Введение
Дефекты костно-суставных тканей, вызванные травмами, остеонекрозом, остеопорозом, артритом, опухолями и другими заболеваниями, поражающими опорно-двигательный аппарат, вызывают у пациентов сильную боль, нарушения двигательных функций, депрессию и длительную нетрудоспособность [1, 2]. В связи с этим таким пациентам крайне необходима эффективная тактика лечения, способствующая восстановлению костных и суставных тканей. Переменные магнитные поля (ПеМП) в течение последних 30 лет используются в качестве эффективного метода для восстановления костно-суставных тканей вследствие их неинвазивности, безопасности, отсутствия побочных эффектов, удобства. ПеМП позволяют простимулировать механизмы восстановления тканей при некоторых рефрактерных заболеваниях костей, таких как длительное несращение костей, переломы [3—5], остеопороз [6, 7] и остеонекроз головки бедренной кости [8, 9].
Цель настоящей статьи — проанализировать патофизиологические механизмы действия ПеПМ в лечении костно-суставной патологии.
Использование ПеМП для лечения костно-суставной патологии
В 1978 г. C. Bassett впервые применил неинвазивную методику использования ПеМП для лечения отсроченного сращения или несращения переломов и добился хорошего клинического эффекта [10]. Вскоре после этого воздействие ПеМП было одобрено Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США в качестве безопасного и эффективного метода лечения отсроченного сращения или несращения переломов [11, 12]. Электромагнитная индукция — основание для применения ПеМП [13]. Устройство содержит проволочную катушку, по которой проходит ток и в которой генерируется ПеМП. ПеМП, в свою очередь, индуцирует изменяющееся во времени вторичное электрическое поле внутри костной или суставной ткани. Вторичное электрическое поле зависит от характеристик приложенного ПеМП и свойств ткани. Магнитные поля в диапазоне 0,1—20 Гц обычно применяются для создания электрических полей от 1 до 100 мВ/см в кости [14]. Через устройство, генерирующее ПеМП, создается изменяющееся во времени электрическое поле для имитации нормальной реакции костных или хрящевых клеток на приложенное механическое напряжение [15], а последующий усиленный рост и биоэффекты ремоделирования костной ткани инициируются изменяющимся во времени электрическим полем.
Основные сигнальные пути
В последнее время был достигнут значительный прогресс в изучении лежащих в основе клеточных и субклеточных механизмов эффектов действия ПеМП при восстановлении костной и суставной ткани. При этом были выявлены несколько ключевых сигнальных путей, запускаемых действием ПеМП на молекулярном, субклеточном и клеточном уровнях (таблица).
Сигнальные пути, активирующиеся под действием ПеМП и запускающие компенсаторно-восстановительные процессы в костной и суставной ткани (по данным доказательных исследований 2011—2021 гг.)
| Сигнальный путь Signaling pathway | Роль стимуляции ПеМП Role of AEMF stimulation | Кол-во источников Number of sources |
| Ca2+ | Активирует Activates | 31 |
| Wnt/β-катенин | Активирует Activates | 17 |
| MAPK | Активирует Activates | 12 |
| FGF | Активирует Activates | 7 |
| VEGF | Активирует Activates | 9 |
| TGF/BMP | Активирует Activates | 5 |
| IGF | 6 | |
| JAK-STAT | Активирует Activates | 9 |
| cAMP/PKA | Активирует Activates | 5 |
Разберем роли некоторых из этих путей, в том числе кальциевый путь (Са2+), Wnt/β-катенин, митоген-активированную протеинкиназу (mitogen-activated protein kinase — MAPK), фактор роста фибробластов (FGF) и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), трансформирующий фактор роста (TGF)/β-костные морфогенетические белки (BMP), инсулиноподобный фактор роста (IGF), Notch и цАМФ/протеинкиназу A (cAMP/PKA), при восстановлении кости, индуцированном ПеМП.
Кальциевый сигнальный путь
Наиболее изученным механизмом реализации эффектов магнитных полей в клетке является Ca2+ [2]. Поскольку кальций попадает в клетку входящим током, существуют многочисленные механизмы поддержания низкой концентрации Ca2+ в цитозоле эукариотических клеток. Ключевыми являются ряд кальциевых АТФаз, выполняющих функции насосов (основные регуляторы уровня кальция в клетке). Весьма значимым является инообменный механизм Берлингера, который на 3 иона натрия обменивает 1 ион кальция. В мышечной ткани функции депо кальция выполняют саркопламатический ретикулум, молекулы тропонина и тропомиозина. В нервно-мышечных синапсах большое значение для регуляции обмена кальция имеют рианодиновые рецепторы.
