Регенерация печени представляет собой компенсаторную гиперплазию, при которой в оставшейся ткани печени происходят процессы, направленные на восстановление метаболического баланса в органе [1]. В отличие от анатомической истинной регенерации увеличивающаяся печень не восстанавливает свою первоначальную анатомическую структуру [2]. Вопреки истинной регенерации в случаях резекции и при некоторых химических моделях поражения печени ее пул клеток возмещается путем репликации существующих гепатоцитов без активации так называемых клеток-предшественников. В других случаях, например при токсическом повреждении печени галактозамином, происходит активация и репликация клеток-предшественников [2].

Фазы и сроки регенерации печени

В механизме регенерации можно выделить 3 важные отличительные фазы: а) фазу инициации, которая заключается в сверхэкспрессии специфических генов для подготовки клеток печени к репликации; б) фазу пролиферации, в которой клетки печени проходят серию циклов клеточного деления; с) фазу завершения, когда ингибиторы пролиферации ее останавливают, т.е. действуют как тормоз регенеративного процесса, предотвращая чрезмерный рост ткани печени [3].

Антипролиферативные факторы при этом контролируют скорость пролиферации и определяют конечную точку регенерации печени. Кроме того, антипролиферативные факторы функционируют как «рулевое колесо», обеспечивая процесс регенерации в правильном направлении, предотвращая патологическое воспроизведение аномальных клеток, как это происходит при онкогенезе. Поэтому ингибиторы пролиферации так же важны для обеспечения безопасной и стабильной регенерации печени, как и факторы, способствующие пролиферации [4].

Эти процессы контролируются цитокинами, факторами роста и сигнальными путями [5]. Цитокины, в том числе трансформирующий фактор роста β и интерлейкин-1, гены-супрессоры опухолей, включая р53 и р21, являются важными членами семейства ингибиторов пролиферации при регенерации печени. В процессе экспрессии генов и модификации белка участвуют определенные антипролиферативные факторы. Подавление регенерации печени, вызванное метаболизмом, гормональной активностью и патологическими характеристиками, рассматривалось ранее [6]. Однако в отношении ингибиторов пролиферации регенерации печени известно меньше, необходимы дальнейшие исследования [4].

Продолжается изучение сроков происходящей регенерации. Так, в одних исследованиях на модели резекции печени показана ее зависимость от циркадных ритмов. При этом переход от G2 непосредственно к митозу происходил в одно и то же время суток. Однако синтез ДНК достигал максимума через 36 ч после хирургического вмешательства независимо от цикла света и темноты. Это свидетельствует о том, что переход от G2 к митозу контролируются циркадно-зависимыми генами, связанными с клеточным циклом. В отличие от митоза гепатоцитов, регулируемого циркадным ритмом, репликация ДНК не зависит от него. Проведенные исследования показали, что после резекции печени синтез ДНК у крыс достигал пика на 12—16 ч раньше, чем у мышей [7].

Модели регенерации печени

Исследования регенерации печени проводятся на различных моделях. Одной из наиболее часто используемых является изучение регенерации печени после ее резекции. Эта модель предложена Хиггинсоном в 1936 г. (резекция ²/₃ массы печени) [8]. При этом отмечено, что в течение 5—7 дней после удаления части печени оставшаяся часть восстановилась до размера эквивалентного исходной массе. Это наиболее удачная модель, так как оставшаяся часть печени интактна от повреждения.

В эксперименте применяют модель повреждения печени гепатотоксическими веществами, такими как четыреххлористый углерод (CCL-4). Данное повреждение вызывает некроз дольковых зон печени, что приводит к острому воспалительному ответу, в гистологической картине которого преобладают полиморфноядерные лейкоциты и макрофаги, проникающие в печень с целью удаления пораженных гепатоцитов [6].

Острое повреждение печени на животных вызывает и D-галактозамин, приводящий к внутриклеточному дефициту метаболитов уридина, а в дальнейшем к системному воспалению, нарушению регенерации и развитию острой печеночной недостаточности (ОПН) [9].

Интоксикация ацетаминофеном является частой причиной ОПН. Так, его передозировка вызывает дисбаланс в системе перекисного окисления липидов, в результате происходит токсическое накопление N-ацетилбензохинонимина, приводящее к образованию радикалов и активации клеток Купфера [10].

