Kooperation der Östrogenrezeptoren ERα und ERβ mit GPR30 in der Regulation der östrogeninduzierten ERK-Aktivierung in primären humanen endometrialen Stromazellen

Einleitung:

Das humane Endometrium ist ein hormonabhängiges Gewebe, in welchem die Zellen zahlreiche Adaptierungsvorgänge als Antwort auf die hormonellen Veränderungen im Rahmen des Menstruationszyklus durchlaufen.

Ziel:

In dieser Studie untersuchen wir die Rolle der Östrogenrezeptoren ERα, ERβ sowie des G-Protein gekoppelten Östrogenrezeptors GPR30 in der Regulation der durch 17ß-Östradiol (E2) induzierten nicht-genomischen Aktivierung des MAPK/ERK-Signalweges in normalen primären humanen endometrialen Stromazellen (hESC).

Material und Methodik:

Für die Versuche wurden hESC des eutopen Endometriums von Patientinnen (n=10), welche eine Laparoskopie erhielten, in der proliferativen Phase des Menstruationszyklus entnommen. Zusätzlich wurde im Rahmen der Operation eine Curretage durchgeführt und histologisch untersucht, um das Vorliegen einer Endometriose auszuschließen. Vor der spezifischen Stimulation wurden die Zellen in serumfreiem DMEM-F12-Medium für 24 Stunden kultiviert, und, falls nötig, 12 Stunden vor der Stimulation mit entweder nur Vehikeln oder den jeweiligen Inhibitoren vorbehandelt. Die folgenden Inhibitoren wurden für diese Studie verwendet: 1µM ER-Inhibitor ICI 182,780, 100ng/ml spezifischer G-Protein-Inhibitor Pertussistoxin (PT), 1µM EGFR Inhibitor AG1478, 150 nM spezifischer Src Tyrosin-Kinase-Inhibitor (Src-I), 5µM Src Tyrosinkinasen-Familien-Inhibitor PP2 und 1µM spezifischer GPR30-Inhibitor G15. Die Zellen wurden mit folgenden Substanzen stimuliert: entweder E2 (1 nM oder 1µM) oder PPT (spezifischer ERα Agonist) oder 10 nM DPN (spezifischer ERß Agonist) oder mit 1µM oder 1 nM G1 (GPR30 spezifischer Agonist), mit oder ohne den Inhibitoren für kurze Zeitintervalle (von 2min bis 60min) bei 37°C. Anschließend wurden in den Kontroll- und behandelten hESC PCR- und Western Blot-Analysen für ERα, ERβ, GPR30, und Western Blots für pERK, total ERK und α-tubulin durchgeführt. Weiters wurden dieselben Analysen nach spezifischen GPR30 und ERα siRNA-Knockdowns angewendet.

Resultate und Diskussion:

Zehn Minuten nach der Zugabe von entweder E2 oder G1 (GPR30 nichtsteroidaler Agonist) wurde die maximale ERK-Aktivierung beobachtet, welche durch Zugabe des Inhibitors ICI 182,780 oder G15 aufgehoben werden konnte. Die Hemmung der Östrogenrezeptoren mit ICI 182,780 hob die GPR30 vermittelte ERK-Aktivierung auf und die Hemmung von GPR30 mit dem Inhibitor G15 hob die stimulierenden Effekte von E2 auf. Weiters zeigen wir hiermit, dass G-Proteine und Src-Kinase-Familienmitglieder für die effiziente ERK-Aktivierung in hESC benötigt werden. Der spezifische EGFR-Phosphorylierungsinhibitor AG1478 blockierte die durch E2 und G1 hervorgerufene Aktivierung (ERK-Phosphorylierung) in hESC. Der Knockdown von entweder ERα oder GPR30 bestätigte die Daten der Antagonistenbehandlungen und zeigte, dass beide Rezeptoren in die Regulation der MAPK/ERK-Signalweg-Aktivität nach einer Hormonstimulierung involviert sind. Zusätzlich zu den Veränderungen in der ERK-Aktivierung, führte der GPR30-Knockdown in den hESC zu einer signifikanten Reduktion der c-Jun-Expressionslevel sowie derer von phosphoryliertem Akt nach G1-Stimulierung. Die Langzeitbehandlung von hESC mit entweder E2 oder G1 allein oder in Kombination mit einem MAPK-Inhibitor (PD98059) zeigte eine E2-induzierte ERK-Aktivierung, welche für die Regulation der hESC-Proliferation und Migration eine wesentliche Rolle spielen könnte. Im Gegensatz zu E2 war die G1-induzierte ERK-Aktivierung ausreichend für die Regulation der hESC-Migration.

Schlussfolgerung:

Hiermit zeigen wir eine komplexe Regulation der nicht-genomischen ERK-Aktivierung in normalen hESC und schlagen ein Erklärungsmodell vor, wie diese in unserem in-vitro Zellsystem abläuft.