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再生障碍性贫血（AA）是一组通过不同机制引起的骨髓造血干/祖细胞生成减少及功能异常的骨髓造血功能衰竭综合征。活化的T淋巴细胞及其分泌的淋巴因子导致的造血干细胞过度凋亡在AA发病中起主导作用[1]，目前AA的一线治疗为免疫抑制治疗（IST）及造血干细胞移植（HSCT）。环磷酰胺（CTX）曾是AA的二线疗法，因其骨髓抑制严重而逐渐被淘汰[2]。最新研究显示CTX等细胞毒药物在杀伤肿瘤细胞同时，会通过激活WNT信号通路促进肿瘤干细胞的增殖[3]，提示CTX治疗AA的机制与抗胸腺细胞球蛋白（ATG）可能不完全相同。
近来的研究证实AA骨髓微环境的改变，如间充质干细胞（MSC）对造血干/祖细胞的异常调节可能是AA发病的另一个重要机制[4]。我们前期的研究证实了重型AA（SAA）小鼠模型中骨髓MSC（BM-MSC）过度衰老，且mTOR通路激活可能是导致其衰老发生的机制[5]。既然AA小鼠BM-MSC由于衰老而影响了骨髓微环境对正常造血的支持及免疫耐受，是否可以通过减少CTX的剂量以减轻其对造血细胞的抑制，同时又通过加入正常MSC来进一步诱导免疫耐受并同时促进造血恢复？IFN-γ是干细胞和前体细胞增殖和存活的负性调节剂，可以抑制造血细胞系的形成，高表达的IFN-γ能够促进造血细胞凋亡，抑制骨髓造血功能[6,7,8]。既往实验中，我们曾用小鼠造血干/祖细胞——32D细胞，观察到IFN-γ可以通过干扰PI3K/Akt信号通路抑制干/祖细胞的增殖[9]。本实验中我们继续以32D细胞作为靶细胞，在32D细胞中加入IFN-γ，以模拟活化T淋巴细胞分泌的淋巴因子对造血干/祖细胞的抑制，再分别观察CTX、CTX联合MSC对IFN-γ处理后的32D细胞增殖及凋亡的影响并探讨其可能的机制。
CTX为美国Selleck公司产品；RPMI 1640培养液、DMEM-F12培养液、2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA和胎牛血清为美国Gibco公司产品；CCK-8试剂盒购于日本同仁化学研究所；Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡试剂盒为江苏凯基生物有限公司产品；小鼠MSC表型鉴定试剂盒购于美国Bio-Techne公司；IFN-γ和IL-3为美国PeproTech公司产品；non-p-β-catenin、cleaved-caspase3、CD44、β-actin、c-myc等兔抗鼠单抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗为美国CST公司产品；PVDF膜为美国Millipore公司产品；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL发光液和SDS上样缓冲液为中国新赛美公司产品；Western blot全套仪器为美国Bio-Rad公司产品；FACS Calibur流式细胞仪为美国BD公司产品；全自动酶标仪为美国BioTek公司产品。
32D细胞由美国俄亥俄州Toledo大学董凡教授提供，为未分化原始细胞，生长和增殖依赖IL-3的存在，培养于含10%胎牛血清、1%青链霉素溶液和1%IL-3的RPMI 1640培养液中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱，2~3 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。
雌性BABL/c小鼠由南通大学医学院实验动物中心提供，20只，清洁级，8~12周龄，体重18~22 g。断颈处死小鼠，75%酒精浸泡5 min后，无菌条件下取胫骨与股骨，含10%胎牛血清和1%青链霉素溶液的DMEM-F12完全培养基冲洗骨髓腔3~4次，充分混匀细胞悬液，接种于25 cm2培养瓶中，37 ℃、5%CO2饱和湿度培养，每3 d换液1次。当细胞生长融合达70%~80%时，用2.5 g/L胰蛋白酶-EDTA消化细胞，显微镜下控制消化时间，按1∶3传代，取第3~4代细胞用于实验。
取第3代MSC，调整细胞密度为2×105/ml，接种于含10%胎牛血清的DMEM-F12完全培养基的6孔板中，待MSC完全贴壁后去上清，接种细胞密度为106/ml的32D细胞于MSC上层，两者用RPMI 1640完全培养基共培养。未加IFN-γ组：分别设正常对照组、CTX组和CTX+MSC组；加IFN-γ组：接种IFN-γ处理24 h的32D细胞于MSC上层，分别设IFN-γ组、IFN-γ+CTX组、IFN-γ+MSC组和IFN-γ+CTX+MSC组。实验重复3次，设3~4个复孔。
取32D细胞，调整细胞密度为106/ml，96孔板中每孔加入90 µl的细胞悬液，在培养箱中预培养细胞，向培养板中加入10 µl不同浓度的CTX培养24 h，每孔加入10 μl CCK-8，培养4 h后用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值。
