología Laboratorio de Investigación en Agentes Antibacterianos.
Los autores declaran no tener conflictos de interés. Financiamiento: No existe.

Correspondencia a:

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Listeria monocytogenes is a facultative intracellular pathogen, ubiquitous and aetiological agent of listeriosis. The main way of acquisition is the consumption of contaminated food and can cause serious medical conditions such as septicemia, meningitis and gastroenteritis, especially in children, immunocompromised individuals and seniors and abortions in pregnant women. An increase in cases of listeriosis worldwide has been reported and it is estimated that its prevalence in developed countries is in the range of 2 to 15 cases per one million population. This microorganism is characterized for the transition from the environment into the eukaryotic cell. Several virulence factors have been involved in the intracellular cycle that are regulated, pimarilly, by the PrfA protein, which in turn is regulated by different mechanisms operating at the transcriptional, translational and post-translational levels. Additionally, other regulatory mechanisms have been described as sigma factor, system VirR/S and antisense RNA, but PrfA is the most important control mechanism and is required for the expression of essential virulence factors for the intracellular cycle.

Key words: Listeria monocytogenes, virulence factor.

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Resumen

Listeria monocytogenes es un patógeno intracelular facultativo, ubicuo y agente etiológico de listeriosis. La principal vía de adquisición es el consumo de alimentos contaminados, pudiendo ocasionar cuadros clínicos muy graves como septicemia, meningitis y gastroenteritis, especialmente en niños, individuos inmunocomprometidos y de la tercera edad, y aborto en mujeres embarazadas. Se ha informado un aumento en los casos de listeriosis a escala mundial y se estima que su frecuencia en los países desarrollados está en un rango de 2 a 15 casos por millón de habitantes. Este microorganismo se caracteriza por realizar una transición desde el medio ambiente hacia la célula eucariota. Para este proceso se han descrito varios factores de virulencia, los cuales están involucrados en el ciclo intracelular y están regulados, principalmente, por la proteína PrfA, la cual a su vez está regulada por diferentes mecanismos que actúan a nivel transcripcional, traduccional y post-traduccional. Además, se han descrito otros mecanismos regulatorios como: factor Sigma, sistema VirR/S y ARN sin sentido. No obstante, PrfA es el mecanismo de control más importante y el cual es requerido para la expresión de los factores de virulencia esenciales para el ciclo intracelular.

Palabras clave: Listeria monocytogenes, factores de virulencia.

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Introducción

Listeria monocytogenes es un patógeno intracelular facultativo extensamente difundido en la naturaleza y que se encuentra adaptado para vivir, tanto en suelo como en el citosol de una célula eucariota¹. El género Listeria comprende bacilos grampositivos que pueden estar solos o formando cadenas cortas, no producen cápsula ni esporas. Este microorganismo crece a temperaturas que oscilan entre menos 0 y 45 °C, tolera diferentes rangos de pH (4,5-9,2) y sobrevive a altas concentraciones de NaCl (10% w/v)². Este género incluye las especies L. monocytogenes, L. ivanovii, L. seeligeri, L. grayi, L. innocua, L. welshimeri, así como dos nuevas especies identificadas recientemente, en el año 2009, L. marthii y L. rocourtiae^{3 4}. De todas estas especies, sólo L. monocytogenes y L. ivanovii son potencialmente patógenas, siendo L. monocytogenes patógeno para el hombre y L. ivanovii patógena para bovinos y rumiantes pequeños; sin embargo, se han descrito algunos casos esporádicos, en los que se ha aislado a esta última especie como agente etiológico de gastroenteritis y septicemia en un hombre, indicando su potencial patogénico para el hombre^5,6.

Considerando los antígenos somático (O) y flagelar (H), las cepas de L. monocytogenes pueden ser clasificadas en 13 serotipos (1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 7); sin embargo, se ha determinado que sólo 3 (1/2a, 1/2b y 4b), son responsables de más de 98% de los casos de listeriosis en humanos^1,7,8. Los estudios filogenéticos y de subtipificación han mostrado que L. monocytogenes forma una población estructurada, compuesta de cuatro linajes divergentes, designados como I, II, III y IV⁵. Los linajes I y II incluyen a la mayoría de los aislados vinculados a los casos clínicos de listeriosis. El linaje I agrupa a los serotipos 1/2b, 3b y 4b y se le ha identificado un mayor potencial patogénico que el linaje II, el que está compuesto por los serotipos 1/2a, 1/2c, 3a y 3c^5,9. Los linajes III y IV agrupan a cepas de los serotipos 4a, 4c y un 4b atípico⁵.