Образование лиганд-рецепторного комплекса при участии регуляторного G-белка активирует мембранную фосфолипазу С, вызывающую гидролиз фосфолипидов мембраны с образованием двух вторичных посредников: инозитол-3-фосфата и диацилглицерола (рис. 1). Инозитол-3-фосфат ведет к выходу Ca2+ из внутриклеточных депо. Диацилглицерол повышает сродство протеинкиназы С к Ca2+, способствуя ее активации, что также увеличивает концентрацию внутриклеточного кальция [16]. Основной мишенью внутриклеточного действия кальция является рецепторный кальмодулиновый комплекс (рис. 2), который регулирует метаболизм ключевых вторичных посредников: циклических нуклеотидов, фосфодиэстеразы, аденилатциклазы, NO-синтазы; фосфорилирование протеинкиназ, дефосфорилирование фосфатаз; активный транспорт Ca2+ посредством кальциевых АТФаз плазматических мембран; функционирование цитоскелета, микротрубочек, микрофиламентов [17].
Рис. 1. Опосредование сигнала системой фосфолипаза С — инозитол-3-фосфат [16].
Рис. 2. Комплекс Ca2+-кальмодулин [17].
Результаты ряда исследований показали, что сигнал ПеМП проходит через клеточную мембрану, создавая изменяющееся во времени электрическое поле внутри цитозоля. Это электрическое поле впоследствии индуцирует высвобождение внутриклеточного Ca2+, что приводит к увеличению цитозольного кальция и росту концентрации активированного кальмодулина и повышению жизнеспособности клеток костной и суставной тканей [18, 19].
Потенциалзависимые кальцевые каналы (VGCC), особенно типа L, играют ключевую роль во внутриклеточном высвобождении кальция [20]. Воздействие ПеМП значительно повышает уровни экспрессии VGCC в пуле стволовых клеток во время остеогенеза [21, 22]. Инициируемая ПеМП передача сигналов Ca2+ заметно ускоряет остеогенную дифференцировку стволовых клеток, что представлено активированными остеогенными маркерами, такими как коллаген I и щелочная фосфатаза, и повышенным накоплением в костной ткани внеклеточного кальция [23]. Результаты исследований показали, что увеличение внутриклеточного Ca2+, обусловленное ПеМП-стимуляцией, приводит к увеличению уровня оксида азота, что, в свою очередь, увеличивает интенсивность синтеза цГМФ и последующую активацию протеинкиназы G. Посредством активации пути Ca2+/оксид азота/цГМФ/протеинкиназа G ПеМП способствуют дифференцировке и созреванию остеобластов, обусловливают их терапевтическое действие на восстановление костной и суставной тканей и значительное уменьшение боли у пациентов за счет модуляции высвобождения воспалительных цитокинов, таких как интерлейкин-1β (IL-1β) [21, 24, 25]. Более того, активированный каскад Ca2+/оксид азота/цГМФ также тесно связан с повышенной экспрессией FGF-2 и VEGF, двух ключевых регуляторов ангиогенеза [26]. Также сообщалось о перекрестных эффектах между Ca2+, ERK, ПВА и сигнализации PKG в условиях ПеМП-стимуляции [19, 27]. Все эти находки показывают заметную роль передачи сигналов Ca2+ в индуцированном ПеМП восстановлении костной и суставной тканей.
Путь передачи сигналов Wnt/β-катенин
Достаточно много исследований посвящено изучению механизмов влияния ПеМП на функции клетки через Wnt-зависимый сигнальный каскад (рис. 3, слева) [28]. Этот сигнальный каскад в качестве основного внутриклеточного механизма имеет AXIN-зависимый комплекс сигнальных белков [29], организованный белком аксином, у которого имеется несколько доменов, в том числе белок APC (мутирован в 90% всех случаев рака кишечника и молочной железы). Функция этого комплекса состоит в последовательном связывании и фосфорилировании белка β-катенин. Это приводит к протеосомной деградации β-катенина. Таким образом, когда сигнала нет, внутри клетки концентрация β-катенина равна нулю. Ситуация меняется, когда приходит Wnt-сигнал, который представляет собой довольно крупный липогликопротеин, он связывается с белком семейства Frizzeld [30, 31]. Посредством белка Dish аксинзависимый комплекс перестраивается; β-катенин больше не деградирует, накапливается, поступает в ядро и запускает транскрипцию ряда генов-мишеней (рис. 3, справа).