收集处理后细胞，加入5 µl PI和5 µl Annexin Ⅴ-FITC，室温避光孵育20 min后上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
收集处理后细胞，加入细胞裂解液混匀后冰上裂解60 min，12 000 r/min（离心半径16 cm），4 ℃离心5 min后收集上清，检测蛋白浓度后，进行SDS-PAGE后转膜至PVDF膜上，50 g/L脱脂牛奶室温封闭2 h，4 ℃孵育一抗过夜，次日TBST洗涤3次，每次10 min，室温孵育相应二抗2 h，TBST洗涤3次（每次10 min）后进行X光胶片显影，扫描后与内参进行对比分析计算各蛋白的表达量。
采用Graphpad Prism 6.0软件进行数据分析及绘图，本实验数据采用
±s进行描述，两组间均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
使用IFN-γ在体外模拟活化T淋巴细胞分泌的淋巴因子对造血干/祖细胞的抑制作用，结果显示IFN-γ浓度在102~103U/ml时抑制32D细胞的增殖（表1），当IFN-γ浓度为103 U/ml时，和未加IFN-γ组相比，细胞增殖率差异有统计学意义。流式细胞仪检测不同浓度IFN-γ对32D细胞凋亡的影响，结果显示IFN-γ浓度在102~103 U/ml时，32D细胞凋亡率增加（表1）。本研究中，我们选择103U/ml IFN-γ用于后续实验。
不同浓度IFN-γ干预32D细胞24 h的增殖及凋亡情况（
±s）
不同浓度IFN-γ干预32D细胞24 h的增殖及凋亡情况（±s）
| IFN-γ浓度（U/ml） | 细胞增殖率 | 细胞凋亡率（%） |
|---|---|---|
| 0 | 1.000±0.000 | 2.230±0.141 |
| 102 | 0.986±0.037 | 2.503±0.276 |
| 103 | 0.869±0.033 a | 4.347±1.321 a |
| 104 | 1.046±0.061 | 2.827±0.550 |
| 105 | 0.475±0.034 a | 4.620±1.246 a |
注：与未加IFN-γ组比较，aP<0.05。实验重复3次，设3~4个复孔
CTX对32D细胞增殖的影响见表2，CTX呈剂量依赖性抑制32D细胞的增殖。当103 U/ml IFN-γ作用32D细胞24 h后，使用不同浓度的CTX干预IFN-γ诱导后的32D细胞，CTX≤200 µmol/L时，对IFN-γ诱导的32D细胞无抑制作用（非细胞毒性）（表3），综合考虑，我们选择非细胞毒作用的200 µmol/L CTX用于后续实验。
不同浓度环磷酰胺（CTX）作用32D细胞24 h和48 h的增殖情况（
±s）
不同浓度环磷酰胺（CTX）作用32D细胞24 h和48 h的增殖情况（±s）
| CTX浓度（µmol/L） | 细胞增殖率 | |
|---|---|---|
| 24 h | 48 h | |
| 0 | 1.000±0.000 | 1.000±0.000 |
| 10 | 1.028±0.063 | 1.032±0.052 |
| 20 | 1.016±0.038 | 1.031±0.038 |
| 40 | 0.981±0.112 | 0.974±0.151 |
| 80 | 0.965±0.046 | 1.077±0.086 |
| 100 | 0.946±0.046 | 0.935±0.170 |
| 200 | 0.990±0.032 | 0.959±0.032 |
| 400 | 0.994±0.137 | 0.980±0.121 |
| 800 | 0.884±0.120 | 0.920±0.253 |
| 1 000 | 0.765±0.039 | 0.760±0.345 |
| 2 000 | 0.674±0.109 a | 0.663±0.274 a |
| 4 000 | 0.470±0.101 a | 0.369±0.085 a |
注：与0 µmol/L CTX组比较，aP<0.05。实验重复3次，设3个复孔
不同浓度环磷酰胺（CTX）对IFN-γ诱导的32D细胞增殖的影响（
±s）
不同浓度环磷酰胺（CTX）对IFN-γ诱导的32D细胞增殖的影响（±s）
| 组别 | 细胞增殖率 |
|---|---|
| 正常对照 | 1.000±0.000 |
| 103 U/ml IFN-γ | 0.870±0.053 a |
| 103 U/ml IFN-γ+10 µmol/L CTX | 0.927±0.019 |
| 103 U/ml IFN-γ+20 µmol/L CTX | 0.891±0.057 |
| 103 U/ml IFN-γ+40 µmol/L CTX | 0.876±0.070 |
| 103 U/ml IFN-γ+80 µmol/L CTX | 0.913±0.056 |
| 103 U/ml IFN-γ+100 µmol/L CTX | 0.888±0.047 |
| 103 U/ml IFN-γ+200 µmol/L CTX | 0.964±0.057 |
