Resumo

Artigo

CONSTITUINTES QUÍMICOS ISOLADOS DE SIMIRA GLAZIOVII (K. SCHUM) STEYERM. E A ATRIBUIÇÃO DOS DESLOCAMENTOS QUÍMICOS DOS ÁTOMOS DE CARBONO E HIDROGÊNIO DO ALCALÓIDE OFIORINA E SEUS DERIVADOS

Ana Beatriz F. D' O. Bastos, Mário Geraldo de Carvalho* e Javier Rincón Velandia

Departamento de Química, Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 23851-970 Seropédica - RJ

Raimundo Braz-Filho

Setor de Química de Produtos Naturais, LCQUI, CCT, Universidade Estadual do Norte Fluminense, 28015-620 Campos - RJ

*e-mail: mgeraldo@ufrrj.br

Recebido em 18/12/00; aceito em 10/9/01

CHEMICAL CONSTITUENTS FROM SIMIRA GLAZIOVII (K. SCHUM) STEYERM. AND ¹H AND ¹³C NMR ASSIGNMENTS OF OPHIORINE AND ITS DERIVATIVES. Chromatographic fractionation of bark extracts from Simira glaziovii (Rubiaceae) afforded the steroids b-sitostenone, stigmastenone, b-sitosterol and stigmasterol, methyl trans-4-hidroxy-3-methoxycinamate (1), the alkaloids harmane (2) and the new stereoisomer of ophiorine B (3). The structures were established by ¹H and ¹³C NMR, including 2D techniques and mass spectral analysis, of the natural products and pentaacetyllyalosidic acid (4a) and b-carboline monoterpene tetraacetylglucoside (5, 1,22-lactamlyaloside) derivatives obtained by chemical transformations.

Keywords:Simira glaziovii; Rubiaceae; steroids; harmane; (-)-ophiorine.

INTRODUÇÃO

Plantas do gênero Simira vem despertando interesse devido principalmente às atividades fototóxicas apresentadas por alguns de seus constituintes químicos e pelas informações etnomédicas sobre o tratamento de manchas na cavidade oral e dentária¹ com cascas frescas de S. rubescens. A literatura registra resultados de estudos químicos das espécies S. Maxonii^2-4, S. mexicana⁵, S. Salvadorensis⁶ e S. rubra⁶. Foram identificados, além de policetídeos, alcalóides fotossenbilizantes furoquinolínicos e b-carbolínicos^5,6. Os alcalóides harmana, maxonina e estrictosamida aparecem como os mais comuns neste gênero⁷.

Este artigo descreve o primeiro estudo fitoquímico de um espécimen de S. glaziovii (K. Schum) Steyerm, que permitiu o isolamento e a caracterização dos esteróides b-sitostenone, estigmastenone, b-sitosterol and estigmasterol, 3,4-dimetoxicinamato de metila (1), o alcalóide harmana (2), conhecido como 1-metil-b-carbolina, aribina, loturina ou passiflorina, isolado anteriormente de Arariba rubra e Passiflora incarnata⁷, e o alcalóide ofiorina B (3), encontrado em Ophiorrhiza japonica e O. kuroiwai (Rubiaceae)⁸. Com exceção do alcalóide harmana, os demais constituintes estão sendo caracterizados pela primeira vez no gênero Simira.

O tratamento do alcalóide ofiorina (3), epímero no átomo de carbono C-16 da ofiorina A (3a), com diazometano (CH₂N₂) forneceu o produto rearranjado conhecido como lialosídeo (4). A preparação dos dois novos derivados da ofiorina B (4a e 5) e a análise dos dados espectrométricos de RMN ¹H e ¹³C (1D e 2D) permitiu caracterizar o alcalóide 3 e estabelecer a completa atribuição dos deslocamentos químicos dos átomos de hidrogênio e carbono, eliminando-se inclusive equívocos registrados na literatura.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O fracionamento cromatográfico do extrato metanólico das cascas de S. glaziovii forneceu além dos alcalóides harmana (2) e (-)-ofiorina (3), a mistura de b-sitosterol, estigmasterol e 3,4-dimetoxicinamato de metila (1). O alcalóde 3 apresentou dados espectrométricos semelhantes aos da (+)-ofiorina B já registrada na literatura⁸ e, levando em consideração de que se trata de um glicosideo natural, identificou-o como o novo estereoisômero deste alcalóide. Do extrato hexânico foi identificada a mistura de sitostenona e estigmastenona. Os derivados 4a e 5 estão sendo registrados pela primeira vez na literatura.

Os esteróides, o éster 1 e o alcalóide harmana (2) foram identificados através da análise dos dados fornecidos pelos espectros IV e RMN ¹H e ¹³C comparados com valores registrados na literatura^9-15.

