Untersuchungen zur Regio- und Stereoselektivität von Lipasen durch computergestütztes Molecular Modeling und molekularbiologische Methoden

Abstract

Es wurde ein Modell entwickelt, mit dessen Hilfe die Stereoselektivität von mikrobiellen Lipasen bei der Hydrolyse von Triacylglyceriden und in sn-2 substituierten Analoga verstanden und vorhergesagt werden kann. Es wurde zwei Typen von Triacylglyceriden und Analoga untersucht: flexible Substrate mit einer frei drehbaren O'-C1' Ether beziehungsweise Esterbindung (Alkylether-, Benzylether-, Estersubstrat) sowie rigide Substrate mit einer N'-C1' Amid- (Amidsubstrat) beziehungsweise C1'-C2'-Doppelbindung (Phenylsubstrat). Molecular Modeling Studien wurden durchgeführt, um die Wechselwirkungen zwischen Lipase und Substrat zu untersuchen. Lipase-Substrat Wechselwirkungen sind hauptsächlich repulsiv und sterisch und treten auf zwischen dem sn-2 Substituenten und fast ausschließlich dem C-terminalen Nachbar zum katalytisch aktiven Histidin (L258 in Rhizopus oryzae Lipase, ROL, und Rhizomucor miehei Lipase, RML, sowie L287 in Pseudomonas cepacia Lipase, PCL) beziehungsweise einem strukturell benachbarten Rest (F344 in Candida rugosa Lipase, CRL, und I290 in Candida antarctica Lipase B, CAL B). Diese sterischen Abstoßungen beeinträchtigen die Substratgeometrie. Ein Torsionswinkel, FO3-C3, im Substrat konnte identifieziert werden, der mit der experimentell ermittelten Stereoselektivität korreliert und eine Unterscheidung zwischen sn-1 und sn-3 hydrolysierten Triacylglyceriden und Analoga zuläßt. Ein Wert von FO3-C3 > 150° korreliert mit sn-1, FO3-C3 < 150° mit sn-3 Stereoselektivität. Das Modell wurde weiter verbessert und erweitert, indem Mutationen in ROL und PCL eingeführt wurden beziehungsweise für CRL und CAL B angewendet wurde. Das Modell gilt für alle untersuchten Lipase-Substrat-Komplexe. Der Torsionswinkel FO3-C3 korreliert mit den experimentell bestimmten Stereoselektivitäten. Weitere Untersuchungen erstreckten sich auf Wechselwirkungen der PCL mit g- und d-Lactonen und primären Alkoholen sowie die Regioselektivität von mikrobiellen.

A model was introduced to explain and predict the stereoselectivity of microbial lipases toward the hydrolysis of triacylglycerols and in sn-2 substituted analogs. Two types of substrates were investigated: flexible substrates with a rotatable O'-C1' ether or ester bond (alkylether, benzylether, and ester analog) and rigid substrates with a non-rotatable N'-C1' amide (amide) or C1'-C2' double bond (phenyl). Molecular modeling studies were performed to investigate lipase-substrate interactions. 50 resulting enzyme-substrate complexes were superimposed and an average structure was calculated. It was found that lipase-substrate interactions were mainly repulsive and sterical between the sn-2 substituent and mainly the C-terminal (L258 in Rhizopus oryzae lipase and Rhizomucor miehei lipase and L287 in Pseudomonas cepacia lipase) or a structural but not sequential neighbor of catalytic histidine (F344 in Candida rugosa lipase and I290 in Candida antarctica lipase B). These sterical repulsions affected the substrate geometry. One torsional angle, FO3-C3, in the substrate was found to correlate to the experimentally determined stereoselectivity discriminating between sn-1 and sn-3 Stereopreference. A FO3-C3-value > 150° correlates to sn-1, FO3-C3 < 150° to sn-3 stereopreference. The model was further improved by introducing mutations in the lipases of Rhizopus oryzae and Pseudomonas cepacia at position 258 (L258A, L258S, L258F) and 287 (L287F), respectively. Also, in Rhizopus oryzae lipase double mutants were created (L258F/L254A, L258F/L254V, L258F/L254F). The model was extended to the lipases from Candida rugosa and Candida antarctica B. For all investigated lipase-substrate complexes, the model holds and FO3-C3 correlates to the experimentally determined stereoselectivity. Further studies were performed investigating the stereoselectivity of d- and g-lactones and primary alcohols as well as the regioselectivity of microbial lipases toward triacylglycerols.