一、视频摘要
禾本科牧草种子通常较小，颖壳难以剥除，导致其组织培养诱导时间长，效率低，并且颖壳中携带的细菌与真菌不易清除，经常导致污染。本方法较为全面介绍了牧草组织培养过程中的常规操作，并且通过使用简便巧妙且不影响种子活力的物理方法（橡胶板揉搓法）去除种子的颖壳，还针对种子特点进行了机械切割（横切与纵切）降低了污染率，缩短了愈伤诱导时间并且增加了诱导率，该方法可在较短时间内获得大量的外植体用于组织培养实验，还可为其他种子外植体的准备和处理提供参考。
二、关键词
牧草组织培养 种子去壳
外植体处理 愈伤诱导 种子消毒
三、实验样品信息，试剂、耗材或仪器
1. 样品信息
牧草种子(黑麦草)
2. 试剂和耗材
灭菌蒸馏水、75%酒精(v/v)、10%次氯酸钠溶液(v/v)、配制好的固体培养基、称量纸、药匙、吸水纸、灭菌滤纸、无菌培养皿、灭菌 50mL 离心管、灭菌镊子、灭菌解剖刀、100mL 锥形瓶、酒精灯、大小两块硬质橡胶板、计时器、废液缸、封口膜
3. 仪器和软件
高压蒸汽灭菌锅、电子天平、磁力搅拌器与转子、超净台
四、实验操作
1 器具与试剂准备
按照上述准备实验材料。（注意事项：蒸馏水必须经过高压蒸汽灭菌，酒精和次氯酸钠溶液的配制均是体积比）
2 种子称量
根据种子千粒重，计算所需的种子重量，使用电子天平进行称量。（注意事项：不同物种、品种的种子千粒重有较大差异，需要根据所用物种的千粒重以及所要接种的种子数量调整称取重量）
3 种子浸泡
将上述电子天平称量的种子倒入 100mL 锥形瓶中，依次向 100mL 锥形瓶中倒入 75mL 蒸馏水、25mL
10%次氯酸钠溶液，放入转子。将锥形瓶放在磁力搅拌器上，用磁力搅拌器搅拌 15-30min 后取下锥形瓶。倒出锥形瓶内的液体，并用蒸馏水清洗 3-4 次。（注意事项：该步骤的目的是使种子颖壳松软，便于后续的揉搓，并且杀死种子表面的部分细菌和真菌；次氯酸钠溶液有漂白性，对手有轻微伤害，需要戴手套操作）
4 种子揉搓
将上述锥形瓶内的牧草种子转移至干净吸水纸上吸干水分，再将种子转移至大的橡胶板上。利用两块胶板之间的摩擦力使颖壳与种子分离，再用干净的镊子选出不含颖壳的种子。（注意事项：该步骤要注意揉搓力度适当，防止种子被挤压碎裂；如果仍有颖壳未脱落，可如此反复多次摩擦，直至选出足够数量的牧草种子）
5 种子消毒
将上述去除颖壳的牧草种子转移进 50mL 离心管里，在酒精灯火焰旁向管内倒入适量 75%的酒精（约 30-40mL）进行消毒处理，反复摇晃。1min 后将酒精倒出，再倒入适量 10%次氯酸钠溶液（约 30-40mL）进行消毒处理。30min 后将10%次氯酸钠溶液倒出（期间每隔 5 分钟上下震荡一次），并用蒸馏水清洗 6-8次。利用酒精灯外焰灼烧镊子与解剖刀，将牧草种子转移至铺有滤纸的干净培养皿上。(注意事项：该步骤在超净工作台进行，因为不涉及毒性试剂，操作得当可不戴手套；操作过程一定要注意严格无菌操作，手不要碰触到与种子接触的地方)
6 种子切割
用冷却后的镊子与解剖刀对上述牧草种子进行横切和纵切。(注意事项：该步骤目的是使种子胚部分产生适当的机械损伤，根据实验需要和种子的特点选择切或不切)
7 种子接种
将上述切割好的牧草种子接种至培养基上，并用封口膜封好。（注意事项：严格控制无菌操作，注意做好时间、培养类型等标记）
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