Рис. 3. Влияние ПеМП на функционирование сигнальной системы Wnt/β-катенин [28].
Многие данные свидетельствуют о том, что сигнальный путь Wnt/β-катенин действует как ключевой регулятор в индуцированной ПеМП остеогенной дифференцировке мезенхимальных клеток-предшественников, в формировании и восстановлении костной и хрящевой ткани. Например, по данным исследования in vitro, экспрессия генов и белков канонического пути передачи сигналов Wnt/β-катенин, включая Wnti, LRP6 и β-катенин, были значительно усилены после воздействия ПеМП как на стадии пролиферации, так и на стадии дифференцировки остеобластоподобных клеток MC3T3-E1 [32]. Кроме того, за исключением усиления экспрессии мРНК Wnti, Wnt3a, LRP5 и β-катенина в тканевых мезенхимальных стволовых клетках (ADSC), действие ПеМП может снижать экспрессию Dickkopfi (DKK1), который обычно действует как ингибитор пути передачи сигналов Wnt.
Усиленная передача сигналов Wnt/β-катенин, индуцированная ПеМП, заметно повышала экспрессию связанных с фазой пролиферации генов-мишеней Ccnd 1 и Ccne 1 и генов, связанных с фазой дифференцировки, — ALP, OCN, COL1 и Runx2, в клетках остеобластов, которые ускоряли пролиферацию, дифференцировку и минерализацию остеобластов, три основных процесса формирования кости [32]. С другой стороны, согласно исследованиям in vivo, ПеМП эффективно восстанавливали потерю костной массы и ухудшение костной микроархитектуры, что было выявлено с помощью микрокомпьютерной томографии, и повышали биомеханическую прочность, оцениваемую с помощью теста на трехточечный изгиб у крыс с подвешенными задними конечностями и овариэктомического теста через Wnt/Lrp5/β-катенин-сигнальный путь [33, 34], что указывает на то, что активация этого пути воздействием ПеМП полезна при заболеваниях костной и суставной тканей.
Путь MAPK
Сигнальный путь MAPK имеет тирозинкиназный рецептор, лигандами которых выступают многочисленные ростовые факторы (рис. 4) [17]. После этого рецептор из мономера превращается в димер с киназной функцией и начинает фосфорилировать целый каскад белков-посредников. Среди них можно выделить ключевые — малый g-белок RAS, мутированный во множестве форм рака, а также SOS. RAS активирует MAP-киназный комплекс — 3 киназы: raf, MEK и MAPK. Активированная MAP-киназа запускает ряд мишеней, которые, в свою очередь, запускают транскрипцию генов [35].
Рис. 4. Влияние ПеМП на митоген-активируемый протеинкиназный путь [17].
Обычные MAPK включают Erk1/2, JNK и p38. Путь MAPK играет решающую роль в индуцированной ПеМП остеогенной дифференцировке, а также в жизнеспособности и функции остеобластов. Например, обработка чрезвычайно низкочастотным импульсным электромагнитным полем (ELF-PEMF) может значительно увеличить общее содержание белка, митохондриальную активность и активность ALP и усилить образование минерализованного матрикса остеобластов человека с плохой начальной функцией остеобластов за счет запуска ERK1/2-сигнального пути. В случае, когда клетки обрабатывали U0126, ингибитора сигнального каскада ERK1/2, положительные эффекты воздействия ПеМП на функцию остеобластов исчезали [36]. Другие исследования также показали, что сигнальный путь MEK/ERK регулирует стимулирующие эффекты ПеМП на пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (BMSC), экспрессию остеогенных генов (RUNX2, BSP, OPN), активность ALP и отложение кальция в костной ткани [20, 28, 37, 38]. Кроме того, авторы одного исследования сообщали, что путь p38-MAPK участвует в повышенном синтезе коллагена в остеобластоподобных клетках, стимулированных воздействием ELF-PEMF [39]. Недавнее исследование показало, что частота 45 Гц ПеМП способствовала остеогенной дифференцировке стволовых клеток, полученных из жировой ткани, тогда как воздействие ПеМП частотой 7,5 Гц напрямую увеличивало экспрессию остеокластогенных маркеров и регулирование дифференцировки остеокластов посредством активации ERK и p38-MAPK [40]. Это открытие показало, что ПеМП могут одновременно влиять на активность остеобластов и остеокластов при определенных электромагнитных условиях.
