مقایسه تاثیر روش های مختلف تخریب دیواره سلولی ISC-23 Chlorella vulgaris و Spirulina platensis PCC9108 بر میزان لیپید استخراج شده جهت تولید بیودیزل

مقایسه تاثیر روش­های مختلف تخریب دیواره سلولی ISC-23 Chlorella vulgaris و Spirulina platensis PCC9108  بر میزان لیپید استخراج شده جهت تولید بیودیزل

سید مهدی حسینی*¹، فاطمه منتظری هدش²، سعید افشارزاده³

¹کارشناس ارشد گروه زیست­شناسی گیاهی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان

² کارشناس ارشد گروه زیست­شناسی سلولی و مولکولی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان

³استادیار گروه زیست­شناسی گیاهی، دانشکده علوم، دانشگاه اصفهان

تاریخ دریافت: 25/9/1390، تاریخ پذیرش: 24/8/1391

چکیده

از آنجا که لیپید مستخرج از ریزجلبک ها شدیداً متاثر از روش انتخابی برای تخریب و شکستن سلول­ها می­باشد، یک انتخاب مناسب می­تواند در کمیت و کیفیت بیودیزل تولیدی حائز اهمیت با شد. در این پژوهش با مقایسه چندین روش متفاوت، شامل اتوکلاو، انجماد، امواج مایکروویو، امواج اولتراسوند، بیدهای شیشه­ای و هموژنایزر با فشار بالا، موثرترین شیوه تخریب سلول­های ریزجلبکی (یوکاریوتی و پروکاریوتی) به منظور استخراج لیپید مورد بررسی قرار گرفت. جهت انجام آزمایش از ریزجلبک­ یوکاریوتی Chlorella vulgaris به عنوان نمونه­ای از ریزجلبک­هایی با دیواره سلولی سلولزی و ریز جلبک سبز آبی Spirulina platensis  با دیواره­ای مشابه باکتری­های گرم منفی، استفاده شد. در مورد هر دو ریزجلبک مورد مطالعه نتایج نشان داد که میزان لیپید کل استخراج شده بر اساس شیوه شکستن سلول، متفاوت است. این مقادیر برایSpirulina platensis  از 2/18 تا 2/7 و برای Chlorella vulgaris از 1/43-3/18 درصد از وزن خشک متفاوت بود. به طور کلی و با توجه به نتایج پژوهش حاضر، در هر دو نوع ریزجلبک یوکاریوتی و پروکاریوتی، کارا ترین روش تخریب سلول­ها و استخراج لیپید جهت تولید بیودیزل از آنها، اتوکلاو کردن و امواج مایکروویو بود.

واژه­های کلیدی: استخراج لیپید، بیودیزل، دیواره سلول، روش­های تخریب سلول، ریزجلبک.

مقدمه

بحران انرژی و گرم شدن جهانی زمین بر اثر مصرف سوخت­های فسیلی، یکی از نگرانی­های جامعه بین­المللی محسوب می­شود. در این راستا، هم­اکنون تلاش­های زیادی در جهت تولید بیودیزل توسط گیاهان، ریزجلبک­ها و حتی روغن­های حیوانی در حال انجام است تا به عنوان یک منبع انرژی جایگزین فراگیر شوند (Vasudevan & Briggs, 2008). مصرف بیودیزل دو مزیت عمده دارد؛ حذف دی­اکسید کربن و جایگزینی مواد نفتی (Chisti, 2008). در این میان استفاده از ریزجلبک­ها جهت تولید بیودیزل، در مقایسه با سایر روش­ها مزایای مشخصی دارد که می توان به سرعت رشد بالا و تولید بیومس زیاد در زمان کوتاه، فضای مورد استفاده کم اشاره کرد (Milne et al., 1990). فرایندهای اصلی تولید بیودیزل توسط ریزجلبک­ها شامل کشت، برداشت، استخراج لیپید و ترانس­استریفیکاسیون لیپیدها می­باشد. اگرچه تمام این مراحل مهم و ضروری هستند، ولی شکسته شدن سلول­ها از اهمیت ویژه­ای برخوردار است، به طوریکه میزان لیپید استخراج شده براساس شیوه مورد استفاده در شکستن سلول­ها متفاوت است. بنابراین، استفاده از روش و وسیله مناسب جهت تخریب سلول­ها یک مرحله کلیدی و مهم جهت افزایش کارایی استخراج لیپید می­باشد (Grima et al., 2003). به طور کلی روش­های تخریب دیواره­ سلول را می­توان به دو دسته تقسیم نمود؛ اول روش­های مکانیکی مانند هموژنیز کردن سلول­ها، استفاده از ذرات شیشه­ای، امواج التراسونیک، اتوکلاو کردن و دوم روش­های غیر مکانیکی از جمله انجماد، استفاده از حلال­های آلی، شوک اسمزی، تیمارهای شیمیایی مانند اسید و باز، و تیمارهای آنزیمی (Grima et al., 2003; Mata et al., 2010).

