Введение

В стоматологии и челюстно-лицевой хирургии существует потребность в остеопластических материалах, позволяющих увеличить объем альвеолярного гребня и создать условия для проведения дентальной имплантации.

Среди костно-пластических материалов «золотым стандартом» до сих пор является аутогенная костная ткань [1]. Однако она не лишена недостатков, связанных с дополнительным хирургическим вмешательством для забора кости из донорского участка, сопровождающимся болевыми ощущениями, потерей крови, развитием гематом, риском инфицирования и развития других осложнений [2].

Костная пластика с использованием аутогенной костной стружки и имитирующих ее костно-пластических материалов, таких как гранулированный гидроксиапатит, требует использования дополнительных мембран и армирующих конструкций для исключения врастания мягких тканей и поддержания определенной формы замещенного костного дефекта [3—5]. Применение лекарственной формы в виде цемента позволяет добиться плотной адаптации материала к краям дефекта, а способность к отверждению обеспечивает сохранение формы имплантата. Однако плотность структуры цементов затрудняет врастание сосудов и их своевременную резорбцию [6, 7]. В связи с этим перспективной основой для костно-пластических материалов являются отверждаемые гидрогели. Данные материалы обладают высокой биологической совместимостью, низкой антигенностью и гидрофильностью. За счет пористости и оптимальных сроков резорбции они выступают в качестве матрицы для образования костной ткани, а текучесть и способность к отверждению позволяют применять такие материалы для восстановления дефектов сложной формы.

Для придания костно-пластическому материалу способности индуцировать неоостеогенез наравне с аутогенной костной стружкой его активируют путем включения в состав остеоиндукторов белково-пептидной природы (ростовых и дифференцировочных факторов), действие которых направлено на активацию в клетках сигнальных путей, приводящих к остеогенной дифференцировке [8, 9]. Существует ряд зарегистрированных и разрешенных для клинического применения материалов, содержащих остеоиндуктивные компоненты, среди которых наибольшей эффективностью обладает костный морфогенетический белок 2 (BMP-2) — подкожная инъекция этого фактора даже в малых дозах способна индуцировать эктопический неоостеогенез. Однако существующие материалы на основе BMP-2, среди которых самым известным является Infuse Bone Graft («Medtronic», USA), обладают недостаточной эффективностью, так как материал-носитель не обладает способностью к длительному удержанию белка и его выброс в окружающие ткани происходит в 1-е сутки после имплантации. Под воздействием ряда факторов в области введения материала возникает посттравматическое воспаление, которое отрицательно влияет на остеоиндуктивные свойства BMP-2 [10].

В связи с этим в качестве основы для материала необходимо использовать полимер, обладающий биосовместимостью, механической прочностью и пролонгированной кинетикой высвобождения белка. Гидрогель на основе высокоочищенного коллагена является наиболее перспективным материалом для решения поставленных задач, поскольку помимо высокого сродства к белкам организма и отсутствия антигенных свойств, он способствует прорастанию сосудов и пролиферации клеток соединительной ткани [5]. Продуктами биодеградации коллагена являются безопасные метаболиты, которые могут полностью выводиться из организма или участвовать в синтезе новых белков, в том числе собственного коллагена [11]. Как было показано ранее, данный материал способен к длительному удержанию и своевременному высвобождению факторов роста [12].

Вышеперечисленные положительные свойства коллагенового гидрогеля позволяют рассматривать его в качестве перспективной основы для разработки высокоэффективных активированных остеопластических материалов.

Цель исследования — показать биосовместимость и остеоиндуктивные свойства гидрогеля на основе высокоочищенного коллагена и фибронектина, импрегнированного rhBMP-2.

Материал и методы

Получение растворов BMP-2

Приготовление стоковых растворов: 10 мкг рекомбинантного человеческого костного морфогенетического белка-2 (rhBMP-2, «AkronBiotech», США, SKU: AK8356, получен в E. cоli) растворяли в 100 мкл буфера, содержащего 100 мкг BSA и 20 мкл 10 mM уксусной кислоты. Для определения эффективной концентрации BMP-2 in vitro его стоковый раствор добавляли в лунки 24-луночных планшетов к клеткам для создания концентрации 1 и 10 мкг/мл в питательной среде. Для определения эффективной дозировки in vivo стоковый раствор BMP-2 растворяли в буфере для получения концентраций 1, 3, 6 и 10 мкг/мл и смачивали ими желатиновые губки Spongostan (P & G, США), которые впоследствии имплантировали крысам подкожно.