Пути FGF и VEGF
Ряд исследований показал, что ПеМП оказывают стимулирующее воздействие не только при остеогенезе, хондрогенезе, но и в ангиогенезе [41—44]. ПеМП могут способствовать восстановлению костей, усиливая взаимодействие между остеогенезом и ростом кровеносных сосудов. Во время этого сложного процесса FGF и VEGF — два ключевых цитокина, связанных с ангиогенезом, — могут играть критически важную регуляторную роль. Было продемонстрировано, что сигнальный путь FGF участвует в регуляции пролиферации и дифференцировки остеобластов и в ангиогенезе [45], а также сообщалось, что сигнальный путь VEGF участвует во взаимных, функциональных и регуляторных отношениях между остеобластами и эндотелиальными клетками во время остеогенеза [46—48]. В исследовании налюдалось увеличение на 150% мРНК FGF-2 и 5-кратное увеличение белков FGF-2 в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC), подвергнутых воздействию ПеМП. При этом авторы специально контролировали высвобождение функционального FGF-2 из стимулированных ПеМП HUVEC, при этом отмечалось усиление пролиферации эндотелиальных клеток и тубулизации — процессов, которые важны для образования сосудов [49]. KDR/Flk-1, рецептор тирозинкиназы VEGF, аутофосфорилируется в ответ на стимуляцию VEGF и способен передавать сигналы VEGF. Одно исследование показало, что стимуляция ПеМП значительно увеличивает экспрессию и уровни фосфорилирования KDR/Flk-1 и способствует пролиферации, миграции и образованию трубок HUVEC [50]. Эффект проангиогенеза через сигнальные пути FGF и VEGF предоставляет новое, ангиотрофическое объяснение терапевтического действия ПеМП в восстановлении костной и хрящевой тканей.
Путь TGF-β/BMP
TGF-β и BMP как многофункциональные факторы роста принадлежат к суперсемейству TGF-β. Взаимодействие TGF-β/BMP со специфическими для TGF-β рецепторами типа 1 и типа 2 или серин/треонинкиназных рецепторов BMP инициирует сигнальный каскад через канонические (или Smad-зависимые пути) и неканонические пути (или независимые от Smad сигнальные пути) (рис. 5) [17].
Рис. 5. Участие пути TGF-β/BMP в реализации эффектов ПеМП [17].
Путь передачи сигналов TGF-β/BMP играет важную регулирующую роль в восстановлении костной и суставной тканей [51—56], подтверждено, что он участвует в индуцированном ПеМП остео- и хондрогенезе. Рядом исследований было продемонстрировано, что стимуляция ПеМП может значительно увеличить экспрессию TGF-β как в остеобластоподобных клетках, так и в клетках из атрофических или гипертрофических несоюзных групп [57—60]. Более того, недавние исследования показали, что ПеМП активируют передачу сигналов TGF-β через Smad2 в дифференцированных и минерализующихся остеобластах и увеличивают экспрессию генов-маркеров дифференцировки остеобластов, таких как ALP и коллаген I типа, а также усиливают их функцию восстановления костной и суставной тканей [61]. Более того, другое недавнее исследование показало, что ПеМП стимулируют остеогенную дифференцировку и созревание остеобластов с помощью первичной опосредованной экспрессией BMPRII, одного из рецепторов BMP, и последующей активацией передачи сигналов BMP-Smad1/5/8 [62, 63]. Результаты ряда недавних исследований показали, что комбинированная стимуляция BMP и ПеМП может увеличивать образование костной и суставной тканей в большей степени, чем лечение любым из стимулов [64—67].
Другие пути
Важным типом сигнальных рецепторов, которые активно изучаются в связи с действием электромагнитных полей, являются цитокиновые рецепторы. Цитокиновые рецепторы также представляют собой димерные молекулы, но в отличие от тирозинкиназ эти рецепторы лишены киназной активности. Киназная активность обеспечивается киназами JAK. Димеризация рецептора вызывает посадку JAK-киназ, которая, в свою очередь, активирует другой ключевой передатчик сигнала — STAT [68]. Фосфорилированный STAT переносится в ядро и опять запускает транскрипцию (рис. 6) [17].
Рис. 6. Цитокиновый сигнальный путь [17].
