临床经验 Open Access
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世界华人消化杂志. 2010-09-18; 18(26): 2804-2808
在线出版日期: 2010-09-18. doi: 10.11569/wcjd.v18.i26.2804
TKTL1蛋白及mRNA在食管鳞癌组织中的表达及其临床意义
闫艳琴, 崔黎, 李晟磊, 刘红涛
闫艳琴, 河南省郑州市骨科医院普内科 河南省郑州市 450001
崔黎, 李晟磊, 郑州大学第一附属医院病理科 河南省肿瘤病理重点实验室 河南省郑州市 450052
刘红涛, 郑州大学生物工程系细胞生物学研究室 河南省郑州市 450001
基金项目: 河南省教育厅自然科学基金资助项目, No. 2010A310008.
作者贡献分布: 此课题李晟磊设计; 研究过程由闫艳琴、崔黎及刘红涛操作完成; 研究所用新试剂及分析工具由刘红涛提供; 数据分析由刘红涛与李晟磊完成; 本论文写作由闫艳琴、崔黎、李晟磊及刘红涛共同完成.
通讯作者: 刘红涛, 450001, 河南省郑州市, 郑州大学生物工程系细胞生物学研究室. liuht1230@126.com
电话: 0371-66658175
收稿日期: 2010-06-21
修回日期: 2010-08-03
接受日期: 2010-08-10
在线出版日期: 2010-09-18

目的: 探讨TKTL1在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义.

方法: 分别采用原位杂交及免疫组织化学的方法检测62例食管鳞癌组织、31例癌旁不典型增生组织及62例正常食管黏膜组织中TKTL1蛋白及其mRNA的表达.

结果: 正常黏膜组织、癌旁不典型增生组织及食管鳞癌组织中TKTL1蛋白阳性表达率依次增高, 分别为17.7%(11/62)、29.0(9/31)、53.2%(33/62), 组间比较差异有统计学意义(均P<0.05); TKTL1蛋白表达与癌的浸润深度、淋巴结转移及TNM分期密切相关, 组间比较差异有统计学意义(均P<0.05). 正常黏膜组织、癌旁不典型增生组织及食管鳞癌组织中TKTL1 mRNA的阳性表达率依次增高, 分别为4.8%(3/62)、22.6%(7/31)、43.5%(27/62), 组间比较差异有统计学意义(均P<0.05); TKTL1 mRNA表达与癌的浸润深度、淋巴结转移及TNM分期密切相关, 组间比较差异有统计学意义(均P<0.05). TKTL1蛋白及其mRNA的表达呈正相关关系(γp = 0.302, P<0.01).

结论: TKTL1蛋白及其mRNA表达率升高可能与食管鳞癌的发生、发展及浸润、转移有关.

关键词: 酮醇酶样基因-1; 免疫组织化学; 原位杂交; 食管鳞状细胞癌

引文著录: 闫艳琴, 崔黎, 李晟磊, 刘红涛. TKTL1蛋白及mRNA在食管鳞癌组织中的表达及其临床意义. 世界华人消化杂志 2010; 18(26): 2804-2808
Clinical significance of TKTL1 expression in esophageal squamous cell carcinoma
Yan-Qin Yan, Li Cui, Sheng-Lei Li, Hong-Tao Liu
Yan-Qin Yan, Department of Internal Medicine, Zhengzhou Orthopedics Hospital, Zhengzhou 450001, Henan Province, China
Sheng-Lei Li, Li Cui, Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University; Henan Key Laboratory of Tumor Pathology, Zhengzhou 450052, Henan Province, China
Hong-Tao Liu, Laboratory of Cell Biology, Department of Bioengineering, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan Province, China
Supported by: the Natural Science Foundation of the Education Department of Henan Province, No. 2010A310008.
Correspondence to: Hong-Tao Liu, Laboratory of Cell Biology, Department of Bioengineering, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan Province, China. liuht1230@126.com
Received: June 21, 2010
Revised: August 3, 2010
Accepted: August 10, 2010
Published online: September 18, 2010

AIM: To investigate the expression of transketolase like-1 (TKTL1) protein and mRNA and to analyze its clinical significance in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC).

METHODS: The expression of TKTL1 protein and mRNA was detected by immunohistochemistry and in situ hybridization in 62 ESCC specimens, 31 tumor-adjacent atypical hyperplastic epithelial specimens, and 62 normal esophageal mucosal specimens, respectively.