| 103 U/ml IFN-γ+400 µmol/L CTX | 0.839±0.131 |
| 103 U/ml IFN-γ+800 µmol/L CTX | 0.713±0.062 b |
| 103 U/ml IFN-γ+1 000 µmol/L CTX | 0.578±0.080 b |
注：与正常对照组比较，aP<0.05；与103 U/ml IFN-γ组比较，bP<0.05。实验重复3次，设4个复孔
MSC与正常条件下的32D细胞共同培养后，MSC对正常的32D细胞的增殖（1.089±0.224对1.000±0.000，P=0.562）无明显影响。MSC与IFN-γ诱导的32D细胞共培养后，MSC可以促进32D细胞的增殖（1.182±0.102对1.000±0.000，P=0.027）。
Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法检测正常对照组、CTX组、MSC组和CTX+MSC组细胞凋亡率，差异无统计学意义（表4）。103 U/ml IFN-γ培养32D细胞24 h后，流式细胞仪检测IFN-γ组、IFN-γ+CTX组、IFN-γ+MSC组和IFN-γ+CTX+MSC组细胞凋亡率，结果显示200 µmol/L CTX联合MSC可以最大程度减少IFN-γ诱导的32D细胞凋亡，差异有统计学意义（P<0.05）（表4）。WNT/β-catenin通路激活后，β-catenin由胞质入核，p-β-catenin表达增加，non-p-β-catenin表达减少。Western blot检测结果显示，与IFN-γ组相比，IFN-γ+CTX+MSC组non-p-β-catenin表达下调，而与干细胞相关的WNT通路相关基因c-myc、CD44和Id2表达增强，提示32D细胞增殖（图1,图2,图3）。
不同条件下培养32D细胞24 h的凋亡情况（
±s）
不同条件下培养32D细胞24 h的凋亡情况（±s）
| 组别 | 细胞凋亡率（%） |
|---|---|
| 正常对照组 | 0.867±0.115 |
| CTX组 | 0.800±0.267 |
| MSC组 | 0.733±0.321 |
| CTX+MSC组 | 0.667±0.115 |
| IFN-γ组 | 12.530±2.383 |
| IFN-γ+CTX组 | 10.880±3.281 |
| IFN-γ+MSC组 | 9.607±2.245 |
| IFN-γ+CTX+MSC组 | 6.530±2.011a |
注：CTX：200 µmol/L环磷酰胺；MSC：间充质干细胞。实验重复3次，设3个复孔。与IFN-γ组相比，aP<0.05
1：IFN-γ组；2：IFN-γ+CTX组；3：IFN-γ+MSC组；4：IFN-γ+CTX+MSC组
1：IFN-γ组；2：IFN-γ+CTX组；3：IFN-γ+MSC组；4：IFN-γ+CTX+MSC组
1：non-p-β-catenin；2：c-myc；3：CD44；4：Id2
CTX是临床上常用的细胞毒性药物，可杀伤异常活化的T细胞。WNT通路分为经典型和非经典型，经典的WNT/β-catenin信号通路对造血干细胞自我更新和扩增的调控有重要意义，对血液系统恶性肿瘤中肿瘤干细胞的发展也是必备的，激活后能上调原始红细胞生成的关键转录因子和造血细胞表面的特异性标志物[10]。最新研究显示，CTX等细胞毒药物会通过激活WNT信号通路促进肿瘤干细胞的增殖，而且WNT通路在正常造血干细胞的增殖、分化中有重要作用[3]，因而我们研究既能避免较高死亡率又能达到治疗目的的最适CTX浓度，并探究治疗AA的机制。本研究选用小鼠多能造血干/祖细胞，即32D细胞作为实验对象，以IFN-γ模拟活化T淋巴细胞分泌的淋巴因子对造血干/祖细胞的抑制，结果表明一定浓度的IFN-γ可以引起32D细胞凋亡，与我们之前的研究结果一致，本实验观察到CTX浓度小于200 µmol/L时，CTX对IFN-γ诱导的32D细胞无细胞毒性，所以选择非细胞毒性浓度CTX（200 µmol/L）用于实验。
与正常人相比，AA患者MSC形态异常，增生减低、凋亡增加，易分化成脂肪细胞[4]，但是MSC异常的机制目前尚不明确。MSC通过细胞与细胞的直接接触及旁分泌功能调节多种免疫细胞[11]。MSC临床应用的首次成功就是将单倍型相合骨髓来源的MSC输注至环孢素A和类固醇抵抗的Ⅳ级急性GVHD患者体内。本研究中我们发现正常MSC可以减少IFN-γ诱导的细胞凋亡，同时non-p-β-catenin表达量减少，提示WNT通路激活。
曾有研究证明AA小鼠使用大剂量CTX处理后，仅少数小鼠存活，然而输注MSC后，存活小鼠比例增加，其机制尚不明确。我们使用适量CTX联合MSC后，IFN-γ诱导的细胞凋亡减少，non-p-β-catenin蛋白表达减少，推测MSC与CTX协同减少细胞凋亡，可能与WNT通路有关。然而，信号通路是一个复杂的网络系统，复杂性有待我们进一步研究。李清等[12]提出IFN-γ预处理的MSC治疗可大大提高GVHD小鼠的存活率，所以我们不排除MSC促进IFN-γ诱导的32D细胞增殖与IFN-γ的作用有关，骨髓微环境中调控因子之间关系十分复杂，具体机制有待进一步研究证实。
