Substratspezifität und Stereoselektivität der Galaktitoldehydrogenase aus Rhodobacter sphaeroides D

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, einen sehr detaillierten Einblick in den katalytischen Mechanismus und in die Bindungsver-hältnisse von Substraten im aktiven Zentrum der Galaktitoldehydro-genase (GatDH) aus Rhodobacter sphaeroides D, einer short-chain-Dehydrogenase, zu erhalten. Das Substratspektrum der GatDH er-streckt sich von 1,2-Diketonen, die bevorzugt umgesetzt werden, und Hydroxyketonen über 1,3- 1,4-Diketone sowie α- und β-Ketoester. Die Verbindungsklassen der 1,3- und 1,4-Diketone stellten sich außerdem als recht effektive Inhibitoren der GatDH heraus. Durch Docking-Untersuchungen konnten die Substratspezifität und die für jede Sub-stanzklasse eigene Stereospezifität, die mittels Gaschromatographie an chiraler Festphase bestimmt wurde, erklärt werden. Für die Substrate, deren Kinetik vom Michaelis-Menten-Modell abweicht, wurde eine unkompetitive Substrathemmung gefunden. Ei-ne weitere wichtige Erkenntnis war, dass die enzymkatalysierte Re-duktion von 1,2-Diketonen zu 1,2-Diolen nicht in einem Reaktions-schritt, sondern über die Bildung eines Zwischenproduktes, eines Hydroxyketons, verläuft. Für eine Anwendung als Biokatalysator bei der Synthese chiraler Diole erscheint die GatDH als ungeeignet, da nur die aliphatischen 2,3-Diketone schnell genug umgesetzt werden. Diese zeigten jedoch Substratinhibition, welche Umsetzungen im großtechnischen Maßstab stark erschwert.

Within this work we gained detailled insight in the catalytic mechanism and the binding of substrates in the active site of the short-chain-dehydrogenase Galactitoldehydrogenase (GatDH) isolated from Rhodobacter sphaeroides D. The wide scope of GatDH substrates comprises 1,2-diketones, which are the favored ones, hydroxyketones, 1,3-, 1,4-diketones as well as α- and β-ketoesters. On the other hand 1,3- and 1,4-diketones turned out to be effective inhibitors of GatDH. Both substrate specifities derived from the reaction kinetics and stereospecifities, determined by chiral gaschromatography, could be explained by dockingstudies for various substrates. For those substrates deviating from Michaelis-Menten kinetics, a substrate inhibition for high substrate concentrations could be demonstrated. The rediction of diketones by GatDH occurs in two steps via formation of hydroxyketones as intermediates. GatDH turned out to be improper as a biocatalytator for producing chiral diols. Just aliphatic 2,3-diones are reduced in a sufficient velocity by GatDH, but show a high degree of substrate inhibition, which complicates its large-scale conversion.