Listeria monocytogenes se transmite principalmente a través de alimentos, llegando a ocasionar cuadros clínicos muy graves en el hombre, como septicemia, gastroenteritis, meningitis y encefalitis. El grupo de mayor riesgo comprende a los recién nacidos, individuos inmunocomprometidos, mujeres embarazadas y adultos de la tercera edad^10,11. La tasa de incidencia de listeriosis es baja comparada con otros patógenos como Salmonella spp. y Shigella spp; sin embargo, es alarmante la elevada tasa de mortalidad, que puede variar entre 20 y 30%¹². En la actualidad, el número de casos de listeriosis ha aumentado considerablemente y se estima que la frecuencia en los países desarrollados se encuentra en un rango de 2 a 15 casos por millón de habitantes¹⁰.

Desde finales de 1980, los estudios realizado en biología celular combinado con biología molecular y genómica han elucidado la elegante estrategia utilizada por L. monocytogenes para ingresar al hospedero, multiplicarse y propagarse entre célula-célula. Estos estudios identificaron y caracterizaron los factores de virulencia involucrados en el ciclo intracelular además, de los mecanismos de regulación que modulan la virulencia. Por otra parte, se estableció a L. monocytogenes como un organismo modelo para el estudio de la interacción patógeno-hospedero. Esta revisión presenta una visión actualizada de los principales factores de virulencia de L. monocytogenes y los mecanismos involucrados en su regulación.

Patogénesis

La patogenia de la infección por L. monocytogenes aún es poco comprendida y los datos disponibles han derivado de observaciones hechas en animales de experimentación. Los alimentos son la principal ruta de adquisición del patógeno y, por lo tanto, el tracto gastrointestinal es el primer sitio de entrada de L. monocytogenes al hospedero¹. Esta bacteria es capaz de atravesar las tres barreras fisiológicas presentes en los seres humanos: intestinal, hematoencefálica y placentaria. Al cruzar la barrera intestinal, la bacteria se absorbe desde el lumen intestinal, atravesando las células epiteliales y si el sistema inmune no es capaz de controlar eficientemente la infección, la bacteria seguirá multiplicándose y la infección puede diseminarse al torrente sanguíneo y a los ganglios linfáticos. Tras el ingreso al torrente sanguíneo, la mayoría de las bacterias alcanza el hígado y el bazo, donde puede replicarse en el interior de macrófagos o células epiteliales. Si la replicación de L. monocytogenes no es controlada por una efectiva respuesta inmune innata, la bacteria escapa y continúa replicándose. La sobrevivencia del hospedero depende del desarrollo de una efectiva respuesta inmune adaptativa; de otro modo, la bacteria puede ingresar nuevamente al torrente sanguíneo y alcancar el cerebro o la placenta, causando infecciones sistémicas potencialemente letales¹³. La capacidad de L. monocytogenes para replicarse en el citosol de las células infectadas y diseminarse de célula-célula le permite evitar la respuesta inmune humoral¹⁴.

Ciclo intracelular de L. monocytogenes

El proceso de infección comprende varias etapas: adhesión e invasión de la célula hospedera, escape de la vacuola, multiplicación intracelular y proliferación extracelular^15,16 (Figura 1). En cada una de estas etapas están involucrados múltiples factores de virulencia¹ (Tabla 1).

 

Figura 1. Esquema del ciclo intracelular de Listeria monocytogenes. 1. Entrada en la célula hospedera; 2. Sobrevivencia dentro de la vacuola fagocítica; 3. Disrupción de las membranas del fagosoma y escape al citosol; 4. Replicación en el citosol; 5. Movimiento a través de la polimerización de actina; 6. Propagación célula-célula; 7. Sobrevivencia en fagosomas secundarios; 8. Escape del fagosoma secundario y reinicio del ciclo. (Esquema adaptado y modificado de las referencias 47, 75, 76).