در انتخاب یک روش مطلوب جهت تخریب سلول­ها می­بایست عواملی مانند نوع دیواره سلولی ریزجلبک، طبیعت و کیفیت متابولیت مورد نظر و ابعاد کار(تجاری یا آزمایشگاهی) در نظر گرفته شود (Grima et al., 2003; Mata et al., 2010). به عنوان مثال امواج مایکروویو که سلول­ها را با استفاده از شوک ناشی از امواج با فرکانس بالا می­شکنند، یکی از روش­های موثر برای استخراج روغن­های گیاهی می­باشد (Cravotto et al., 2008; Virot et al., 2008). از طرفی ذرات ریز شیشه که هم در مقیاس آزمایشگاهی و هم در مقیاس صنعتی مورد استفاده است، با آسیب­های مکانیکی مستقیم بر روی سلول­ها باعث تخریب آنها می­گردد (Geciova et al., 2002; Lee et al., 1998). یکی دیگر از روش­هایی که بصورت گسترده جهت شکستن سلول­های میکروبی در مقیاس آزمایشگاهی استفاده می­شود امواج التراسونیک است (Engler, 1985). امواج التراسوند امواجی با فرکانس بالاتر از KHz 20-15 می­باشند که برای گوش انسان غیرقابل شنیدن است. این امواج در ابتدا باعث غیرفعال­سازی سلول­ها می­شود، ولی در قدرت بالا موجب تخریب سلول می­گردد. مکانیسم تخریب توسط این امواج به علت ایجاد حفرات ریز متعدد در مایع است، که پس از تشکیل به یکباره تخریب شده و مقدار زیادی از انرژی صوتی را به انرژی مکانیکی (امواج الاستیک) تبدیل و دیواره­ی سلولی را تخریب می­کند (Chisti & Moo-Young, 1986).

تعیین روش­های بهینه جهت تخریب سلول­های جلبکی می­تواند در استخراج بهتر چربی از این سلول­ها و افزایش محصول کمک کننده باشد. در همین راستا، در این پژوهش از دو نوع ریزجلبک استفاده گردید؛ یکی Chlorella vulgaris به عنوان یک ریزجلبک سبز یوکاریوتی با دیواره­ای سخت از جنس سلولز و دیگری ریزجلبک رشته­ای به نامSpirulina platensis  که نماینده جلبک­های سبز-آبی است (البته برخی آن را یک میکروارگانیسم پروکاریوتی با دیواره­ای از جنس پروتئین، مشابه باکتری­های گرم منفی می دانند). روش­های شکست سلولی که در این پژوهش مورد بررسی قرار گرفت شامل حرارت دادن در اتوکلاو، منجمد کردن در دمای 20- درجه سانتیگراد، امواج مایکروویو، امواج اولتراسونیک، هموژن کردن با فشار بالا و ذرات ریز شیشه­ای بود.

مواد و روش­ها

محیط کشت ریزجلبک­ها

جهت کشت ریزجلبک Spirulina platensis PCC9108 (که از از انستیتو پاستور فرانسه خریداری گردید) از یک محیط کشت تعدیل شده که مخلوطی از محیط­های کشت ASN-III و BG-11  با نسبت حجمی 1:1 است، استفاده گردید. همچنین کشت ریزجلبک ISC-23 Chlorella vulgaris (که از مرکز جهاد دانشگاهی دانشگاه شهید بهشتی  تهییه شد) در محیط کشت استاندارد BG-11 انجام گرفت (Chang & Yang, 2003; Ghasemi et al., 2010).