Системное проявление гепатотоксичности ацетаминофена регулируется провоспалительными цитокинами и врожденной иммунной системой. Так, у мышей с мутантным толл-подобным рецептором (TLR4) отмечена наибольшая выживаемость после передозировки ацетаминофена по сравнению с обычными дикими мышами. На данной модели показано, что выживаемость обычных мышей улучшилась как за счет истощения функции клеток Купфера, так и за счет предварительной обработки TLR4. Поэтому активность TLR4-клеток Купфера является основным фактором, способствующим системному воспалительному ответу ОПН [11]. Однако неизученной остается проблема, есть ли зависимость между улучшением выживаемости и результатом ускоренной регенерации печени при интоксикации ацетаминофеном.

Редкими моделями регенерации печени являются генетически модифицированные животные с врожденными нарушениями обмена веществ. Наиболее показательна иммунодефицитная модель мыши с недостатком гена фумарилацетоацета гидролазы (FAH). Печень этих мышей обладает повышенной способностью к увеличению зрелых гепатоцитов после ксеногенной трансплантации [12]. R. Hickey и соавт. разработали специальную FAH-среду для создания высококачественных человеческих гепатоцитов. Эта среда in vivo позволяет первичным гепатоцитам увеличиваться, подвергнуться воздействию сложных сигнальных систем, необходимых для регенерации печени, которые не могут быть достигнуты в условиях in vitro [13].

Предложена модель на генетически модифицированных мышах, предназначенная для ксенотрансплантации гепатоцитов. Она вызывает хроническое повреждение печени и замедляет регенерацию гепатоцитов. Модель хронического повреждения печени для животных любых видов, основанная на введении рекомбинантного аденовируса для экспрессии тимидинкиназы герпеса в гепатоцитах хозяина, повышает чувствительность к лечению ганцикловиром. Это вызывает длительное повреждение печени, что позволяет трансплантировать гепатоциты и образовывать регенеративные узелки в печени мышей-реципиентов [14].

Печень обладает способностью регенерировать после травмы с широким диапазоном вариабельности ответной реакции у разных людей. Существующие вычислительные модели регенерации печени в значительной степени основываются на данных экспериментальных животных, и, следовательно, неясно, насколько хорошо эти модели отражают динамику регенерации печени человека. B. Verma и соавт. предложили математическую модель для расчета объема резекции печени с учетом интраоперационных факторов, метаболической нагрузки, гибели клеток [15].

Интересным представляется исследование, проведенное на модели резекции печени у свиней для изучения процессов регенерации. Мониторинг за функциональным состоянием печени и происходящей в ней регенерацией проводили с помощью неинвазивного теста определения максимальной функциональной способности печени (LiMAx). Мониторинг теста LiMAx показал, что результаты нарушения функции печени коррелируют с биохимическими показателями (билирубин, АСТ, АЛТ, гамма-глутамилтранспептидаза, МНО). Катетер в воротной вене позволил осуществить мониторинг портального венозного давления. Как показали исследования, тест LiMAx может указывать на нарушение функции печени на 1 день раньше, чем обычные лабораторные параметры. Тест LiMAx подтвердил значительное снижение функции печени на 1—3-и сутки с нормализацией показателей через 1 нед после резекции [16].

Пути регуляции регенерации печени (цитокины, факторы роста, метаболические сети)

Цитокины

Непосредственно после выполнения частичной гепатэктомии транскрипционными факторами активируется более 100 различных генов, которые в интактной печени находятся в покое [17]. Интерлейкин-6 (IL-6) отвечает за активацию 40% этих генов [18]. Она приводит к ряду событий, включая синтез ДНК, репликацию клеток и увеличение размеров клеток в течение нескольких дней. Эти ранняя реакция генов позволяет печени поддерживать основные метаболические функции в процессе регенерации. Причем она происходит как в гепатоцитах, так и в непаренхиматозных клетках печени, а репликация гепатоцитов осуществляется в более ранние сроки, чем в клетках других типов.

Инициирование регенерации печени обусловлено состоянием иммунной системы, выработкой и высвобождением цитокинов. Среди них TNF, NFKB и IL-6 являются важными медиаторами, которые приводят к активации сигнального белка STAT3 в гепатоцитах. После резекции печени TNF связывается с рецептором TNF₁ на непаренхиматозных клетках печени, и в первую очередь на клетках Купфера. Это приводит к активации внутриклеточного сигнального пути и продукции IL-6 [19]. Этот цитокин действует на гепатоциты через рецептор IL-6, активируя в ответ сигнальный преобразователь и активатор STAT3, а также внеклеточные сигнальные киназы 1 и 2 (ERK 1 и 2 путей) [20, 21]. Многочисленные исследования доказали, что именно этот путь связан с началом регенерации печени. Дополнительное количество антител против TNF после гепатэктомии ингибирует продукцию IL-6 и репликацию ДНК в модели на крысах [22]. У мышей, ингибированных по IL-6, происходит задержка регенерации печени [23]. При этом пролиферация гепатоцитов и экспрессия генов могут быть скорректированы в этой модели с помощью одной предоперационной инъекции Il-6.