 

Tabla 1. Principales factores de virulencia de L. monocytogenesinvolucrados en el ciclo intracelular

 

Adhesión celular

La adhesión a las células del hospedero es una etapa fundamental en la patogenicidad bacteriana¹⁷. Para L. monocytogenes se ha descrito la participación de varios factores que permiten establecer un contacto íntimo con las células del hospedero, destacándose las proteínas Lap, Ami, FbpA, LapB e InlJ. Lap es una adhesina, inicialmente denominada proteína 104, que está presente en todas las especies de Listeria spp. con excepción de L. grayi¹³; Ami, amidasa autocatalítica¹³; FbpA, proteína de superficie homóloga a las proteínas atípicas de unión a fibronectina. Además, FbpA parece ejercer un rol de chaperona para los factores de virulencia InlB y LLO^13,18, estabiliza o permite la secreción correcta de ellos¹⁸. LapB, proteína necesaria para la adhesión y el ingreso en líneas celulares de mamíferos y para la virulencia en roedores infectados vía intravenosa u oral. Además, se ha informado que esta proteína está ausente en especies no patógenas de Listeria^13,19. Finalmente, la proteína InlJ, proteína perteneciente a la familia de las internalinas (Inl), cuya expresión es inducida in vivo y actúa como una adhesina que se encuentra unida covalentemente al peptidoglicano; esta unión se realiza mediante la enzima sortasa A (SrtA)²⁰. La importancia de esta proteína en la virulencia queda demostrada al realizar estudios con cepas de L. monocytogenes que presentan mutaciones en el gen srtA²¹ como así también, al emplear cepas donde la proteína InlJ está ausente, debido a una deleción del gen inJ¹³; en ambos casos se produce una reducción significativa en la virulencia.

Por otra parte, se ha identificado la participación de proteínas adicionales en el proceso de adhesión como la proteína DtlA, la cual añade residuos de D-alanina a los ácidos lipoteicoicos, proceso que contribuye a la adhesión y virulencia de L. monocytogenes¹³; la proteína CtaP, la cual está asociada con el transporte de cisteína, resistencia a ácidos, integridad de la membrana celular y con la adhesión al hospedador¹³ y las proteínas ActA, InlF y RecA, que participan en el proceso de adhesión; sin embargo, se ha determinado su rol en la adhesión bajo condiciones específicas en el hospedero¹³.

Invasión celular

Las dos principales proteínas de invasión de L. monocytogenes son InlA y InlB, codificadas por los genes inlA e inlB, respectivamente. Estas proteínas son miembros de una superfamilia de proteínas denominadas internalinas (Inl), reconocidas por poseer en su extremo N-terminal una región LRR (leucine rich repeat) y en su extremo C-terminal una secuencia conservada LPXTG (Leu-Pro-X-Thr-Gly), en el genoma de L. monocytogenes se han detectado 41 genes que codifican para proteínas de este tipo²².

Actualmente, las Inl se clasifican en tres grupos, de acuerdo a la estructura de superficie de L. monocytogenes con la que se relaciona su extremo C-terminal. Así, InlA se une en forma covalente al peptidoglicano; en cambio InlB se une mediante interacción electrostática a moléculas de ácidos lipoteicoicos²³ permitiendo la adherencia de las bacterias a la célula eucariota y por ende la invasión. Estas proteínas se unen a proteínas de la superficie de la célula hospedera, InlA se une al receptor E-cadherina, glicoproteína transmembrana localizada en la superficie basolateral de varios tipos de células, incluyendo el enterocito. Por lo tanto, la interacción InlA/E-cadherina es crítica para la invasión del epitelio intestinal y activa una compleja vía de señalización que conduce a la reorganización del citoesqueleto. Por su parte, para InlB se han reconocido varias moléculas como potenciales receptores; entre ellas destaca el receptor para el factor de crecimiento de hepatocito (receptor Met)²⁴. Met es un receptor transmembrana con un dominio intracelular con acción tirosina kinasa y, por lo tanto, la interacción InlB/ Met produce una fosforilación transitoria de Met¹³. El receptor Met es expresado ubicuamente, permitiendo que L. monocytogenes se internalice en una gran variedad de células. Por lo tanto, este microorganismo puede invadir diferentes hospederos eucariotas, pero la eficiencia de la infección depende de la especie. Se ha determinado que la interacción InlA/E-cadherina e InlE/Met son especie-específica; así un residuo de prolina en posición 16 en E-cadherina de humanos y cobayo es esencial para la interacción con InlA; en cambio, un residuo de ácido glutámico en la misma posición como es el caso de E-cadherina de ratón o rata, impide este reconocimiento²⁵. Por otra parte, InlB interactúa con el receptor Met de humano y ratón pero no reconoce el de cobayo o conejo²⁶. Mientras InlB presenta un tropismo más amplio, InlA le confiere a L. monocytogenes un tropismo más reducido, ya que E-cadherina sólo es expresada por un número limitado de células de origen epitelial²⁷.