شرایط کشت ریزجلبک­ها

نمونه­های خالص هر یک از ریزجلبک­ها در ارلن مایر یک لیتری (حاوی ml 700 محیط کشت استریل) کشت شد. دمای اتاق کشت بین 25 تا 28 درجه سانتیگراد و شدت نور آن با استفاده از لوکس مترLux-UV-IR Meter (مدل LEYBOLD 666 230) در دامنه Lx200 ± 3600 تنظیم گردید (Fan et al., 2008). سیکل روشنایی- تاریکی (16/ 8) اعمال و برای همگن سازی محیط کشت از شیکر استفاده شد، که سرعت آن برای C. vulgaris ، rpm 100 و برای S.  platensis  ، که بزرگتر و مارپیچی شکل است، rpm 120 تنظیم گردید.

روش استخراج و محاسبه محتوی لیپید کل

جهت استخراج لیپید کل از روش Bligh  و Dyer استفاده شد (Bligh & Dyer, 1959; Chiu et al., 2008) که به صورت خلاصه شامل مراحل زیر می­باشد. پس از نمونه­گیری از محیط کشت، سلول­ها توسط سانتریفیوژ به مدت 15 دقیقه در rpm3000  جدا شدند. یکبار توسط آب اسیده و یکبار توسط آب مقطر شستشو داده شدند. در آخر رسوب سلولی تحت تیمارهای متفاوت جهت شکستن سلول­ها قرار گرفت. برای استخراج لیپید، نمونه­ها در محلولی شامل دو حلال متانول و کلروفرم با نسبت حجمی 2 به 1 حل شد. سپس توسط ورتکس، نمونه­ها به مدت 5 دقیقه به شدت مخلوط شد. در مرحله بعد کلروفرم و  کلرید سدیم 1% اضافه شد، تا در آخر مخلوط بدست آمده دارای نسبت 2 متانول/ 1  کلروفرم / 1  کلرید سدیم 1%  باشد. حلال حاوی بیومس حل شده را درون یک دکانتور[1] ریخته و اجازه داده می­شود فاز آلی (شامل کلروفرم و لیپید کل) و فاز آبی از هم جدا شوند. بین این دو فاز نیز توده چربی گیری شده سلول­ها قرار دارد. در نهایت کلروفرم در روتاری تبخیر و جدا می­شود. بقایای بجا مانده از تبخیر کلروفرم را وزن کرده و درصد لیپید کل گزارش گردید.

روش­های شکستن سلول

در این پژوهش 6 روش متداول شکستن سلول­ها مورد بررسی قرار گرفت که در ادامه به جزئیات و شرایط دقیق هر روش اشاره می­گردد.اتوکلاو کردن؛ حرارت دادن یکی از روش­های مورد استفاده جهت تخریب دیواره و غشای سلول است. نمونه­ها در این روش به مدت 5 دقیقه در دستگاه اتوکلاو در دمای C̊ 121 و فشار 5/1 بار قرار گرفتند. در نتیجه حرارت و فشار بالا، سلول­ها به خوبی تخریب می­شوند. منجمد کردن؛ انجماد باعث تشکیل بلورهای یخ در داخل سلول می­شود. هرچه این فرایند آهسته­تر صورت گیرد، بلورهای تشکیل شده بزرگتر بوده و آسیب بیشتری به دیواره و غشای سلول وارد می­کند. در نتیجه استفاده از فریزر 20- درجه سانتیگراد جهت شکستن سلول مطلوب­تر از انجماد در دماهای کمتر می­باشد. امواج مایکروویو ( با تولید دمای 100 درجه سانتیگراد و MHz  2450)؛ در این روش نمونه­ها به مدت 2 دقیقه در مایکروویو قرار گرفتند که بوسیله حرارت بالایی که ایجاد می شود دیواره سلولی ریزجلبکها از هم پاشیده و استخراج لیپید تسهیل می گردد. امواج اولتراسونیک؛ این امواج دیواره سلولی و غشای سلول را بدلیل ایجاد حفرات متعدد، تخریب می­کنند. در این روش از اولتراسونیکاتور VP200H به مدت 5 دقیقه (پالس­های30 ثانیه­ای) استفاده شد. هموژن کردن با فشار بالا؛ جهت هموژن کردن سلول­ها از دستگاه هموژنیزر Heidolph Diax 900 استفاده شد. کل فرایند هموژن کردن به مدت 5 دقیقه، در پالس­های 30 ثانیه­ای، انجام شد. ذرات ریز شیشه­ای؛ یکی از روش­های آزمایشگاهی مرسوم در شکستن سلول، استفاده از ذرات شیشه است. این ذرات به نمونه اضافه شده و سپس به مدت 5 دقیقه توسط ورتکس به شدت مخلوط گردید.