Особую роль в инициации цитокиназного каскада играет врожденный иммунитет. Так, липополисахарид (LPS), С3а и С5а, все компоненты врожденного иммунитета, связываются с их соответствующими рецепторами на клетках Купфера, вызывая регенерацию печени [24]. Доказано, что у крыс с ограниченной продукцией LPS регенерация печени задерживается. J. Campbell и соавт. исследовали иммуноопосредованные сигнальные пути, участвующие в инициации регенерации печени [25]. Они оценивали мышей, лишенных толл-подобного рецептора (TLR2), корецептора LPS Cd14 и Myd88 (адаптерный белок для семейства белков TLR). Ученые определили, что у мышей с деффектом Myd88 после резекции печени уровни мРНК, IL-6 и TNF снизились. Активация STAT3 и STAT3-чувствительных генов в гепатоцитах также блокировалась. Однако ни у одной из оперированных мышей не было задержки в репликации ДНК. При этом авторы пришли к выводу, что рецептор LPS, Cd14, TLR2 не играют существенной роли в регуляции продукции цитокинов или репликации ДНК, однако Myd88-зависимые пути участвуют в продукции TNF и IL-6 [26]. Что касается роли комплимента в инициации регенерации печени мышей с дефицитом С3а и С5а, то выявлены существенные дефекты регенерации после резекции печени [27]. При этом наблюдали снижение активации цитокинового пути, снижение уровней TNF и IL-6, а также уменьшение активности NF-B и STAT3. Отмечено, что IL-6 выполняет множество функций во время регенерации печени, в том числе участвует в реакции острой фазы, гепатопротекции и митогенной стимуляции [21].

Известно, что клетки Th22 регулируют иммунитет против патогенной инвазии, включая защиту от хронического гепатита В. В эксперименте на крысах исследована связь между лекарственно-индуцированным повреждением печени (DILI) и клетками Th22/Th17. При этом исследованы уровни периферических клеток Th22/Th17 и внутрипеченочная продукция IL-22/IL-17. Значительное увеличение клеток Th22 и связанных с ними уровней цитокинов наблюдалось при DILI с типом гепатоцеллюлярного повреждения. Выявлена положительная корреляция между уровнем внутрипеченочного IL-22 и регенерацией печени. При DILI обнаруживали увеличенные IL-22-секретирующие клетки, как периферические, так и внутрипеченочные. Th22 и связанные с ним цитокины могут быть гепатозащитными, что может дать новую перспективу для понимания иммунопатогенеза DILI. Плазменный IL-22 может быть надежным индикатором для оценки прогноза DILI и предоставлять новую терапевтическую мишень для лечения DILI [28].

Факторы роста

Гепатоциты проходят через клеточный цикл благодаря митогенным сигналам в виде контактов между клетками и различными соединениями, получивших название факторов роста. В печени эти факторы роста перекрывают точку рестрикции G1, позволяя гепатоцитам переходить в S-фазу.

Семейство лигандов рецептора эпидермального фактора роста (EGF) и фактора роста гепатоцитов (HGF) важны в процессе регенерации [29]. HGF продуцируется звездчатыми клетками и действует на гепатоциты паракринным и эндокринным способами.

Одни исследования показывают, что при повреждениях ткани печени pro-HGF (биологически неактивный белок-предшественник, состоящий из одной последовательности аминокислот) активируется во внеклеточном матриксе, превращаясь в биологически активную форму HGF. Передача сигналов HGF приводит к активации ERK1 [30]. Ранее было доказано, что клетки Купфера обладают стимулирующим влиянием на регенерацию ткани печени, усиливая синтез HGF. Кроме того, усиление синтеза HGF приводит к увеличению числа овальных клеток печени, способствующих дифференцировке гепатоцитов. Другие исследователи предполагают, что путь синтеза HGF имеет значение в гепатопротекции за счет активации сигнального пути, основным компонентом которого являются ферменты фосфоинозитид-3-киназа (PI3K) и киназы АКТ [31]. Этот путь отвечает за рост, апоптоз, пролиферацию клеток и метаболизм.