Para que L. monocytogenes atraviese la barrera intestinal, es crucial la participación de InlA; en cambio, estudios más recientes han determinado que tanto InlA y InlB son fundamentales para la invasión placentaria. Pocos estudios han abordado los mecanismos empleados en el cruce de la barrera hemato-encefálica, la cual conduce a meningoencefalitis. La única proteína posiblemente involucrada, lo cual ha sido sugerido por los estudios in vitro, es InlB. Aunque se ha propuesto que E-cadherina también podría estar participando, considerando su expresión en las células que constituyen el epitelo de la barrera hemato-encefálica^28,29.

Además de las Inl, anteriormente mencionadas, se han descrito alrededor de 27 Inl en L. monocytogenes entre las que se puede mencionar InlC, InlC2, InlD y otras proteínas con actividad de autolisina como Auto, Ami y p60²⁷. Junto a estas proteínas accesorias se tiene otra proteína LPXTG, la proteína Vip, que se encuentra unida al peptidoglicano y que también es necesaria para el ingreso de Listeria a varías líneas celulares epiteliales^13,19. Sin embargo, InlA y InlB, siguen siendo los principales factores de virulencia implicados en la invasión celular, en especial en fagocitos no-profesionales³⁰. En este proceso de internalización son las modificaciones post-traduccionales que sufren los receptores de las InlA y InlB, E-cadherina y Met, las responsables de la activación de la cascada de señales que conlleva a la polimerización de los filamentos de actina, proceso fundamental para la internalización e invasión de L. monocytogenes. Además Veiga y cols. (2007)³¹, informan de la participación de clatrina en este proceso, hallazgo bastante sorprendente, ya que esta mólecula se relacionaba sólo con la internalización de macromoléculas. Actualmente, se conoce que clatrina actúa como una plataforma para el reclutamiento de proteínas como Dab2, Hip 1R y miosina VI, todas involucradas en el rearreglo de los filamentos de actina³². Sin embargo, los eventos moleculares íntimos que se producen entre la endocitosis mediada por clatrina y los rearreglos de actina durante la invasión de L. monocytoges no se conocen aún³³.

Sobrevivencia, multiplicación y extensión célula-célula

Una vez en el interior de la célula, la vacuola fagocítica es rápidamente lisada por la toxina listeriolisina O (LLO) y dos fosfolipasas C (PLC): fosfatidilinositol-PLC (PI-PLC) y fosfatidilcolina-PLC (PC-PLC), codificadas por plcA y plcB, respectivamente. LLO es una toxina dependiente de colesterol y capaz de formar poros en la membrana de los fagosomas, permitiendo que L. monocytoges escape de las vacuolas primarias y secundarias³⁴. Esta acción citolítica de LLO se ve aumentada por la acción de PI-PLC, que reconoce como sustrato a fosfatidilinositol y por PC-PLC, que es una lecitinasa, que tiene actividad enzimática sobre fosfatidilcolina, fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina¹³. PC-PLC es expresada como protoenzima y se requiere la metaloproteasa dependiente de zinc Mpl, para su maduración. Una vez libre en el citosol, L. monocytogenes expresa los genes para adquirir los nutrientes necesarios para la multiplicación intracelular. Se ha determinado que el gen hpt, que codifica para el transportador de hexosa 6-fosfato, es importante para el óptimo crecimiento intracelular de Listeria. Luego de la replicación, se induce la polimerización de filamentos de actina en un polo de la bacteria; este proceso es dirigido por la proteína ActA. La formación de una estructura semejante a una cola de cometa facilita el movimiento intracelular, permitiendo la invasión a células vecinas, mediante un proceso que implica la formación de una protrusión que contiene a la bacteria rodeada por una vacuola de doble membrana, la cual es lisada por PC-PLC, PI- PLC y LLO^15,35,36.