روش‌های آماری

به منظور مقایسه میانگین لیپید استحصالی به وسیله روش‌های مختلف شکست سلولی، با استفاده از نرم SPSS، آزمون آنالیز واریانس (ANOVA) یک طرفه به انجام شد. پس آزمون دانکن بمنظور مقایسات چندگانه روش‌های مختلف شکست مورد استفاده قرار گرفت. سطح معنی داری آماری 05/0 در نظر گرفته شده است.

نتایج

آزمون ANOVA یک طرفه نشان داد که بین روش‌های مورد بررسی شکست سلول در هر دو گونه ریزجلبک موردنظر، در سطح معنی داری 05/0، تفاوت آماری معنی داری وجود دارد (P<0.05). به عنوان نمونه شاهد، هیچ یک از روش­های شکستن سلول اعمال نگردید. پس آزمون دانکن نشان داد که میانگین میزان استحصال چربی از ریزجلبک C.vulgaris توسط تمامی روش‌های مورد بررسی، به صورت معنی داری بالاتر از میانگین این مقدار در گروه کنترل (شاهد) بود. از بین روش­های مقایسه شده، اتوکلاو کردن و امواج مایکروویو بهترین گزینه برای تخریب سلول­های ریزجلبک Chlorella vulgaris بود، در حالی­که امواج التراسونیک، ذرات شیشه­ای و انجماد نتایج مشابهی را نشان داده و از کمترین کارایی در استخراج چربی برخوردار بودند. با این وجود، روش هموژناسیون کارایی بیشتری نسبت به التراسونیک، ذرات شیشه­ای و انجماد داشت. نتایج آماری و میزان چربی استخراجی از C.vulgaris در شکل 1 آمده است. مقایسات میانگین در مورد S.platensis نیز حاکی از معنی داری اختلافات در میانگین استحصال چربی در تمامی روش‌های مورد بررسی نسبت به گروه کنترل بود. همچنین کارایی شکستن سلول توسط اتوکلاو کردن و امواج مایکروویو دارای عملکرد مشابهی بود و در بین تمامی روش­های بررسی شده، بیشترین میزان چربی توسط این دو روش بدست آمد. از طرفی بین روش‌های انجماد و التراسونیک نیز تفاوت معنی داری مشاهده نشد، در حالی که روش هموژناسیون کارایی بیشتری داشت. نتایج آماری و میزان چربی استخراجی از ریزجلبک S.platensis در شکل 2 آمده است.

شکل 1- لیپید مستخرج بر اساس روش­های متفاوت شکستن سلول در ریز جلبک Chlorella vulgaris

(حروف متفاوت در بالای هر ستون نشان دهنده­ی تفاوت معنی­دار بین گروه­ها می­باشد).

شکل 2- لیپید مستخرج بر اساس روش­های متفاوت شکستن سلول در ریز جلبک  Spirulina platensis

(حروف متفاوت در بالای هر ستون نشان دهنده­ی تفاوت معنی­دار بین گروه­ها می­باشد).