O espectro de RMN ¹H de 3 mostrou sinais de seis hidrogênios aromáticos da unidade b-carbolínica. Picos transversais correspondentes às interações heteronucleares de átomos de carbono e hidrogênio observados nos espectros 2D HMQC (¹J_CH) e HMBC (^2,3J_CH)] permitiram identificar os sinais dos carbonos hidrogenados e quaternários desta unidade aromática (C₁₁H₆N₂), Tabela 1. Além disso, a análise dos espectros de RMN ¹H e ¹³C (1D e 2D) conduziu às seguintes deduções: a) A presença do grupo vinila foi reconhecida pelos sinais dos carbonos: metínico CH-18 [d_C 134,70 e d_H 5,76 (ddd, 6,4, 10,8 e 17,2 Hz)] e metilênico CH₂-19 [d_C 120,90 e d_H 5,25 (d, 10,8 Hz) e 5,27 (d, 17,2 Hz)]; b) A unidade de b-glicopiranosila foi proposta através dos sinais dos átomos de carbono oxigenados metínicos CH-1' [d_C 99,74 e d_H 4,34 (d, 8,8 Hz, H-1' em posição axial), carbono anomérico], CH-2' [d_C 73,15 e 2,90 (t, J=8,8 Hz)], CH-3' [d_C 76,76 e d_H 3,10 (m)], CH-4' [d_C 69,80 e d_H 3,00 (m)] e CH-5' [d_C 77,00 e d_H 2,80 (m)] e metilênico CH₂-6' [d_C 60.57 e d_H 3,51 (m) e 3,20(m)]. A comparação destes dados espectrométricos com valores registrados na literatura⁸ para alcalóides b-carbolínicos glicosilados contendo grupo vinila permitiu destacar a presença de sinais remanescentes nos espectros de RMN ¹³C em d_CH 94,22, 89,00 (carbinólicos), 47,64, 46,59 e 31,04 e d_C 175,60 (compatível para ácido carboxílico). Estes dados revelaram-se semelhantes aos deslocamentos químicos descritos para os alcalóides ofiorinas A e B (Tabela 1). Surpreendentemente, o sinal do CH₂-14 não foi detectado no espectro registrado em D₂O, sendo observado em d_C 24,00 (CH₂) no espectro registrado em MeOH-d₄. O pico em m/z 513 ([M+1}, 55%, C₂₆H₂₉O₉N_2, Esquema 1) observado no espectro de massas (FAB-MS) revelou-se em acordo com a formula molecular C₂₆H ₂₈O₉N₂ correspondente às estruturas destas substâncias alcaloídicas. A análise comparativa dos dados obtidos dos espectros de RMN¹H e ¹³C registrados em D₂O (Tabela 1), incluindo-se experimentos 1D e 2D (HMQC e HMBC), permitiu distinguir entre os dois epímeros ofiorinas B (3) e A (3a), caracterizando-se o alcalóide indólico isolado de Simira glaziovii como ofiorina B (3) e fazer as atribuções inequívocas dos deslocamentos químicos dos carbonos desta substância. A leitura da rotação óptica de 3, [a]_D: -13,95 (c 0,043, MeOH), a igualdade entre os valores dos deslocamentos químicos de ¹H e ¹³C com os da ofiorina B registrada na literatura⁸ e levando em consideração de se tratar de um glicosídeo natural postulou-se a configuração (-)-ofiorina para a substância isolada de S. glaziovii e correspondendo a um novo estereoisômero da (+)ofiorina B registrada na literatura com [a]_D: +18,0⁸.

A análise detalhada dos espectros de massas confirmou a facilidade de fragmentação do alcalóide 3 no espectrômetro de massas. O espectro obtido com ionização por FAB-MS (glicerol como matriz, Esquema 1) revelou diferenças significativas quando comparado com o registrado por ionização química (CI-MS, Esquema 2). O FAB-MS mostrou o pico [M+1] em m/z 513 (55%, C₂₆H₂₉O₉N₂ ), e picos adicionais em m/z 469 [5%, m/z 513 ¾ 44 (CO₂), C₂₅H₂₉O₇N₂ ], 351 [15%, m/z 513 ¾ 162 (C₆H₁₀O₅), C₂₀H₁₉O₄N₂ ], 307 [27%, m/z 513 ¾ 44(CO₂) ¾ 162 (C₆H₁₀O₅) e/ou m/z 513 ¾ 162 (C₆H₁₀O₅) ¾ 44(CO₂), C₁₉H₁₉O₂N₂ ], 219 (59%, C₁₅H₁₁N₂), 182 (60%, C₁₂H₁₀N₂) e 133 [100%, C₅H₉O₄], como resumido no Esquema 1. No CI-MS o pico m/z 513 ([M+1]) não foi observado e os picos principais apareceram em m/z 335 [10%, m/z 513 (C₂₆H₂₉O₉N₂ ) ¾ 178 (C₆H₁₀O₆), 329 [27%, m/z 513 ¾ 184 (C₅H₁₂O₇), C₂₁H₁₇O₂N₂ ], 317 [92%, m/z 335 ¾ 18 (H₂O), C₂₀H₁₇O₂N₂ ] e 307 [100%, m/z 335 ¾ 28 (CH₂=CH₂), C₁₈H₁₅O₃N₂ ] (Esquema 2). Todos estes picos podem ser atribuídos a fragmentos formados através de reações relativamente simples, informativas e previstas pela estrutura 3, como revelam resumidamente os Esquemas 1 e 2 .