Se han identificado otros factores de virulencia involucrados en la colonización del hospedero; sin embargo, éstos no serían específicos de L. monocytogenes, ya que también han sido detectados en otras especies de Listeria. Estos factores son conocidos como factores de virulencia accesorios y entre éstos se encuentran la proteína p60 (producto del gen iap), secretada por todas las cepas de Listeria, que parece estar involucrada en los últimos pasos de la división celular³⁷; los mediadores en respuesta al estrés (ClpC, ClpE, ClpP), involucrados en el escape desde el fagosoma y en la multiplicación intracelular³⁸. También se ha asignado un rol importante a la presencia de las enzimas superóxido dismutasa y catalasa, las que actúan en conjunto para detoxificar radicales libres y, por último, los sistemas de captación de hierro, que permiten a la bacteria capturar el hierro de los tejidos del hospedero³⁸.

En estos últimos años, se ha relacionado la capacidad de sobrevivir y multiplicarse dentro de la célula hospedera con algunos mecanismos como evasión de los mecanismos de defensa de la célula hospedera, ya sea en el citosol o en la vacuola fagocítica, característica que está otorgada por la presencia de enzimas que modifican el peptidoglicano como PgdA, que deacetila los residuos de N-acetilglucosamina produciendo resistencia a la enzima lisosima^28,39; también se informa de la capacidad de la proteína ActA para evitar la autofagia, proceso en el cual L. monocytogenes es degradada en los lisosomas^40,41. Finalmente, hay evidencias experimentales que señalan que L. monocytogenes es capaz de inducir modificaciones en las histonas y remodelar la cromatina; por lo tanto, tendría una participación en lo que se conoce como regulación epigenética^{28,42,43,44,45}.

Organización genética

L. monocytogenes se caracteriza por tener una alta heterogeneidad en la virulencia, lo cual se ha identificado tanto en estudios in vivo como in vitro. Gran parte de las cepas son naturalmente virulentas y capaces de producir alta mortalidad; en cambio existen otras que son avirulentas e incapaces de establecer una infección dentro del hospedero⁴⁶. Las diferencias en la virulencia entre las cepas de L. monocytogenes pueden deberse a polimorfismos en las secuencias nucleotídicas de estos genes, debido a mutaciones puntuales y/o la presencia o ausencia de algún gen de virulencia^7,16,36

Se ha determinado que los factores de virulencia se encuentran codificados a nivel cromosomal^1,47. Sin embargo, den Bakker y cols. (2012)⁴⁸ presentaron el primer informe de un potencial plásmido de virulencia en L. monocytogenes, en el cual se identificaron genes que codifican proteínas de la familia de Inl. Sin embargo, al eliminar el plásmido no se detectaron diferencias, entre la eficiencia en la invasión de células epiteliales, entre la cepa curada en comparación con la cepa silvestre.

Los genes de virulencia prfA, plcA, hly, mpl, actA y plcB están codificados en el cromosoma, en una isla de patogenicidad de 9 Kb, denominada LIPI-1, presente en L. monocytogenes y L. ivanovii. Los genes inlA y inlB no se encuentran codificados en LIPI-1, sino que se han asociado a islotes genéticos, los cuales también han sido identificados en otras especies de Listeria^li1. LIPI-1 se encuentra insertada, establemente, en el cromosoma, en la misma posición en todas las especies. Tiene una composición de ALDN similar a la del genoma de Listeria, no se han detectado elementos genéticos que favorezcan su movilidad (integrasas, transposasas, secuencias de inserción), como así también , factores de integración como repeticiones directas y ARN de transferencia (ARNt)⁴⁹. Por lo tanto, esta isla es conservada en L. monocytogenes puesto que es indispensable para la colonización del hospedero^47,49.

En un sub-grupo de cepas de L. monocytogenes pertenecientes al linaje I, se ha identificado la producción de un factor de virulencia adicional conocido como listeriolisina S (LLS), el cual es responsable del aumento de la virulencia en L. monocytogenes. LLS se encuentra codificada en una nueva isla de patogenicidad, designada como LIPI-3⁵⁰ y corresponde a una citolisina, que pertenece a la familia de la estreptolisina S (SLS); se ha determinado que su presencia está asociada con el aumento de la virulencia de las cepas, lo cual contribuye a la citotoxicidad y a la activación inflamatoria⁵¹. Además, se ha demostrado que la LLS juega un rol en la sobrevivencia de L. monocytogenes y contribuye a su virulencia in vivo. LIPI-3 sólo ha sido identificada en algunas cepas del linaje I y muchas de éstas han estado implicadas en brotes de listeriosis; por lo tanto, es necesario distinguir aquellas cepas que son productoras de LLS⁵⁰.

