Наряду с основной физиологической функцией витамина D как регулятора фосфорно-кальциевого обмена и поддержания нормального состояния опорно-двигательного аппарата он обладает большим количеством внескелетных (некальцемических) функций и необходим для функционирования практически всех органов. От обеспеченности этим витамином существенно зависит здоровье, продолжительность и качество жизни. Нехватка этого витамина в разной степени является самой распространенной среди населения по сравнению с частотой обнаружения недостатка других витаминов. По результатам проведенного в 105 городах России в 2014-2018 гг. обследования 40 878 лиц 21-45 лет дефицит витамина D был обнаружен у 35% из них [концентрация 25-гидроксивитамина D (25(OH)D) в крови <20 нг/мл], недостаточность (<30 нг/мл) - у 30,9%. Среди лиц старше 45 лет дефицит имели 37,3%, а недостаток - 30,2% [1]. Среди жителей Омска дефицит витамина D выявлен у 70,9% обследованных [2]. Обобщение результатов оценки обеспеченности этим витамином показало, что дефицит и недостаточная обеспеченность выявляется у 60-92% обследованных взрослых [3].
В Российской Федерации, на территории которой естественная инсоляция солнечным светом спектра УФ-В недостаточна, а ассортимент обогащенных витамином D пищевых продуктов невелик, необходим дополнительный прием этого витамина в адекватных дозах. Однако, рекомендуя прием витамина D иногда в чрезвычайно больших дозах, не учитывают, что в образовании как транспортной, так и гормональных форм витамина D существенная роль принадлежит другим витаминам (С, В2 и др.) [4, 5], необходимым для гидроксилирования холекальциферола. Недостаточная обеспеченность организма этими микронутриентами сопровождается уменьшением образования биологически активных форм витамина D, что снижает эффективность выполнения витамином D своих функций. Показано, что дефицит витамина В2 у крыс приводил к снижению концентрации в сыворотке крови 25(OH)D [5]. Между тем дефицит витаминов группы В среди населения нашей страны занимает 2-е место по встречаемости после недостатка витамина D [6]. Основные биохимические процессы, регулируемые витаминами группы В, помимо гормональной системы витамина D (В2, В3, В6, В9) включают метаболизм углеводов для генерирования энергии (В1, В2, В3, В5, В7, В12), метаболизм аминокислот и синтез белков (В1, В3, В5, В6, В7, В9), синтез нейротрансмиттеров (В1, В3, В5, В6), метаболизм жирных кислот, липидов и синтез холестерина и стероидов (В1, В2, В3, В5), синтез метионина, S-аденозилметионина и нуклеотидных оснований для синтеза ДНК и РНК (В9, B12) [7, 8]. Учитывая, что при недостатке витамина В2 может возникнуть эндогенный, или сопутствующий, последовательно развивающийся дефицит других витаминов группы В, все 8 витаминов этой группы должны поступать с пищей в оптимальных количествах одновременно [8-10].
Цель исследования - создать модель недостаточности у крыс витаминов D и группы В, отражающую реальную обеспеченность этими витаминами населения нашей страны, и сравнить эффективность коррекции дефицита витамина D путем восполнения его содержания в рационе до адекватного уровня без устранения недостатка витаминов группы В и путем восстановления уровня витамина D в сочетании с витаминами группы В.
Для этого была оценена обеспеченность организма крыс витаминами А, Е, D, В1 и В2 и В2 по содержанию в печени, мозге и плазме крови, экскреции с мочой тиамина, рибофлавина и 4-пиридоксиловой кислоты (витамин В6); обеспеченность минеральными веществами по концентрации в плазме крови, в печени и головном мозге и экскреции с мочой, а также определены биохимические показатели плазмы крови и мочи.
Материал и методы
Экспериментальные животные - отъемыши крысы-самцы линии Wistar - были получены из питомника лабораторных животных филиала "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Исследования выполняли в соответствии с приказом Минздравсоцразвития России от 01.04.2016 № 199н "Об утверждении Правил лабораторной практики", требованиями ГОСТ 330442014 "Принципы надлежащей лабораторной практики" и ГОСТ 33216-2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами".
Животных содержали по 2 особи в прозрачных пластмассовых клетках из поликарбоната в контролируемых условиях окружающей среды (температура 20-24 °C, относительная влажность 45-65%, в режиме освещения 12/12 ч) на подстилке из опилок. Животные получали корм ad libitum и имели постоянный доступ к дистиллированной воде.