بحث

دیواره سلولی میکروارگانیسم­ها سخت­تر از چیزی است که به نظر می­رسد. فشار داخلی یک میکروارگانیسم همانند Micrococcus lysodeikticus یا Sarcina lutea حدود 20 اتمسفر است و ساختاری که مسئول حفظ این استحکام است، همان دیواره سلولی میکروارگانیسم است (Chisti & Moo-Young, 1986). دیواره سلولی کریپتوفیت­ها به راحتی شکسته می­شود، ولی در مورد سیانوباکتریها دیواره­ی آنها بسیار سخت و محکم است (Siegelman & Kycia, 1978). مشاهده مقطع عرضی S.platensis در زیر میکروسکوپ الکترونی نشان می­دهد که دیواره سلولی آن از 4 لایه تشکیل شده است، که مشابه دیواره سلولی باکتری­های گرم منفی بوده و قسمت عمده آن را لایه پپتیدوگلیکان تشکیل داده است (Richmond, 2006; Vonshak, 2002). ریزجلبک C.vulgaris نیز حاوی دیواره­ای سخت از جنس سلولز است. بنابراین تخریب دیواره­ی سلولی این دو ریزجلبک به روش موثری نیاز دارد.

در این پژوهش مشخص شد که کارایی امواج مایکروویو و اتوکلاو در شکست سلولی و استخراج چربی از هر دو گونه­ی مورد مطالعه، نسبت به سایر روش­های مقایسه شده، بیشتر است. همچنین بنظر می­رسد که ریزجلبک Chlorella vulgaris نسبت به Spirulina platensis  تا حدود 3 برابر میزان لیپید بیشتری دارد (مقایسه میزان لیپید این دو گونه در پژوهش دیگری از همین محققین که در دست چاپ می باشد صورت گرفته است). به عنوان مثال Moraes و همکاران جهت استخراج C-فیکوسیانین از S.platensis و شکستن سلول­ها چندین تیمار شیمیایی با اسید، انجماد و امواج التراسونیک را مورد مقایسه قرار دادند. نتایج آنها نشان دهنده بیشترین میزان C-فیکوسیانین استخراج شده توسط روش­های التراسونیک و تیمار اسیدی بود (Moraes et al., 2011). البته مقایسه این محققین صرفاً بین روش­های ذکر شده بوده و از اتوکلاو یا مایکروویو استفاده نکرده­اند. همچنین Zheng et al. (2011) نیز که چندین روش آنزیمی، انجماد در نیتروژن مایع و امواج مایکروویو را جهت شکستن دیواره سلولی C.vulgaris استفاده کردند،گزارش نمودند که یکی از موثرترین روش­ها استفاده از  مایکروویو است. Lee et al. (2010) نیز روش­های متفاوتی را برای مقایسه شکستن سلول و استخراج چربی از ریزجلبک­های Botryococcus، Chlorella vulgaris و Scenedesmus مورد مقایسه قرار دادند. نتایج آنها نشان داد که امواج مایکروویو و اتوکلاو بیشترین کارایی را دارند.. در بین روش­های مکانیکی، کارایی هموژنیزر به عنوان یک روش مناسب در مقیاس صنعتی، توسط برخی از پژوهشگران اثبات شده است (Chisti & Moo-Young, 1986). در این ارتباط، نتایج نشان از کارایی بالای این روش در هر دو ریزجلبک داشت، به طوری که پس از اتوکلاو و مایکروویو بیشترین استخراج لیپید توسط این روش صورت گرفت.