RESULTS: The positive rates of TKTL1 protein expression in normal esophageal epithelium, tumor-adjacent atypical hyperplastic epithelium and ESCC were 17.7% (11/62), 29.0% (9/31) and 53.2% (33/62), respectively, with significant differences among the three groups (all P < 0.05). TKTL1 protein expression was closely correlated with infiltrative depth, lymphatic metastasis and TNM grade in ESCC (all P < 0.05). The positive rates of TKTL1 mRNA expression in normal esophageal epithelium, tumor-adjacent atypical hyperplastic epithelium and ESCC were 4.8% (3/62), 22.6% (7/31) and 43.5% (27/62), respectively, with significant difference among the three groups (all P < 0.05). TKTL1 mRNA expression was closely associated with infiltrative depth, lymphatic metastasis and TNM grade in ESCC (all P < 0.05). There is a positive correlation between TKTL1 mRNA and protein expression (γp = 0.302, P < 0.01).

CONCLUSION: TKTL1 expression may be associated with the development, invasion and metastasis of ESSC.

Key Words: Transketolase like-1 gene; Immunohistochemistry; In situ hybridization; Esophageal squamous cell carcinoma


0 引言

浸润和转移既是食管鳞癌的重要生物学特性, 也是其难以治愈并导致患者死亡的关键问题之一. 转酮醇酶(transketolase, TKT)是磷酸戊糖代谢中联系磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)和葡萄糖氧化的关键酶, 很多病理过程中存在TKT活性的改变, 其异常表达与多种恶性肿瘤细胞的生长、侵袭及转移过程密切相关[1-3]. 因此, TKT已成为研究抗肿瘤药物极具吸引力的新靶点. 为了探讨转酮醇酶样基因-1(transketolase like gene-1, TKTL1)在食管鳞癌发生、发展及演变过程中的作用, 我们采用了免疫组织化学及原位杂交的方法, 联合检测了TKTL1蛋白及其mRNA在食管鳞癌中的表达, 以期寻找食管癌早期诊断和判断预后的分子指标.

1 材料和方法
1.1 材料

62例食管癌手术切除标本于2006-02- 26/03-16取自安阳市肿瘤医院. 其中男36例, 女26例, 年龄38-75岁, 所有病例术前均无化疗、放疗及免疫治疗史.

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学、原位杂交染色: 全部62例标本分别取自无坏死癌灶、癌旁3 cm以内及远端(>3 cm, 经HE染色证实, 癌旁组织中31例有不典型增生)正常黏膜组织, 经40 g/L多聚甲醛固定, 常规脱水, 石蜡包埋, 连续切片, 切片厚度4-6 μm, 分别用于HE、免疫组织化学及原位杂交染色. 62例均经组织学证实为鳞状细胞癌. 其中组织学分级Ⅰ级15例, Ⅱ级25例, Ⅲ级22例; 伴淋巴结转移者20例, 无淋巴结转移者42例; 浸润至浅层(黏膜下层或浅肌层)者7例, 浸润深层(深肌层或外膜层)者55例; 按1997年UICC的TNM分期,Ⅰ、Ⅱ期19例, Ⅲ、Ⅳ期43例. 鼠抗人单克隆抗体TKTL1购自美国R&D公司公司, SP免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物技术开发公司. 采用SP法, TKTL1单抗稀释, 稀释倍数均为1:170, DAB显色, 苏木素复染. 染色步骤严格按说明书进行, 以PBS液代替一抗作为阴性对照. 预杂交液、SA-Bio-AP、BCIP/NBT均购自武汉博士德生物技术有限公司. 探针序列: 原位杂交5'端生物素标记、全硫代修饰探针由北京奥科生物技术有限公司合成. TKTL1探针序列: GTGGACGGACCATTGCTTTTG. 标本经新鲜配制二甲苯脱蜡, 梯度酒精脱水后, 用新鲜配制的0.5% H2O2室温处理30 min, 以灭活内源性过氧化物酶; 3%柠檬酸新鲜配制蛋白酶(0.01 g/L), 37 ℃, 10 min, 消化标本DNA结合蛋白; 每张玻片滴加20 μL不含探针的预杂交液(42 ℃), 预杂交4 h; 加含探针(1 ng/L)的杂交液, 42 ℃湿盒内杂交12 h; 0.1×标准柠檬酸盐42 ℃洗后, 加SA-Bio-AP 37 ℃, 10 min; 漂洗后加BCIP/NBT, 避光显色2-4 h. 以不含探针的标本作阴性对照.