Семейство лигандов рецептора EGF включает EGF, TGFα, гепарин-связывающий EGF-подобный фактор роста (HBEGF) и амфирегулин (AR). У этих различных лигандов разные, но часто перекрещивающиеся функции. Так, EGF продуцируется железой Бруннера в двенадцатиперстной кишке [32]. TGFα вырабатывается гепатоцитами в ответ на пролиферацию клеток и функционирует аутокринно [33]. Повышение уровня TGFα приводит к пролиферации гепатоцитов [34]. Модели с угнетением TGFα показывают хорошую регенерацию печени после ее резекции. Все это подчеркивает роль перекрещивающихся лигандов [35].

На ранней стадии регенерации печени происходит экспрессия HBEGF. Модель угнетения HBEGF приводит к отсроченной регенерации печени с более ранней экспрессией TGFα как компенсаторного механизма [36].

В эксперименте исследовано влияние артериализации портальной крови на экспрессию TNFα, HGF и TGFβ₁ при регенерации печени. При этом доказано, что промоторные эффекты на артериализацию воротной вены на ранней стадии регенерации печени связаны с изменениями экспрессии TNFα, HGF и TGFβ₁ [37].

Вспомогательные митогены включают TNF, IL-6, норэпинефрин, инсулин, желчные кислоты, серотонин, лептин, эстрогены и FGF [38]. Модели с угнетением этих митогенов будут задерживать, но не останавливать регенерацию печени. Показано, что выделенный из тромбоцитов серотонин обеспечивает регенерацию печени. Экспрессия 5-HT2A и -2B серотониновых рецепторов увеличивается в печени после ее резекции. M. Lesurtel и соавт. в серии экспериментов на мышах показали, что тромбоцитопения приводит к неспособности вызывать пролиферацию гепатоцитов, а введение агониста серотонина у мышей с тромбоцитопенией приводит к нормальной пролиферации гепатоцитов, тогда как введение антагониста рецептора серотонина вызывает угнетение регенерации [39].

В литературе обсуждают проблему о роли селезенки в регенерации печени. В эксперименте было показано, что после спленэктомии происходит улучшение регенерации печени. В группе животных после резекции печени и спленэктомии отмечены прогрессивное увеличение числа ядерных антиген-положительных пролиферирующих клеток, что свидетельствовало о более высокой регенерации печени, и наименьшая ферментативная активность по сравнению с группой животных, которым выполнена резекция печени без спленэктомии. Спленэктомия после резекции печени приводила к увеличению сывороточных концентраций фактора роста (HGF) и к уменьшению уровня TGFβ₁ в воротной вене. Кроме того, в группе крыс, которым выполняли спленэктомию, зафиксировано снижение концентрации не только TGFβ₁, но и его рецептора TGFβ-RII, при этом происходила активация HGF и его рецептора c-Met в печени. Следовательно, удаление селезенки улучшает регенерацию печени [40].

Метаболические пути

После резекции отмечен большой метаболический сбой во время регенерации печени. При этом печень должна поддерживать энергетическую потребность, необходимую для репликации ДНК и деления клеток. Известно, что аминокислоты регулируют пролиферацию гепатоцитов посредством модуляции экспрессии циклина D1. Исследование на крысах показало, что введение аминокислот приводит к репликации гепатоцитов, тогда как ограничение белка ухудшает регенерацию [41].

Относительно новым видом регуляции экспрессии генов является микроРНК. G. Song и соавт. показали важность miRNA в регуляции пролиферации гепатоцитов во время регенерации печени [42]: у мышей с инактивацией гена при обработке miRNA наблюдалась задержка в прогрессии клеточного цикла от фазы G1 к S. Посмертное исследование печени этих мышей показало ингибирование miR-21, необходимое для синтеза ДНК в гепатоцитах после резекции печени. Большинство работ последних лет направлены изучение применения miRNA в клинической практике при заболеваниях печени [43, 44].

Изучение биологических функций длинного некодирующего РНК (lncRNA) показало, что метастаз, связанный с транскриптом 1 аденокарциномы легкого 1 (MALAT1) регулирует не только онкогенез при гепатоцеллюлярной карциноме, но и регенерацию печени. На модели ²/₃ частичной гепатэктомии у мышей исследовали функции lncRNA (MALAT1). Отмечено, что MALAT1 был активирован во время регенерации печени. Более того, он ускорял пролиферацию гепатоцитов, стимулируя продвижение клеточного цикла от G1 к S-фазе и ингибируя апоптоз in vitro. Исследования также показали, что MALAT1 регулируется p53 во время регенерации печени и что p53 может быть ключевым восходящим регулятором активности MALAT1. В целом результаты исследования свидетельствуют, что MALAT1 является индикатором регенерации печени. В связи с этим фармакологические вмешательства, направленные на MALAT1, могут оказаться терапевтически полезными при печеночной недостаточности или трансплантации печени, способствуя регенерации печени [45].