Regulación de la virulencia

Listeria monocytogenes realiza una coordinada regulación en la expresión de los genes de virulencia cuando invade a un hospedero y cambia desde saprófito a parásito intracelular⁷. Los genes de virulencia plcA, hly, mpl, actA, plcB, inlA, inlB, inlC y hpt son regulados, principalmente, por la proteína reguladora PrfA, la cual está involucrada directamente en la expresión de los genes, pudiendo actuar como un activador o represor de los genes^52,53. En la actualidad, se reconoce numerosos reguladores que afectan la virulencia de L. monocytogenes^52,53. Así, se ha determinado que el regulador del estrés, el factor σ^Β, juega un importante rol, tanto en la sobrevivencia de L. monocytogenes al ser expuesta a un estrés ambiental, como en la regulación de la transcripción de genes de virulencia, tales como: prfA, bsh, inlA y inlB⁵⁴. Otro importante regulador es VirR, sistema que pertenece a uno de los 17 sistemas de dos componentes presentes en L. monocytogenes. VirR/VirS controla positivamente la transcripción de 17 genes⁵⁴. VirR es responsable de la activación del gen dltA involucrado en la D-alanilación de los ácidos lipoteicoicos y en la virulencia de Listeria. Además, está involucrado en la activación del gen mprF, el cual está implicado en la modificación de fosfolípidos y proporciona resistencia a péptidos antimicrobianos catiónicos⁵⁶.

Otro mecanismo regulatorio es AgrA, el cual pertenece a un sistema de auto-inducción organizado en el operón agrBDCA. AgrC/AgrA es un sistema de dos componentes que responde a la presencia de péptidos auto-inductores y la inactivación del sistema Agr afecta la capacidad de L. monocytogenes para formar biopelícula a 25 °C⁵⁷.

Sin duda, la movilidad es un mecanismo importante por el cual la bacteria se adapta y sobrevive en diferentes ambientes; así, Listeria regula la síntesis de flagelo mediante tres reguladores denominados MogR, DegU y GmaR¹³. A temperatura fisiológica (37 °C) se reprime la transcripción de los genes involucrados en la movilidad a través del represor transcripcional, MogR³⁷. En cambio, a bajas temperaturas (< 30 °C), DegU activa la expresión del anti-represor GmaR, que específicamente inhibe la represión de MogR^59,60.

Otro sistema importante de regulación descrito en L. monocytogenes está basado en la regulación por ARN (ARN pequeños y ARN sin sentido). Se ha descrito que este sistema interactúa con proteínas accesorias como Hfq, que es una proteína de unión al ARN que juega un rol en la fisiología bacteriana y es requerida para la actividad de muchos ARN regulatorios en procariotas. En Listeria, Hfq regula múltiples procesos como tolerancia al estrés y virulencia y se ha determinado que su expresión es regulada por el factor Sigma^61,62,63.

Aunque hay numerosos reguladores involucrados en la virulencia de L. monocytogenes, el mecanismo de control mediado por PrfA es el más importante, ya que es requerido en la regulación de los factores de virulencia involucrados durante el cambio de saprófito a parásito intracelular⁵³. El gen prfA está ausente en L. innocua y L. welshimeri; sin embargo, está presente, pero silenciado, en L. seelegeri, y la actividad de la proteína no es conocida.

PrfA

El gen prfA esta presente en todas las cepas de L. monocytogenes⁷ y codifica una proteína de 27 kD (PrfA), la cual se une específicamente a un sitio del ADN, regulando la expresión de los genes de virulencia^53,63. Se ha descrito que PrfA puede regular directamente 10 genes de virulencia, además de 145 genes no relacionados con virulencia. Esta proteína está estructuralmente relacionada con la proteína Crp (proteína receptora de AMPc) de enterobacterias, también conocida como Cap (proteína activadora de catabolitos)^63,64. PrfA es un homodímero simétrico con dos promotores organizados en dos dominios. El dominio N-terminal forma una estructura de barril que sugiere que PrfA está sujeta a alosterismo mediado por ligando; sin embargo, la identidad de este ligando aún no se conoce. El dominio C-terminal tiene forma de hélice y es la zona donde se establece contacto con el ADN. Este dímero activa la transcripción al unirse a una secuencia palindrómica de 14 pb, conocida como box-PrfA, que está localizada en la posición -41,5 de los promotores⁶³. Mutantes de L. monocytogenes que carecen de la proteína PrfA funcional, debido a una deleción o mutación, no son capaces de replicarse en el citosol de la célula hospedera o extenderse a las células adyacentes, siendo su virulencia 100.000 veces menor que en las cepas salvajes, lo cual ha sido demostrado en modelos de infección animal⁶³. La expresión y producción de esta proteína reguladora está controlada a múltiples niveles, incluyendo mecanismos de regulación transcripcional, post-transcripcional y post-traduccional, los cuales serán detallados a continuación^53,63,66,67.