A reação de 3 com diazometano forneceu o produto rearranjado lialosilato de metila (4)¹⁶, como descrito na literatura⁸. A formação deste produto serviu como um dado adicional para confirmação da estrutura proposta.

A acetilação de 3 com anidrido acético na presença de piridina forneceu dois produtos (4a e 5). A análise dos dados espectrométricos obtidos por RMN ¹H e ¹³C e comparação com os valores atribuídos para o alcalóide 3 permitiu propor as estruturas 4a e 5 para os derivados acetilados (Tabelas 2 e 3).

As informações obtidas dos espectros 2D (HMQC e HMBC) dos produtos 4a e 5 permitiram identificar os sinais dos átomos de carbono hidrogenados e quaternários da unidade b-carbolínica e verificar as diferenças correspondentes às estruturas de 3 e 4a e 5 (Tabelas 2 e 3). As principais diferenças entre os dados dos produtos 4a e 5 e a ofierina B (3) podem ser resumidas com base na: a) ausência dos sinais de átomos de carbono em d_C 89,0 (CH-17) e 46,59 (CH-16) e hidrogênio em d_H 6,6 (sl, H-17) e 3,3 (m, H-16) nos espectros de 4a e 5; b) presença dos sinais do CH-17 [4a/5: d_C 147,6/150,9 e d_H 6,95 (d, 2,8 Hz)/7,80 (d, 2,8Hz)] e C-16 (4a/5: d_C 114,6/112,6); c) ausência do sinal em d_C 175,6 (C-22) nos espectros dos produtos (4a e 5) e a presença dos sinais de átomos de carbono carbonílicos (C-22) envolvidos em sistemas conjugados a,b-insaturados (4a/5: d_C 167,7/166,3). Os espectros HMBC revelaram picos transversais correlacionando interação spin-spin através de três ligações (³J_CH) entre os sinais de C-22 (4a/5: d_C 167,7/166,3) e H-17 [4a/5: d_H 6,95 (d, 2,8 Hz)/7,80 (d, 2,8Hz)] (item b); d) os deslocamentos químicos e a multiplicidade dos sinais dos carbonos metínicos e metilênicos da unidade b-glicopiranosídica revelaram-se compatíveis com a presença dos quatro grupos acetoxílicos (Tabelas 2 e 3); e) a análise adicional da região de absorção dos grupos acetoxílicos [(AcO)₅ em 4a e (AcO)₄ em 5] nos espectros HMQC e HMBC, facilitada através de expansões espectrais, permitiu reconhecer os sinais dos átomos de carbono e hidrogênio ligados entre si (¹J_CH) nos grupos metílicos e dos átomos de carbono carbonílicos com os hidrogênios metílicos (²J_CH) das unidades acetoxílicas.

Todos estes dados e a avaliação da reação realizada por tratamento de 3 em meio básico permitiram postular a formação de 4 como consequência da abstração inicial do H-16, a formação ligação dupla entre os átomos de carbono C-16 e C-17 e a neutralização da carga positiva localizada no nitrogênio N-4. A acetilação posterior de 4a produziu o derivado 5. O ataque nucleofílico do átomo de nitrogênio N-1 no carbono carbonílico C-22 justifica a ciclização e, consequentemente, a formação do produto 5 (Tabelas 2 e 3).

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais: Os pontos de fusão foram determinados em placa aquecida de Kofler e não foram corrigidos. Os espectros infra-vermelho (IV) foram registrados em pastilhas de KBr no espectrômetro 1420 da Parkin-Elmer. Os espectros de RMN foram registrados nos aparelhos UN-400 (¹H: 400 MHz e ¹³C: 100 MHz) da Varian e AC-200 (¹H: 200,13 MHz e ¹³C: 50,3 MHz) da Bruker. Os espectros de massas foram obtidos em um espectrômetro VG-Quatro. Nas separações cromatográficas em coluna e camada fina analítica e preparativa usou-se sílica gel da Aldrich ou Merck com granulação adequada. As placas cromatográficas foram reveladas com luz UV (l_max 254 nm), vapores de iodo e/ou solução alcoólica de vanilina e ácido sulfúrico.