Во время карантина в течение 5 сут до начала эксперимента все животные (n=33) с исходной массой тела 69,4±0,8 г получали полноценный полусинтетический рацион, содержащий 20% казеина пищевого кислотного по ГОСТ 31689-2012, 63% кукурузного крахмала по ГОСТ 32159-2013, 4,5% масла подсолнечного рафинированного дезодорированного, 4,5% лярда по ГОСТ 25292-2017, 3,5% стандартной солевой смеси, 2% микрокристаллической целлюлозы, 1% сухой витаминной смеси, 0,30% L-цистеина, 0,25% холина битартрата и 0,95% сахарозы [11].
По окончании карантина крысы рандомизированно по массе тела были разделены на 2 группы: животные контрольной группы (группа К) на протяжении всего эксперимента (30 сут) продолжали получать полноценный рацион (n=9), а животные 2-й (-В-D), опытной, группы (n=24) в течение 23 сут получали корм с уменьшенным в 5 раз относительно полноценного рациона содержанием витамина D и всех витаминов группы В в витаминной смеси (см. рисунок).
Схема эксперимента по исследованию полной (все недостающие витамины) и неполной (только витамин D) коррекции сочетанного дефицита витаминов D и группы В
The scheme of the experiment to study the complete (all missing vitamins) and incomplete (only vitamin D) correction of the combined deficiency of vitamins D and B group
Средняя поедаемость корма в контрольной и опытной группах в период создания дефицита не различалась (p=0,529) и составила в среднем 20,9±0,7 г/сут.
Затем животные опытной группы были рандомизированно разделены по массе тела на 2 подгруппы по 12 особей в каждой. В течение последующих 7 сут для коррекции витаминной недостаточности эти животные получали рационы, восполненные до 100% по витамину D на фоне продолжающегося дефицита витаминов группы В (группа "-В+D"), или восполненные совместно витамином D и витаминами группы В (группа "+B+D").
Для сбора мочи за 18 ч до забоя крыс помещали в метаболические клетки, лишая пищи и предоставляя воду без ограничения. По окончании эксперимента предварительно анестезированных эфиром крыс выводили из эксперимента путем декапитации.
Концентрацию витаминов А (ретинол и пальмитат ретинола) и Е (токоферолы) в плазме крови, лиофильно высушенных печени и в целом мозге определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, витамины В1 и В2 в печени, мозге и моче, а также рибофлавин в плазме крови и 4-пиридоксиловую кислоту в моче - флуориметрически [11]. Концентрацию 25(OH)D в плазме крови определяли иммуноферментным методом с использованием набора "25-Hydroxy Vitamin D EIA" (Immunodiagnostic Systems Ltd., Великобритания). Содержание кальция, магния, железа, марганца, цинка и меди в лиофильно высушенных печени и головном мозге определяли атомно-абсорбционным методом на атомно-абсорбционном спектрофотометре "Z 5300" [Hitachi High-Technologies Corporation (HHC), Япония]. Биохимические показатели плазмы крови и мочи определяли на биохимическом анализаторе (Konelab, Финляндия) по стандартным методикам.
Экспериментальные данные обрабатывали с помощью IBM SPSS Statistics 23.0 (IBM, США). Для выявления статистической значимости различий непрерывных величин использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Различия между анализируемыми показателями считали достоверными при уровне значимости р<0,05.
Результаты и обсуждение
Общее состояние всех животных (внешний вид, качество шерстного покрова, поведение) при ежедневном осмотре было удовлетворительным.
К концу этапа создания недостаточности витамина D и витаминов группы В, который продолжался 23 дня, масса тела животных дефицитной группы (-В-D) составила 199±2 г и была статистически значимо (р=0,046) на 5,2% меньше показателя контрольной группы, достигшего 210±5 г, что стало косвенным доказательством развития у них дефицита микронутриентов, содержание которых в витаминной смеси корма было уменьшено в 5 раз по сравнению с рационом контрольной группы, получавшей все витамины.
К концу всего эксперимента в группе животных (-B+D), рацион которых на фоне продолжающегося дефицита витаминов группы В был скорректирован только по витамину D, масса тела крыс составила 244±5 г, что статистически значимо (р=0,015) меньше на 9,6% по сравнению с показателем контрольной группы, составившем 270±9 г. В группах крыс, рацион которых был восполнен по всем недостающим витаминам (+B+D), масса тела животных (252±10 г) хотя и была на 6,7% меньше по сравнению с контролем, однако снижение показателя было незначимым (р=0,193).
Статистически значимые различия по абсолютной массе органов (печень и мозг) у животных контрольной и опытных групп не выявлены.
Содержание микронутриентов в плазме крови, печени, мозге и моче крыс представлено в табл. 1-4.