Путь передачи сигналов IGF также является важным сигнальным путем, участвующим в дифференцировке остеобластов и формировании костей [68, 69]. Отмечается, что ПеМП значительно увеличивают уровень экспрессии мРНК IGF-1 и способствуют образованию костной ткани в бедренных тканях крыс in vitro [70]. Кроме того, IGF-1 в сочетании с ПеМП усиливали анаболическую активность эксплантата хряща, увеличивали синтез простагландинов, ограничивали катаболический эффект IL-1β и демонстрировали синергетический хондропротективный эффект на суставной хрящ человека [71]. Другое исследование показало, что дексаметазон в сочетании с ПеМП усиливает экспрессию мРНК IGF-1 и улучшает вызванную дексаметазоном потерю костной массы и остеопороз [72].
Сравнительно недавно проведенное исследование выявило, что уровни экспрессии рецептора Notch (Notch4) и его лиганда DLL4, а также ядерных генов-мишеней (Hey1, Hes1 и Hes5) усиливаются во время индуцированной ПеМП остогенной дифференцировки hMSC. Более того, ингибиторы пути Notch эффективно снижают экспрессию остеогенных маркеров, включая Runx2, Dlx5, Osterix, а также Hes1 и Hes5, что указывает на то, что передача сигналов Notch играет важную регуляторную роль в индуцированной ПеМП остеогенной дифференцировке hMSC [73].
Заключение
В последние десятилетия стимуляция переменными электромагнитными полями привлекает большое внимание как перспективная, неинвазивная и безопасная физическая стратегия для ускорения восстановления костной и суставной тканей. Физическая стимуляция ПеМП инициирует сигнальные каскады, которые эффективно способствуют остеогенезу, хондрогенезу и ангиогенезу, что в конечном итоге повышает способность костной и суставной тканей к самовосстановлению.
В настоящем обзоре показано участие разных ключевых молекулярных сигнальных путей в восстановлении костной и суставной тканей, индуцированном действием ПеМП. Акцент исследований сделан на молекулярные сигнальные пути, описанные выше, которые могут быть перспективной стратегией для дальнейшего повышения терапевтических эффектов стимуляции восстановления опорно-двигательного аппарата с помощью ПеМП за счет увеличения количества остеобластов и их созревания, а также увеличения пролиферации эндотелиальных клеток и тубулизации процессов, важных для остеогенеза и ангиогенеза. Например, низкомолекулярный ингибитор 603281-31-8 может нарушать активность GSK3b, который играет негативную регуляторную роль в пути передачи сигнала Wnt, и приводить к значительному увеличению костной массы [74, 75]. Подавление активности DKK1 или использование антисклеростиновых антител у мышей увеличивало костеобразование и массу костной ткани [76]. Комбинирование воздействия ПеМП с этими активаторами непрямого пути передачи сигналов, Wnt/β-катенин могут дополнительно активировать этот основной путь передачи сигналов и усилить биологический ответ костной ткани на стимуляцию ПеМП, что приведет к более эффективному восстановлению кости. Однако риск развития онкологических процессов, симптомов остеоартрита и остеофитов являются недостатками долгосрочной активации пути передачи сигналов Wnt/β-катенин. В дополнение к сигнальному пути Wnt, многие исследования показали, что комбинирование стимуляции ПеМП с BMP или IGFs может также увеличивать образование костной и суставной тканей [67, 72]. Несмотря на то что положительные эффекты стимуляции ПеМП на процессы восстановления костных и суставных тканей клинически доказаны, в разных исследованиях эффективность магнитотерапии для одного и того же заболевания различается [6, 13]. Во многом это связано с отсутствием стандартизированной интенсивности, частоты, терапевтического курса и времени ПеМП. Таким образом, поскольку стимуляция ПеМП предлагает неинвазивные, эффективные, безопасные и удобные эффекты, она открывает новые возможности для восстановления костей. Однако еще предстоит проделать большую работу для расширения его клинического применения.
Выводы
1. Электрические магнитные поля обладают заметными возможностями ускорения пролиферации, остеогенной дифференцировки путем активации ряда сигнальных путей.
2. Конкретными точками приложения управления сигнальными каскадами со стороны магнитных полей следует назвать дополнительную поляризацию молекул лиганда, существенно усиливающую рецепторную активность каскада; повышенную амплификацию сигналов в каскадах за счет усиления киназной активности.
3. Предполагается механизм прямого активационного действия магнитных полей на внутриклеточные мессенджеры за счет изменения третичной структуры входящих в их состав сигнальных белков.
4. Молекулярные сигнальные пути, описанные выше, могут быть перспективной стратегией для дальнейшего повышения терапевтических эффектов стимуляции восстановления опорно-двигательного аппарата с помощью переменных магнитных полей.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.