1.2.2 免疫组织化学及原位杂交染色结果判定: TKTL1蛋白阳性信号呈浅黄色至棕黄色颗粒, 位于细胞质内; mRNA阳性信号呈棕紫蓝色颗粒样物质, 也位于细胞质内. 高倍镜下随机选取5个视野(每个视野观察细胞数不少于200个), 按阳性细胞所占百分比及着色深浅进行结果判定. 采用9分评分制: 按照阳性细胞比例≤10%为1分, 10%-50%为2分, >50%为3分; 按染色强弱: 阴性为0分; 淡黄(蓝)色染色为1分; 中度黄(蓝)色染色为2分, 棕黄(紫蓝)色染色为3分. 然后按照"阳性细胞得分×染色强弱得分"计总分, 总分<3为阴性, 总分≥3为阳性[4,5].

统计学处理 应用SPSS11.0统计学软件, 行χ2检验, 相关性检验用Spearman相关分析, 检验水准α = 0.05.

2 结果
2.1 TKTL1蛋白及其mRNA在食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织及正常黏膜组织中的表达

TKTL1蛋白定位于细胞胞质中, 偶可见有胞核及周边不等量的间质细胞着色, 阳性信号呈浅黄色至棕黄色颗粒. 对照组标本中无阳性信号显示. 不同临床病理特征食管组织中TKTL1蛋白表达的情况见表1和图1. TKTL1 mRNA定位于细胞胞质中, 呈蓝紫色颗粒. 对照组标本中无阳性信号显示. 不同临床病理特征食管组织中TKTL1 mRNA表达的情况见表1和图2.

表1 TKTL1蛋白及其mRNA在食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织及正常黏膜组织中的表达.
部位nTKTL1蛋白TKTL1蛋白
TKTL1 mRNA
阳性表达n(%)χ2P阳性表达n(%)χ2P
正常黏膜上皮6211(17.7)17.8050.0003(4.8)25.5970.000
非典型增生组织319(29.0)7(22.6)
鳞癌组织6233(53.2)27(43.5)
图1
图1 TKTL1蛋白的表达(SP×200). A: 正常黏膜; B: 癌旁组织; C: 癌组织.
图2
图2 TKTL1 mRNA的表达(ISH×200). A: 正常黏膜; B: 癌旁组织; C: 癌组织.
2.2 TKTL1蛋白及mRNA表达与食管鳞癌临床生物学行为的关系

TKTL1蛋白及其mRNA表达均与食管鳞癌组织学分级无关(P>0.05), 与浸润深度、有无淋巴结转移及TNM分期密切相关(均P<0.05或0.01, 表2).

表2 TKTL1蛋白及其mRNA的表达与食管鳞癌临床生物学行为的关系.
病理特征nTKTL1蛋白
TKTL1 mRNA
阳性表达n(%)χ2P阳性表达n(%)χ2P
组织学分级
155(33.3)3.4190.1814(26.7)2.3130.315
2514(56.0)12(48.0)
2214(63.6)11(50.0)
浸润深度
浅层71(14.3)4.8060.0280(0.0)6.0870.014
深层5532(58.2)27(100.0)
淋巴结转移
4217(40.5)8.5010.00413(31.0)8.4030.004
2016(80.0)14(70.0)
TNM分期
Ⅰ、Ⅱ195(26.3)7.9680.0053(31.6)8.5870.003
Ⅲ、Ⅳ4328(65.1)24(76.7)
2.3 TKTL1蛋白及其mRNA在食管鳞癌组织中表达的相关性

在62例食管鳞癌组织中, TKTL1蛋白表达阳性表达33例中, TKTL1 mRNA表达阳性占19例, 而TKTL1蛋白表达阴性的29病例中, TKTL1 mRNA表达阴性的占21例. TKTL1蛋白及mRNA在食管鳞癌组织中的表达呈正相关关系(γp = 0.302, P<0.05, 表3).

表3 TKTL1蛋白及其mRNA在食管鳞癌组织中表达的相关性.
TKTL1mRNAnTKTL1蛋白
γpP
+-
+271980.3020.017
-351421
3 讨论

人类多数恶性肿瘤的发生是因为细胞失去了增殖及分化成熟的能力所引起的, 其发生发展过程是多因素参与及多步骤调控的复杂过程, 其中涉及了遗传学和表观遗传学等改变[6,7].