Особую роль в регенерации печени играет так называемый ген быстрого ответа роста (EGR-1), который быстро индуцируется в ответ на резекцию печени. Мышам, зараженным аденовирусом, который экспрессировал EGR-1, выполняли резекцию печени. Пролиферация клеток и пути передачи сигналов от геранилгеранилдифосфатсинтазы (GGPPS) к RAS/MAPK исследованы на модели регенерирующих клеток печени, дана оценка активности трансаминаз в сыворотке крови. Потеря функции EGR-1 значительно ингибировала восстановление печени и экспрессию циклина D1, циклина E и ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA). Кроме того, потеря функции EGR-1 усугубляет повреждение печени с повышением уровня АСТ и АЛТ в сыворотке. Это свидетельствует о том, что GGPPS, стимулированная EGR-1, играет жизненно важную роль в регенерации печени [46].

Учеными доказано, что прохождение через клеточный цикл зависит от передачи сигналов кальция. Так, EGF и HGF вызывают передачу сигналов через ось MAPK—ERK, что приводит к фосфорилированию и активации ряда факторов, способствующих делению клеток, включая гены MYC, FOS и JUN. Кальциевые сигналы являются важными медиаторами передачи сигналов EGF и HGF. Первые результаты получены в экспериментах на изолированных гепатоцитах крысы. При этом обнаружено кратковременное повышение уровня внутриклеточного кальция после воздействия EGF или HGF [47].

Транскриптомный анализ у мышей после резекции печени выявил эпигенетический регулятор UHRF1, который необходим для метилирования ДНК как динамически экспрессируемый во время регенерации печени. Удаление UHRF1 в гепатоцитах (Uhrf1HepKO) вызывало гипометилирование ДНК по всему геному, но, что удивительно, не оказывало заметного влияния на экспрессию генов, транспозонов или гомеостаз печени. Частичная гепатэктомия Uhrf1HepKO привела к ранней и устойчивой активации прорегенеративных генов и к усиленной регенерации печени [48].

Оценена роль цитохрома P450 (CYP) в регенерации печени. Для этого создали модель повреждения печени у мышей добавлением им в рацион 3,5-диэтоксикарбонил-1,4 дигидроколлидина (DDS). Затем выполняли 70% резекцию печени и анализировали паттерны экспрессии печеночных генов, измеренные во время регенерации. У мышей с DDS-индуцированным повреждением печени экспрессировались маркеры овальных клеток цитокератин 19 (СК 19) и молекула адгезии эпителиальных клеток (ЕрСАМ). Частичная гепатэктомия увеличивала экспрессию CYP2R1 и CYP2R2, а также онкомаркера альфа-феторотеина, что свидетельствовало об их значимости в дифференцировке овальных клеток в поврежденной печени в гепатобластоподобные клетки [49].

Среди исследователей продолжаются дискуссии о регуляторных механизмах регенерации печени. Так, например, не найден ответ на следующий вопрос: почему при остром повреждении временная активация звездчатых клеток печени и синусоидальных клеток способствует регенерации, тогда как их длительная активация вызывает при хроническом повреждении фиброз печени?

На модели повреждения печени четыреххлористым углеродом у мышей наблюдали, как поврежденные гепатоциты быстро экспрессировали семафорин 3E (Sema3e), который вызывал сокращение синусоидальных эндотелиальных клеток и тем самым способствовал активации звездчатых клеток печени и заживлению ран. Кроме того, эктопическая и последовательная экспрессия Sema3e в гепатоцитах методом гидродинамической инъекции в хвостовую вену привела к дезорганизованной регенерации синусоидов и устойчивой активации звездчатых клеток печени. Напротив, фиброз печени усиливался у мышей, поврежденных по Sema3e по сравнению с мышами дикого типа на модели хронического повреждения печени.

Таким образом, в последнее десятилетие произошли значительные успехи в понимании процесса регенерации печени. Созданы модели, позволяющие изучать механизмы, пути регенерации, а также факторы ее регуляции. Тем не менее остаются нерешенными вопросы, которые освещены в данном обзоре.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.