به طور کلی روش استخراج یک نکته­ی کلیدی در بدست آمدن حداکثر پروتئین و چربی از جلبک­ها می­باشد (Lee et al., 2010; Niu et al., 2006). این روش­ها بستگی زیادی به طبیعت و کیفیت متابولیت مورد نظر دارد. به عنوان مثال در مورد استخراج آستاگزانتین، Cravotto et al. (2008) روش­های مختلفی را مورد بررسی قرار دادند و بهترین گزینه جهت استخراج این متابولیت از ریزجلبک Haematococcus را مربوط به استفاده از اتوکلاو و تخریب مکانیکی سلول­ها اعلام کردند. در همین ارتباط قابل ذکر است که روش­های شیمیایی همانند تیمار با اسید و باز، با وجود کارایی زیاد جهت تجزیه دیواره­ی سلولی، برای استخراج محصولات حساسی همچون پروتئین­ها مناسب نمی­باشد. با این وجود تیمار قلیایی می­تواند برای جدا کردن اسیدهای چرب آزاد مورد استفاده قرار گیرد. حلال­های آلی مانند هگزان، اتانول، کلروفرم و دی­اتیل­اتر با تخریب غشای پلاسمایی می­توانند تا حدودی بیومس را متلاشی کنند. این روش به طور گسترده برای استخراج متابولیت­هایی مانند آستاگزانتین، بتا-کاروتن و اسیدهای چرب استفاده می­گردد (Grima et al., 2003). همچنین برخی محققین از حلال­های آلی جهت استخراج لیپید برای تولید بیودیزل استفاده کرده­اند. در این مورد، مخلوطی از هگزان و اتانول 96% بر روی بیومس لیوفیلیز شده اعمال می­شود. با این وجود، اگر چه با این روش می­توان لیپیدها را استخراج کرد، ولی ترکیبات دیگری همچون قندها، اسیدهای آمینه، نمک­ها، پروتئین­های هیدروفوب و پیگمنت­ها نیز به صورت ناخواسته وارد فاز آلی می­گردند (Cravotto et al., 2008).

از دیگر عوامل مهم در رابطه با شیوه تخریب سلول، ابعاد کار است، که بنابر مقیاسی که مورد نظر است، تجاری یا آزمایشگاهی، روش نیز تغییر می­کند. به طور مثال Bubrick (1991) با استفاده از روش انجماد در 170- درجه سانتیگراد (روش کریوژنیک) بیومس Haematococcus را جهت استخراج آستاگزانتین توسط butylated hydroxytoluene تیمار کرد. بدیهی است این روش برای مصارف تجاری منطقی نمی­باشد. در عوض، استفاده از هموژنیزر جهت استخراج آستاگزانتین از بیومس ریزجلبک Haematococcus ، نسبت به دیگر روش­ها بازده سه برابری دارد. همچنین با وجود کارایی زیاد امواج التراسونیک در برخی از گونه­های باکتریایی و یا جلبکی، از این روش تنها می­توان برای شکستن سلول در مقادیر کم بیومس استفاده کرد، در حالی که در مقیاس وسیع کاربردی نمی­باشد (Grima et al., 2003).

پس از کشت و تولید انبوه میکروارگانیسم­ها جهت مقاصد تجاری، در راستای فراوری بیوماس حاصله برای استحصال ترکیبات درون سلولی، مهمترین مسئله انتخاب یک روش مناسب برای شکستن سلول­ها می­باشد. اغلب روش­هایی که در این مورد برای باکتری­ها استفاده می­شود را می­توان برای ریزجلبک­ها نیز اعمال نمود (Grima et al., 2003). به طور کلی در مقیاس صنعتی روش­های مکانیکی برای شکستن سلول کارایی بیشتری داشته و مقرون به صرفه هستند. روش­های آنزیمی و شیمیایی بیشتر در قیاس آزمایشگاهی کاربرد دارند. استفاده از چندین روش به صورت توأم نیز می­تواند مفید باشد (Chisti & Moo-Young, 1986; Kula & Schütte, 1987 ). در هر دو گونه جلبک مورد بررسی، بالاترین کارایی به روش اتوکلاو کردن و امواج مایکروویو تعلق داشت. سپس به ترتیب روش هموژن کردن، انجماد، التراسونیک و ذرات شیشه­ای در رتبه‌های بعدی اهمیت قرار داشتند. با این تفاوت که سه روش آخر در استحصال چربی از ریزجلبک C.vulgaris کارایی مشابهی داشتند اما کارایی ذرات شیشه­ای در رابطه با ریزجلبک S.platensis پایین تر از دو روش دیگر بود. با توجه به کارایی بیشتر و سهولت استفاده از امواج مایکروویو، می­توان به این نتیجه رسید که احتمالا مایکروویو از نظر مصارف صنعتی نیز گزینه­ی قابل توجهی در استخراج چربی از سلول­های ریزجلبکی می­باشد.

سپاسگزاری

از خانم سارا عظیمی برای انجام آنالیز آماری نتایج و همچنین مسئولین آزمایشگاه تحقیقاتی (فیزیولوژی گیاهی) دانشگاه اصفهان برای همکاری سپاسگزاریم.