Таблица 1. Биохимические показатели плазмы крови крыс после полной и неполной коррекции недостатка витаминов D и группы В (M±m)
Table 1. Biochemical parameters of rat blood plasma after complete and incomplete correction of deficiency of vitamins D and B group (M±m)
П р и м е ч а н и е. Здесь и в табл. 2-4:1 и 2 - номер группы, относительно которой указаны отличия; * - статистически значимое отличие (р<0,05); ** - тенденция к отличию (р<0,10).
N o t e. The superscript in tabl. 2-4 reflects the number of the group relative to which the differences are indicated; * - statistically significant difference (p<0.05); ** - the trend towards difference (p<0,10).
Таблица 2. Влияние полной и неполной коррекции сочетанного недостатка витаминов группы В и D в рационе крыс на биомаркеры витаминной обеспеченности в плазме крови (M±m)
Table 2. Influence of complete and incomplete correction of combined deficiency of B group and D vitamins in the rats’ diet on biomarkers of vitamin supply in blood plasma (M±m)
П р и м е ч а н и е. ТГ - триглицериды; ХС - холестерин. N o t e. TG - triglycerides; Chol - cholesterol.
Таблица 3. Влияние полной и неполной коррекции сочетанного недостатка в рационе крыс витаминов группы В и витамина D на содержание витаминов и минеральных веществ в печени и головном мозге крыс (мкг на 1 г сырой ткани) (M±m)
Table 3. Influence of complete and incomplete correction of the combined deficiency of B-vitamins and vitamin D in the diet on the content of vitamins and mineral substances in rat liver and brain (pg per 1 g of raw tissue) (M±m)
Таблица 4. Биомаркеры микронутриентного статуса в моче крыс, получавших рационы с сочетанным недостатком витамина D и витаминов группы В, с последующей его коррекцией (M±m)
Table 4. Urinary biomarkers of micronutrient status in rats fed diets with a combined deficiency of vitamin D and B-vitamins, followed by its correction (M±m)
Ранее нами было показано, что глубокий дефицит всех витаминов, включая все 8 витаминов группы В и витамин D, у крыс приводит к снижению в плазме крови активности В6-зависимых аланин- (АЛТ) и аспартат-аминотрансферазы (АСТ) в 1,4 раза при одновременном повышении концентрации глюкозы на 32%, железа на 31%, мочевины на 58% [12]. Как следует из табл. 2, по сравнению с контролем, у животных группы (-В+D) с сохранившимся дефицитом витаминов группы В активность АСТ была снижена в 1,5 раза, АЛТ - в 2,3 раза, а активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ), коферментом которой является никотинамидадениндинуклеотид, - на 15% (на уровне тенденции), что свидетельствовало о развитии у животных дефицита витаминов группы В. Концентрация железа в плазме крови в 2,7 раза превысила уровень у крыс контрольной группы, кальция - на 8%, глюкозы - на 15% (р<0,05), мочевины - на 32% (на уровне тенденции). Полученные данные показывают, что при полигиповитаминозе существенный вклад в нарушение перечисленных параметров вносит дефицит именно витаминов группы В.
Повышенный по сравнению с контролем уровень в плазме крови креатинина на 8,7% (р<0,05) и прямого билирубина на 24,2% (р<0,10) у крыс группы (-В+D), по-видимому, может быть следствием гипергликемии. В то же время отсутствие одновременного повышения выведения глюкозы, креатинина и мочевины с мочой (см. табл. 4) может свидетельствовать об ухудшении функционирования почек.
Обращает на себя внимание сниженная на 11,7% концентрация в плазме крови витамин D-зависимого белка остеокальцина, используемого при диагностике остеопороза. Таким образом, добавление витамина D в корм животных с полигиповитаминозом без устранения дефицита витаминов группы В не позволило восстановить концентрацию остеокальцина до уровня у обеспеченных всеми витаминами животных.
Добавление в рацион дефицитных по витаминам D и группы В животных всех недостающих витаминов +В+D) нормализовало большинство нарушенных показателей до уровня контрольной группы. Концентрация глюкозы, холестерина, кальция, железа, мочевины, остеокальцина восстановилась до величин у животных контрольной группы. Лишь активность АСТ и АЛТ заняла промежуточное положение между показателями двух групп: контрольной и дефицитной по витаминам группы В.