糖酵解途径及PPP是肿瘤中葡萄糖代谢的两个通路. 研究发现, 许多恶性肿瘤的肿瘤细胞内都存在有与糖酵解有关的酶类表达显著升高的现象, 而这些酶类的活性增强与肿瘤细胞糖酵解的增强密切相关. PPP可以向肿瘤细胞提供腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)、还原型辅酶Ⅱ(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化还原同等物及戊糖, 这都与恶性肿瘤的发生关系非常密切[8-10]. 酮醇基转移酶是PPP的非氧化分支的限速酶, 而PPP的非氧化分支是恶性肿瘤细胞中核苷酸中核糖的主要来源地, 并产生NADPH[11]. TKT家族包含有3种TKT基因: TKT、TKTLl和TKTL2. TKTLl是TKT家族成员之一, 其定位于Xq28, 该区域包含了多种与恶性肿瘤转化及与细胞周期有关的基因, 在肿瘤发生发展上起到非常重要的作用. TKTLl蛋白过表达与葡萄糖代谢高度相关, 在许多肿瘤里其蛋白质水平与肿瘤转移和预后差相关. TKTLl是连接PPP和糖酵解途径的代谢通路的关键酶, 而酮醇基转移酶活性上调的肿瘤细胞, 能通过不依赖氧的产生的ATP使得葡萄糖作为一种能量来源. 另外, 酮醇基转移酶通过利用乙酰辅酶A连接着需氧糖酵解和脂肪酸盐产物, 在肿瘤细胞中TKTLl对于细胞增殖和葡萄糖代谢都有非常重要的意义[12-14].

本研究将收集到的62食管癌标本进行免疫组织化学及原位杂交染色分析, 比较了食管鳞癌患者远端正常食管黏膜、癌旁不典型组织及癌组织中TKTL1蛋白及mRNA的表达程度及及其与癌组织的组织学分级、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期的关系. 结果显示正常食管黏膜组织中TKTL1的表达极低, 而癌组织中TKTL1表达程度较高(P<0.05), 这个结果与其他恶性肿瘤的结果基本吻合, 表明TKTL1在食管癌中也存在高表达的现象. 同时, 我们又比较了局限在浅肌层以内的癌组织与已经浸润至深肌层或纤维膜的癌组织中TKTL1表达的差异. 结果显示浸润深肌层和/或纤维膜的癌组织中TKTL1蛋白及mRNA的表达水平明显高于其在浸润深度为浅肌层以内的癌组织(P<0.05), 这提示TKTL1的高表达与食管癌的侵袭性有关; 同时我们又比较了食管癌组织中不同的TNM分级与TKTL1表达程度的关系, 结果显示不同分级与TKTL1表达程度具有显著相关性(P<0.05); 实验结果还显示, 在伴有淋巴结转移的癌组织中TKTL1蛋白及mRNA的表达同样也远高于其在无淋巴结转移的癌组织(P<0.05). 由本次的实验结果推测, TKTL1可能参与了食管癌的浸润与发展, TKTL1的异常高表达可能是判定食管癌是否具有高浸润性的一个指标, 为临床是否采取更加积极的治疗措施提供参考.

评论
背景资料

TKTL1是连接磷酸戊糖途径和糖酵解途径代谢通路的关键酶, 而酮醇基转移酶活性上调的肿瘤细胞, 能通过不依赖氧产生的ATP使得葡萄糖作为一种能量来源, 与多种肿瘤的发生、发展密切相关.

同行评议者

李增山, 副教授, 中国人民解放军第四军医大学病理教研室

研发前沿

关于TKTLl基因与食管癌浸润、转移的关系及TKTLl表达相关性的研究, 迄今国内外均未见报道. 关于TKTLl与恶性肿瘤关系的研究已成为热点.

创新盘点

本文首次采用免疫组织化学及原位杂交方法联合检测了食管癌高发区河南安阳的食管癌患者手术切除的癌组织、癌旁不典型增生组织及正常食管黏膜组织中TKTLl蛋白及mRNA的表达情况.

名词解释

转酮醇酶(TKT): 是磷酸戊糖代谢中联系磷酸戊糖途径(PPP)和葡萄糖氧化的关键酶, 很多病理过程中存在TKT活性的改变, 其异常表达与多种恶性肿瘤细胞的生长、侵袭及转移过程密切相关.

同行评价

本文设计较合理, 论述清晰, 结论明确, 具有一定的参考价值.

编辑: 曹丽鸥 电编:何基才

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