Получение коллаген-фибронектинового гидрогеля с BMP-2

Стерильный 10% нейтральный раствор коллагена I типа свиньи (ViscollTM, кат. PA100, ООО фирмы «Имтек») смешивали с фибронектином человека (кат. H Fne-C, ООО фирмы «Имтек») в соотношении по объему 1:4. Белок-остеоиндутор rhBMP-2 добавляли в коллаген-фибронектиновую смесь до получения конечной концентрации 10 мкг/мл, после чего инкубировали при 4 °C в течение 24 ч.

Клеточные культуры

Для тестирования материалов использовали культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) человека, полученные из биоптатов подкожной жировой клетчатки. Данные культуры были ранее получены и охарактеризованы в лаборатории генетики стволовых клеток ФГБНУ «Медико-генетический научный центр». Выделение клеточных культур проводилось по стандартным протоколам после подписания донорами развернутого добровольного информированного согласия на использование биоматериала в научных исследованиях [13, 14].

Оценка цитотоксичности и клеточной адгезии

МТТ-тест. Для изучения цитотоксического действия образцов материала использовали MTT-тест, проводимый по стандартной методике [15]. Гидрогель, изготовленный из высокоочищенного стерильного коллагена свиньи (P C11-ACL, «Имтек», Россия), помещали в питательную среду DMEM («ПанЭко», Россия) на 3 сут в соотношении 1:1. Полученный экстракт питательной среды ежедневно добавляли к культурам ММСК. Через 1, 4 и 7 сут выполняли МТТ-тест по стандартной методике. В лунки добавляли МТТ («ПанЭко», Россия) в концентрации 0,5 мг/мл и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C, визуально контролируя развитие окраски. Кристаллы формазана экстрагировали из клеток с помощью ДМСО («ПанЭко», Россия), перемешивая на шейкере в течение 20 мин. Поглощение формазана оценивали, измеряя оптическую плотность элюата при длине волны 570 нм и вычитая фоновое значение при 620 нм на многофункциональном планшетном ридере EnSpire Multimode Plate Reader («PerkinElmer», США).

Витальное окрашивание клеточных культур. Для визуализации клеток на поверхности материалов их предварительно окрашивали с помощью витальной мембранной флуоресцентной метки PKH-26 (red fluorescent cell linker kit, Sigma) в соответствии с инструкцией производителя. Суспензию меченых клеток ММСК наносили на образцы материала в концентрации 1 млн/мл и инкубировали 1 ч для прикрепления клеток. Затем добавляли культуральную среду и инкубировали при стандартных культуральных условиях (37 °С, 5% CO₂). Далее на 7-е и 14-е сутки получали изображения клеток на поверхности материала с помощью флуоресцентного инвертированного микроскопа AxioObserver D1 с камерой AxioCam HRc («Carl Zeiss», Германия).

Определение эффективности BMP-2

ПЦР в реальном времени

Для оценки экспрессии генов применяли ПЦР-анализ в режиме реального времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green I («Евроген», Россия). Суммарную РНК выделяли из клеток с помощью набора RNeasy Plus Mini Kit («Quagen», Германия) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Синтез кДНК на матрице РНК проводили согласно протоколу набора RQ1 RNase-Free DNase («Promega», США) с использованием обратной транскриптазы M-MuLV и олиго-dT-праймеров. В ПЦР-реакции использовали геноспецифические праймеры к генам маркеров остеогенной дифференцировки: Runx2 и BMP-2. Уровень экспрессии мРНК анализируемых генов определяли относительно геометрического среднего выраженности амплификации референсного гена GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы) и ACTB (β-Актина) (см. таблицу).

Имплантация материалов in vivo

Объект исследования. Самцы крыс линии Wistar массой 250—350 г общим количеством 42 особи. Для подбора эффективной концентрации остеоиндуктора in vivo для подкожной имплантации желатиновых губок с концентрацией BMP-2 1, 3, 6 и 10 мкг/мл использовали 12 животных по 3 в каждой группе. Исследование остеоиндуктивной способности коллаген-фибронектиновых гелей с BMP-2 при подкожной, внутримышечной и внутрикостной имплантации проводили на 30 животных по 10 в каждой группе.

Биоэтика. Эксперимент соответствовал рекомендациям локального биоэтического комитета, при его постановке руководствовались «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» в соответствии с приказами МЗ СССР № 755 от 12.08.77 и № 701 от 24.07.78 и «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» от 2003 г.