Nivel transcripcional

Participan tres promotores, prfAP1 y prfAP2_, que conducen a la expresión del gen prfA, y generan niveles basales de la proteína PrfA requeridos para la activación de los genes plcA y hly. El tercer promotor, plcA, conduce la producción de un transcrito bicistrónico plcA-prfA y un transcrito monocistrónico plcA. Este promotor está sobrerregulado por PrfA y la expresión, tanto de prfAP1 como de prfAP2, está negativamente regulada por PrfA. Se piensa que esta regulación, posiblemente, juega un rol en promover la adaptación fuera del hospedero. El transcrito plcA-prfA activa la producción adicional de PrfA dentro del citosol, lo que es requerido para estimular la extensión célula-célula (Figura 2)^53,63,66,68.

 

Figura 2. Esquema de los tres mecanismos de regulación involucrados en la expresión del gen prfA. A. Nivel transcripcional de prfA. Los tres promotores que contribuyen a la expresión de prfA son indicados (PplcA, prfAP1, prfAP2). Los promotores prfAP1 y prfAP2 están localizadas aguas arriba de la secuencia codificante de prfA. El promotor plcA contribuye a la expresión de prfA por la generación de un transcrito plcA-prfA. B. Control post-transcripcional de la síntesis de PrfA. El transcrito dirigido por el promotor prfAP1 contiene una secuencia que provoca la formación de horquilla a una temperatura inferior a 30 °C, lo cual enmascara la región de unión al ribosoma (RBS) e inhibe la traducción del ARNm. Esta horquilla es inestable a temperaturas mayores a 37 °C, permitiendo la unión del ribosoma y producción de PrfA. C. Control post-traduccional de la actividad de PrfA. PrfA se encuentra en un estado inactivo o de baja actividad hasta que se une a un cofactor (indicado por asterisco). Los dímeros de PrfA se unen a su secuencia blanco y activan la expresión de los genes de virulencia de L. monocytogenes. PrfA activado también regula positivamente la expresión de prfA a través del promotor plcAP. (Esquema adaptado y modificado de las referencias 66,67).

 

Nivel post-trancripcional

Este mecanismo de regulación está basado en la termorregulación, por lo tanto, la temperatura está influyendo en la expresión de los genes de virulencia cuando el microorganismo se encuentra como parásito intracelular^53,63,66. Johansson y cols. (2002)⁶⁹ demostraron que la región 5' no traducida (UTR) de los ARN_m dirigidos por pfAP1 forma una horquilla a una temperatura inferior a 30 °C, lo cual enmascara la región de unión al ribosoma e inhibe la traducción del ARN_m de prfA. Esta horquilla es inestable a temperaturas mayores a 37 °C, por lo tanto, permite la unión del ARN_m de prfA al ribosoma y, en consecuencia, la síntesis de PrfA en la célula (Figura 2).

Los promotores plcA-prfAP2 no parecen estar sujetos a esta termorregulación y, por consiguiente, los transcritos de estos promotores probablemente contribuyen a la expresión de genes de virulencia dependientes de PrfA a temperaturas bajo 30 °C, como en células de insectos y larvas de moscas. Los diferentes experimentos indican que mientras la temperatura puede ser una importante señal en mediar la expresión de genes de virulencia, L. monocytogenes emplea otras señales adicionales que promueven la expresión de los genes de virulencia al interior de la célula hospedera^53,63,66.

Nivel post-traduccional

PrfA es miembro de la familia de proteínas Crp/FnR, las cuales se caracterizan por ser reguladores transcripcionales⁷⁰. Para una completa actividad de estos reguladores se requiere la unión a pequeñas moléculas cofactoras^70,71. Evidencia experimental señala que la expresión de genes dependientes de PrfA, se reduce en presencia de fuentes de carbono fácilmente metabolizables como glucosa y celobiosa; sin embargo, la cantidad de PrfA presente en la célula no varía. Estas fuentes de carbono se encuentran normalmente en el ambiente; por lo tanto, L. monocytogenes al utilizarlas reprime la expresión de los genes de virulencia, de tal forma que estos compuestos estarían actuando como señales externas que le indicarían que se encuentra en el medio extracelular. Además, se ha identificado que L. monocytogenes puede utilizar glucosa 1-fosfato, glucosa 6-fosfato, fructuosa 1-fosfato y manosa 6-fosfato como fuentes de carbono y que el metabolismo de estos azúcares no reprime la expresión de los genes de virulencia; por lo tanto, las fuentes de carbono presentes en el medio mediarían la transición de L. monocytogenes desde el medio ambiente, donde vive como saprófito, a parásito intracelular en una célula hospedera^{53,63,66,68,72}.

