Genetische Einzelzellanalysen von Kopf-Hals-Tumoren aus isolierten Zellen von primären Tumoren und autologen Metastasen

Hintergrund: Gegenwärtige Tumorgenomanalysen werden im Allgemeinen an DNA aus Milliarden von Zellen durchgeführt. Ein daraus resultierendes Problem ist das Übersehen potentieller Informationen aus der intratumoralen genetischen Heterogenität, welche relevant für die Tumorentwicklung und Erfolg der Therapie sein könnte. Hierfür haben wir ein Protokoll etabliert, welches uns umfassende Analysen des gesamten Genoms einzelner isolierter Tumorzellen aus Primärtumoren und deren Metastasen ermöglicht.

Methoden: Aus Primärtumoren und deren autologen Metastasen von Patienten mit Kopf-Hals-Tumoren (HNSCC; Head and Neck Squamous Cell Carcinoma), wurde eine Einzelzellsuspension hergestellt und auf Haft-Objektträgern sedimentiert. Die epithelialen Tumorzellen wurden über eine Doppel-Immunfluoreszenzfärbung gegen die Marker CD44v6 und CK5/14 identifiziert. Doppelt positive Zellen wurden mithilfe eines Mikromanipulators isoliert und mit einer Adapter-Linker-PCR das gesamte Genom der Einzelzelle amplifiziert. Anschließend wurden verschiedene Exone von TP53 sequenziert und Array Comparative Hybridization (aCGH, Agilent 4×180k) durchgeführt, sowohl an Einzelzellamplifikaten der Tumore, wie auch an genomischer DNA der Primärtumore. Mit einer Fluoreszenz-in-situ-hybridization (FISH) wurde die Kopienanzahl von Chromosom 17 und dem TP53-Genlocus festgestellt.

Ergebnisse: In den Fällen wo eine heterozygote TP53-Mutation zu sehen war, konnte auf Einzelzellebene eine unerwartete Variation von wildtypischen, heterozygoten und einer neuen homozygoten Mutation beobachtet werde. Ein Fall zeigte eine Expansion der mutierten Klone in der Metastase, während in einem zweiten Fall die genetische Veränderung des Primärtumors auf die Metastase übertragen wurde. Zusätzlich konnten durch globale Genomanalysen via aCGH Unterschiede in der intratumoralen Heterogenität und genetische Divergenzen zwischen Primärtumoren und deren autologen Metastasen beobachtet werden.

Schlussfolgerung: Dieser experimentelle Ansatz ermöglicht umfassende Untersuchungen der genetischen Heterogenität von Primärtumoren und autologen Metastasen auf Einzelzellebene. Diese neue Perspektive aus dem Einzelzellgenom, zeigte sowohl gleiche genetische Veränderungen zwischen Primärtumor und Metastase, als auch die Entwicklung neuer Varianten innerhalb der Metastase. Im Kontext effektiver zielgerichteter Therapien, könnte diese genetische Variabilität in Tumorzellen eine hohe klinische Relevanz haben.