Наркотизация. Для наркотизации лабораторных животных использовали внутрибрюшинное введение Золетила («Virbac», Франция) и Ксилазина (Interchemie Werken «de Adelaar» BV, Нидерланды) в дозировке 30 и 5 мг/кг соответственно.

Подкожная имплантация. Крысам сбривали шерсть в области холки, проводили антисептическую обработку, в стерильных условиях выполняли продольный разрез кожи и имплантировали исследуемые материалы в сформированные тупым путем подкожные карманы. После рану ушивали узловыми швами.

Внутримышечная имплантация. Крысам сбривали шерсть в области задней поверхности бедра, проводили антисептическую обработку, в стерильных условиях выполняли продольный разрез кожи. Далее тупым способом между головками трехглавой мышцы формировали карман, куда помещали исследуемые материалы. После рану послойно ушивали.

Внутрикостная имплантация в область критического дефекта теменных костей. Крысам сбривали шерсть в проекции теменных костей и производили поперечный и вертикальный латерально-смещенный разрез кожи головы с формированием треугольного лоскута. Последовательно тупым и острым путем обнажали теменные кости. В области сагиттального шва, избегая перфорации сагиттального венозного синуса, формировали круглое отверстие диаметром 5,5 мм и высотой 1,5 мм с помощью трепана С-reamer из набора Neobiotech SLA (Корея). В сформированный костный дефект укладывали материал. Рану послойно ушивали.

Послеоперационный период. В послеоперационном периоде проводилось ежедневное наблюдение за состоянием крыс. Для предотвращения возникновения послеоперационных осложнений в раннем послеоперационном периоде животным вводили антибиотик Байтрил («Bayer Animal Health GmbH», Германия) в дозировке 15 мкг/кг. На следующий день после операции крысам однократно вводили анальгетический препарат Кетопрофен («Биоветпром», Белоруссия) в дозировке 5 мг/кг.

Выведение животных. Животные были выведены из эксперимента путем передозировки Золетила на 28-е сутки с целью выявления очагов первичного неоостеогенеза и следов воспалительных реакций. При плановой эвтаназии экспериментальных животных был произведен забор тканей области имплантации исследуемых материалов для последующего гистологического исследования.

Гистологическое исследование и морфометрия

Материал фиксировали 10% раствором нейтрального формалина не менее 1 сут, обезвоживали в градиенте спиртов и ксилола и заключали в парафин. Далее изготавливали срезы толщиной 5—10 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и по Массону с анилиновым синим («Биовитрум», Россия). Окраска по Массону позволяла окрасить в синий цвет волокна коллагена и в темно-синий новообразованную костную ткань. Окрашивание по Коссу («Биовитрум», Россия) использовали на недекальцинированных срезах, что позволяло выявить очаги новообразованного минерализованного костного матрикса. Иммуногистохимическая окраска на маркер ранней остеогенной дифференцировки — Runx2 — и поздней — остеокальцин (OC) — использовалась для подтверждения остеоиндуктивных свойств rhBMP-2. Срезы изучали на световом микроскопе Axioimager M.1 («Carl Zeiss», Германия). Морфометрию костной ткани выполняли с учетом общепринятых рекомендаций [16, 17]. Для этого площадь новообразованной костной ткани на серийных гистологических срезах была измерена относительно общей площади всего материала (Nb.Ar. %).

Статистическая обработка

Построение графиков и статистическую обработку результатов выполняли в программе GraphPad Prism 7.00 (США). Межгрупповые различия определяли с помощью теста Холма—Шидака при сравнении трех и более групп и t-теста Стьюдента при сравнении двух групп. Статистически значимыми считали различия при вероятности ошибки отклонения от нулевой гипотезы или уровне статистической значимости ниже 5% (p<0,05). При построении столбчатых диаграмм изображали арифметическое среднее и стандартное отклонение. Значения, отличавшиеся от контрольных, помечали знаком «*» в соответствии с рекомендациями Американской ассоциации физиологов (APA).

Результаты

Цитотоксичность и клеточная адгезия

Материал на основе высокоочищенного гидрогеля коллагена показал высокую биосовместимость in vitro при исследовании на клеточных культурах. Так, МТТ-тест не выявил статистически значимых изменений в относительной жизнеспособности ММСК из жировой ткани после 1, 4, 7-х суток инкубации в присутствии гидрогеля на основе высокоочищенного коллагена и фибронектина (рис. 1).

На всех сроках наблюдения во всех повторах исследуемый высокоочищенный коллагеновый гидрогель способствовал клеточной адгезии (рис. 2).