Сочетанный недостаток витаминов D и группы В в рационе животных не оказывал статистически значимого влияния на уровень ретинола в плазме крови крыс из всех групп (см. табл. 2). Восполнение в рационе крыс (+B+D) всех дефицитных витаминов позволило практически полностью восстановить концентрацию 25(OH)D в плазме крови (отличие от контрольной группы отсутствует), а также практически все показатели обеспеченности витаминами группы В (за исключением содержания витамина В2 в головном мозге, которое осталось сниженным на 9%). Сохраняющийся дефицит витаминов группы В у крыс из группы (-В+D) подтверждалось сниженным по сравнению с обеспеченными всеми витаминами животными (контроль) содержанием в печени витамина В1 в 4,3 раза, в мозге - на 26,4%, витамина В2 в печени - на 22%, в мозге - на 12,7% (см. табл. 3), а также рибофлавина в плазме крови в 2,1 раза (см. табл. 2). Добавление в корм витамина D на фоне сохраняющегося дефицита витаминов группы В (-B+D) сопровождалось заметной тенденцией к отставанию восстановления концентрации 25(OH)D до уровня у контрольных животных. Таким образом, дефицит витаминов группы В тормозит восстановление адекватной обеспеченности организма витамином D.
Сочетанный дефицит в рационе крыс витаминов D и группы В с последующим восполнением витаминной ценности корма до нормы (+B+D) не оказывал статистически значимого влияния на уровень α-токоферола в мозге и плазме крови. Вместе с тем содержание этого витамина в печени крыс группы (+B+D) (см. табл. 3) было ниже (р<0,10) по сравнению с показателями животных, как обеспеченных всеми витаминами в течение всего эксперимента (контроль), так и дефицитных по витаминам группы В (-B+D), что, по-видимому, отражало более низкое содержание холестерина в тканях. Это подтверждается тем, что при соотнесении концентрации в плазме крови витамина Е с холестерином различия исчезали (см. табл. 2).
Как видно из данных табл. 3, содержание всех элементов, за исключением марганца, в печени и головном мозге животных после полного восполнения недостатка витаминов в рационе (+B+D) не отличалось от показателей контрольной группы. Однако после коррекции рациона только по витамину D с сохранением дефицита витаминов группы В в печени крыс (-В+D) уровень железа был выше на 44,0% (p<0,10) относительно показателя в контроле. В мозге в 1,5 раза было повышено содержание марганца и на 14,5% кальция (p<0,10). Хотя различия не достигли уровня статистической значимости, однако они указывают на тенденцию к перераспределению минеральных элементов по органам, что может негативно влиять на физиологические процессы в мозге.
Как следует из данных табл. 4, после восполнения дефицита витамина D, но при сохранившемся дефиците витаминов группы В экскреция метаболитов витаминов В1, В6, а также кальция как в абсолютных величинах, так и в расчете на креатинин была статистически значимо снижена примерно в 2 раза, выведение рибофлавина - в 13,9 раза. Реабсорбция фосфата также была меньше показателя контрольной группы (p<0,05). Добавление в течение 7 сут недостающих в рационе витаминов D группы В до адекватного уровня восстановило эти показатели практически в полной мере.
Заключение
Таким образом, у растущих крыс на экспериментальной модели сочетанной недостаточности витаминов D и группы В, отражающей реальную обеспеченность этими витаминами населения нашей страны, было проведено сравнение эффективности коррекции дефицита витамина D путем восполнения его содержания в рационе до адекватного уровня без устранения недостатка витаминов группы В в рационе и в сочетании с витаминами группы В. Показано, что при алиментарном недостатке витаминов группы В у крыс полностью устранить дефицит витамина D не удается, о чем свидетельствует сниженный уровень в плазме крови гидроксилированной формы витамина D и маркера остеопороза - остеокальцина, при этом, соответственно, сохраняются и ассоциированные с дефицитом этих витаминов нарушения обмена веществ (повышенный уровень в плазме крови глюкозы, холестерина, мочевины, железа и др.).
Данное исследование показывает, что адекватная обеспеченность витаминами D и группы В является синергетическим фактором в поддержании уровня глюкозы, холестерина в плазме крови и других диагностически значимых показателей. Так, дефицит нескольких витаминов группы В у мышей (В1, В2, В6), как и витамина D (в клинических исследованиях), приводил к повышению в плазме крови концентрации провоспалительных цитокинов (фактора некроза опухоли а, интерлейкинов-1β, -6) и различным метаболическим нарушениям [13-16]. Одновременно полученные результаты указывают на недостаточную эффективность практикуемого врачами назначения холекальциферола в целях коррекции витамина D, даже в повышенных дозах, при наличии у взрослого и детского населения недостатка не только витамина D, а множественной недостаточности других микронутриентов (витаминов и/или минеральных веществ). Тем самым доказаны преимущества сочетанного применения витаминов D и группы В.