Joseph y cols. (2008)⁷³ y Stoll y cols. (2008)⁷⁴ sugirieron un modelo que intenta explicar la relación entre las fuentes de carbono y la regulación de la virulencia. El ingreso de estas fuentes de carbono se realizaría por vías diferentes lo cual podría generar la inhibición o no de la proteína PrfA. En presencia de azúcares no transportables por el sistema de transporte fosfoenolpiruvato (PTS) (glucosa 1-fosfato, glucosa 6-fosfato, fructuosa 1-fosfato y manosa 6-fosfato), el transporte ocurre vía Hpt, por lo tanto, un componente del PTS permanece fosforilado siendo incapaz de secuestrar PrfA, la cual es liberada y puede dirigir la activación de los promotores. Adicionalmente, la PrfA liberada puede requerir el estímulo de una señal cofactora-activadora para la inducción completa de los promotores dependientes de PrfA⁷ (Figura 2). Este compuesto aún no se ha identificado completamente; no obstante, experimentos avalan su existencia, ya que se ha visto que las señales del medio juegan un rol crítico en la regulación de PrfA⁷². En cultivos de L. monocytogenes, a los cuales se les adicionó carbón activado se ha demostrado que este compuesto absorbe algún compuesto presente en el medio (carbohidratos fermentables), pero no en los tejidos infectados⁶². Por lo tanto, se produce una absorción de un auto-represor difusible liberado por L. monocytogenes durante la fase exponencial; este co-factor es de bajo peso molecular y estaría involucrado en el mecanismo de quorum sensing en L. monocytogenes⁶³.

Conclusiones

PrfAjuega un importante rol en mediar la transición de L. monocytogenes desde el medio ambiente, donde vive como saprófito, a un estilo de vida como parásito intracelular. Esta transición es posible debido a la regulación de la expresión de una serie de genes involucrados en la virulencia de este patógeno. Se ha determinado que PrfA responde a señales ambientales y endógenas y permite cambiar la bacteria de un estado avirulento a un estado virulento dentro del hospedero. Diversos estudios han identificado una regulación a nivel transcripcional (expresión del promotor), traduccional (ARN termosensor) y post-traduccional (activación de PrfA). La interrelación de estos mecanismos permite una regulación precisa de los genes de virulencia necesarios para que L. monocytogenes se desarrolle al interior de la célula y, además, previene que la bacteria gaste energía en la producción de factores de virulencia que no son necesarios cuando este microorganismo se encuentra fuera del hospedero. Junto a este mecanismo, también, se han identificado otros sistemas que participan en la regulación de la virulencia en Listeria. Estos mecanismos se encuentran conectados con PrfA; sin embargo, se destaca el rol clave de PrfA como regulador de la transcripción en L. monocytogenes. Aún no se conoce completamente el impacto en la virulencia de estos mecanismos adicionales, ya que también están presentes en especies no patógenas de Listeria y sus efectos son comparativamente menores. Por lo tanto, es importante distinguir si los mecanismos tienen un rol preciso en la virulencia o contribuyen inespecíficamente al ser parte del sistema bacteriano.

La patogenicidad en L. monocytogenes aún no se comprende completamente, sólo se ha identificado la participación de complejos mecanismos de regulación de la virulencia y que PrfA es esencial para la patogenicidad de este microorganismo. Es necesario conocer y comprender los mecanismos de patogenicidad, como también sus mecanismos regulatorios, ya que permitirán entender aún más la fisiología de este microorganismo y, de esta forma, diseñar tratamientos anti-L. monocytogenes más eficaces y a conocer el complejo proceso de la patogenicidad microbiana.

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Recibido: 14 de diciembre de 2012
Aceptado: 4 de junio de 2013

Correspondencia a: Helia Bello Toledo hbello@udec.cl