Выбор эффективной дозировки BMP-2 на клеточных культурах in vitro и на модели эктопического остеогенеза in vivo

Наибольшей экспрессии всех исследуемых маркеров остеогенной дифференцировки удалось достичь на 7-е сутки при использовании rhBMP-2 в концентрации 10 мкг/мл (рис. 3).

Окрашивание ализариновым красным клеточных культур к концу 14-х суток эксперимента также выявило наибольшее скопление минерализованного матрикса в группе, где использовали rhBMP-2 в концентрации 10 мкг/мл (рис. 4).

При подкожной имплантации различных дозировок rhBMP-2, импрегнированных в желатиновую губку Spongostan (P & G, США), была показана его способность индуцировать остеогенез в концентрации 10 мкг/мл, в то время как использование меньших концентраций 1, 3 и 6 мкг/мл не приводило к образованию новой костной ткани. На гистологических срезах в местах имплантации желатиновых губок, насыщенных rhBMP-2 в концентрации 10 мкг/мл, определялись участки новообразованной минерализованной костной ткани (рис. 5).

Поскольку для некроптатов с участками подкожной имплантации не проводили декальцинацию, то на гистопрепарате можно видеть «выкрашивания» твердых минерализованных зон. Иммуногистохимическая (ИГХ) окраска на маркеры ранней (Runx2) и поздней остеогенной дифференцировки (остеокальцин — OC) подтверждала наличие остеобластов в зоне минерализованного матрикса, а окраска по ван Коссу недекальцинированных парафиновых срезов выявляла минерализованный матрикс костной ткани (рис. 6).

Таким образом, по данным эксперимента in vitro и in vivo была установлена наиболее эффективная концентрация rhBMP-2, которая составила 10 мкг/мл.

Способность материала индуцировать неоостеогенез in vivo

При подкожной имплантации коллаген-фибронектиновых гидрогелей, содержащих rhBMP-2, на 28-е сутки эксперимента была показана способность стимулировать образование костной ткани. Так, на гистологических срезах по периферии материала наблюдалось врастание кровеносных микрососудов. Сосуды сопровождались участками первичного остеогенеза, а именно, минерализованным матриксом новообразованной костной ткани, который выглядел темно-фиолетовым при окраске гематоксилином и эозином и темно-синим при окраске по Массону с анилиновым синим (рис. 7).

При внутримышечной имплантации исследуемого материала также была показана способность стимулировать образование костной ткани. Однако в отличие от подкожной имплантации очаги неоостеогенеза были существенно более крупными. В отдельных случаях наблюдалось формирование молодых остеонов (рис. 8).

Следов воспалительных реакций в виде скопления лейкоцитов и лимфоцитов на микропрепаратах выявлено не было. Только в отдельных случаях наблюдались единичные лейкоциты на 7-е сутки эксперимента, присутствие которых было обусловлено интраоперационной травмой при имплантации материалов.

При внутрикостной имплантации в области критических дефектов теменных костей крыс после имплантации материалов наблюдали скопление новообразованной костной ткани, окружающей имплантированный коллагеновый материал. Следов значимой лейкоцитарной и лимфоцитарной инфильтрации выявлено не было. Только на отдельных препаратах в редких полях зрения были выявлены единичные плазматические клетки и лимфоциты, выходящие из полнокровных сосудов (рис. 9).

При морфометрическом анализе серийных гистологических срезов наблюдалось статистически значимое различие в относительной объемной площади новообразованной костной ткани между внутримышечной и подкожной имплантацией. Основа проектируемого материала в виде коллаген-фибронектинового гидрогеля, содержащего rhBMP-2, была способна индуцировать выраженный остеогенез у крыс, спустя 28 сут замещаясь новообразованной костной тканью на 8±4% своего объема при подкожной имплантации в области холки, на 17±10% — при внутримышечной имплантации в трехглавую мышцу бедра и 26±11% — при внутрикостной имплантации в область критического дефекта теменных костей (рис. 10).