Planta: O material vegetal foi coletado na reserva florestal de Tinguá, Nova Iguaçu, RJ, Brasil pelo Professor S. J. da Silva Neto (IB ¾ UFRRJ). A identificação foi feita através de comparação com a excicata (N^o 1513) depositada no herbário do Departamento de Botânica do Instituto de Biologia ¾ UFRRJ.

Extração e separação: As cascas de S. glaziovii (K. Schum) Steyerm. foram secas e moídas (930 g) e submetidas à extração através de maceração com hexano até exaustão e depois com metanol. As soluções dos extratos foram concentradas em evaporador rotativo sob vácuo, obtendo-se os resíduos dos extratos hexânico (SGCH, 600 mg) e metanólico (SGCM, 95,7g).

O extrato metanólico foi fracionado por cromatografia em coluna de sílica gel. Foram coletadas 71 frações e reunidas em grupos após análise através de cromatografia em camada fina analítica. Os grupos de frações foram monitorados por bioensaio de letalidade com Artemia salina¹⁷, identificando-se as propriedades tóxicas das frações investigadas. O grupo das frações reunidas 26-32 revelou maior toxicidade (DL₅₀ = 223 ppm), enquanto os demais não apresentaram índice significativo de toxidez (DL₅₀@ 1500).

A fração 11-12 foi cristalizada em metanol e obteve-se um material branco cristalino (55 mg) constituído de uma mistura dos esteróides b-sitosterol e estigmasterol e do éster metílico 1.

A fração 26-32 (21,7g) foi submetida a fracionamento cromatográfico em coluna de sílicagel, usando-se clorofórmio e metanol como eluentes. Foram coletadas 64 frações. A fração 7 (278,0 mg), que revelou o maior grau de pureza, foi submetida à purificação através de cromatografia em camada delgada preparativa e obteve-se o alcalóide 2 (50 mg, PF 230-231 ^oC ).

A fração 36-43 foi dissolvida em metanol a quente e após o resfriamento da solução forneceu o alcalóide 3 como um precipitado amarelo (4,0 g), pf 178-180 ^oC, [a]_D: -13,95 (c 0,043, MeOH).

O extrato SGCH (560 mg) foi fracionado através de cromatografia em camada preparativa circular (Chromatotron), usando-se clorofórmio puro como eluente. Obteve-se 25 frações, que foram reunidas em 9 grupos após análise através de cromatografia em camada fina com diferentes eluentes. A análise das frações com espectros IV e RMN ¹H permitiu identificar uma mistura de material alifático e uma mistura de sitosterona e estigmasterona.

Metilação de 3: O alcalóide 3 (100 mg) foi dissolvido em metanol e adicionou-se diazometano em excesso. Após a evaporação do solvente e a análise dos dados fornecidos por espectros de RMN ¹H e ¹³C do produto confirmou-se a formação do lialosídeo 4 (100 mg)¹⁶, em acordo com a previsão baseada em citação da literatura⁸.

Acetilação de 3: O alcalóide 3 (100 mg) foi dissolvido em piridina (2,0 ml) e adicionu-se anidrido acético (2,0 ml) e, posteriormente, 2 mg de pirrolidinopiridina (PP). A solução foi submetida a refluxo durante 3 h. Após este período e o resfriamento da solução, adicionou-se água gelada (4,0 ml) e extraiu-se com clorofórmio (3 x 10,0 ml). A solução orgânica foi lavada com HCl (10 %) e depois com água. Após secagem com sulfato de sódio anidro, o solvente foi evaporado e o resíduo foi filtrado em coluna de sílicagel, eluída com CHCl₃ + MeOH (9:1). A fração 5 (71,6 mg) foi fracionada em camada delgada preparativa de sílica gel (eluente acetato de etila). As frações 3 (10,3 mg) e 4 (19,5 mg) deste fracionamento revelaram-se puras através de análise por TLC em diferentes eluentes. Estes produtos apresentaram-se pastosos e foram caracterizados como sendo os derivados acetilados 4a e 5.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao CNPq, FAPERJ e CAPES pelas bolsas e apoio financeiro concedidos, aos Prof. P.G. Filho e S. J. da Silva Neto, Departamento de Botânica, Instituto de Biologia, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), Seropédica, Rio de Janeiro, Brasil, pela coleta e identificação botânica do espécimen usado para investigação.

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