Обсуждение

Данные других исследований относительно дозы rhBMP-2, необходимой для образования костной ткани при орто- и эктопической имплантации, разнятся. На сегодняшний день FDA разрешено применение BMP-2 в концентрации 1,5 мг/мл в составе препарата Infuse Bone Graft («Medtronic», США) [18]. Однако такая концентрация является супрафизиологической, что может приводить к формированию костной ткани с неправильной кистозной структурой, а также вызывать гиперостоз [19]. Эффективность rhBMP-2, синтезированного в прокариотической клетке (E. coli) или в эукариотической (СНО), может отличаться. Так, традиционно считается, что прокариотическая клетка не способна обеспечить надлежащий постпроцессинг белка, что должно снижать активность синтезированного таким образом BMP-2 [20]. В нашем эксперименте при использовании конструкции, подражающей Infuse Bone Graft, где также в качестве носителя для остеоиндуктора была выбрана биорезорбируемая губка и использовался rhBMP-2 прокариотического происхождения в концентрации 10 мкг/мл, было отмечен орто- и эктопический неоостеогенез у крыс. Используемая нами дозировка 10 мкг/мл, предположительно менее эффективного прокариотического rhBMP-2, была на порядки меньше, чем в Infuse Bone Graft. Однако нами также было показано, что она является минимально эффективной для запуска остеогенной дифференцировки человеческих ММСК из подкожного липоаспирата in vitro. Полученные данные об эффективности малых доз rhBMP-2 соотносятся с результатами других исследований последних лет, что, вероятно, требует пересмотра выбора концентрации BMP-2 для применения в костно-пластических материалах [21, 22].

Одним из способов, предотвращающих избыточную стимуляцию неоостеогенеза, является использование материалов, способных поддерживать концентрацию rhBMP-2 в течение длительного времени. В нашем предыдущем исследовании in vitro была показана возможность коллаген-фибронектинового гидрогеля пролонгированно высвобождать rhBMP-2 c пиком от 4 до 6 сут, т. е. к окончанию фазы послеоперационного воспаления [12]. В настоящем эксперименте высокая эффективность этой же композиции была подтверждена in vivo. Так, несмотря на то что одномоментная концентрация rhBMP-2, высвободившаяся из коллаген-фибронектинового гидрогеля, не могла превышать 47±12% от количества импрегнированного белка, материал показал способность эффективно индуцировать неоостеогенез, сопоставимый с аутогенной костной стружкой [23].

Коллаген и фибронектин являются белками внеклеточного матрикса и обладают высоким сродством к белкам организма, также они могут выступать в качестве адгезионных молекул [24]. Так, при покрытии данными полимерами поверхностей различных материалов в других исследованиях наблюдались увеличение количества прикрепленных клеток и их активная пролиферация [25, 26]. В нашем исследовании также было отмечено отсутствие цитотоксического воздействия материала и показаны способность к адгезии клеточных культур на поверхности материала с их дальнейшей пролиферацией in vitro и отсутствие воспалительной реакции после имплантации in vivo.

Заключение

Таким образом, исследование свойств коллаген-фибронектинового гидрогеля показало, что данный материал обладает высокой биологической совместимостью и выраженным остеогенным потенциалом, достигнутым благодаря импрегнации rhBMP-2 в концентрации 10 мкг/мл. Оптимальное сочетание биосовместимых и остеогенных свойств позволяет рассматривать данный материал в качестве перспективной основы для создания костно-пластических препаратов нового поколения.

Работа выполнена на средства государственного задания для ФГБНУ «МГНЦ».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Сведения об авторах

Васильев А.В. — https://orcid.org/0000-0002-7169-2724

Кузнецова В.С. — https://orcid.org/0000-0001-8643-1642

Галицына Е.В. — https://orcid.org/0000-0003-0812-123X

Бухарова Т.Б. — https://orcid.org/0000-0003-0481-256X

Осидак Е.О. — https://orcid.org/0000-0001-5289-8316

Фатхудинова Н.Л. — https://orcid.org/0000-0001-9370-3386

Леонов Г.Е. — https://orcid.org/0000-0002-5632-7040

Бабиченко И.И. — https://orcid.org/0000-0001-5512-6813

Домогатский С.П. — https://orcid.org/0000-0002-6527-2440

Гольдштейн Д.В. — https://orcid.org/0000-0003-2438-1605

Кулаков А.А. — https://orcid.org/0000-0001-7214-2129

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Васильев А.В., Кузнецова В.С., Галицына Е.В., Бухарова Т.Б., Осидак Е.О., Фатхудинова Н.Л., Леонов Г.Е., Бабиченко И.И., Домогатский С.П., Гольдштейн Д.В., Кулаков А.А. Биосовместимость и остеогенные свойства коллаген-фибронектинового гидрогеля, импрегнированного BMP-2. Стоматология. 2019;98(6 вып. 2):5-11. https://doi.org/10.17116/stomat2019980625

Автор, ответственный за переписку: Васильев Андрей Вячеславович — e-mail: vav-stom@yandex.ru