Aufreinigung pankreatischer Vorläuferzellen aus Differenzierungskulturen embryonaler Stammzellen

Fragestellung: Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) sind in der Lage, jeden adulten Zelltyp durch Differenzierung hervorzubringen. Die geringe Verfügbarkeit von Spenderorganen zur Transplantationstherapie des Typ 1 Diabetes mellitus hat die Erforschung von insulinproduzierenden Surrogatzellen aus ES-Zellen in den Fokus gerückt. Das Ziel dieser Studie war die Entwicklung eines Reportersystems, um später pankreatische Progenitorzellen mittels FACS-Sortierung aus einer differenzierten Stammzellpopulation aufzureinigen und zu charakterisieren.

Methodik: Es wurden zwei lentivirale Vektorsysteme entwickelt, in welchen ein Fluorophor (GFP2, mCherry) durch die gewebe- und entwicklungsspezifischen Promotoren der Gene Hnf6 oder Pdx1 exprimiert werden kann. Dadurch kann eine entwicklungspezifische Zellpopulation aus einer Differenzierungskultur aufgereinigt werden. Murine ES-Zellen der Linien ES-D3 und ES-CCE wurden mit diesen Vektoren stabil transduziert und die Klone mittels qPCR, Western Blot und FACS charakterisiert.

Ergebnisse: Die Promotoren der Gene Hnf6 und Pdx1 wurden in das lentivirale Expressionsplasmid (pLenti6.3V5) kloniert und infektiöse, lentivirale Partikel mittels Transfektion in 293FT-Zellen erzeugt. Zur Kontrolle der Transduktion wurde eine murine Fibroblastenzelllinie (3T3), die insulinproduzierende Betazelllinie MIN6 und undifferenzierte ES-Zellen der Maus erfolgreich transduziert. MIN6 Zellen, die eine Pdx1-Expression aufweisen, zeigten nach Transduktion mit pLenti-Pdx1-GFP2 eine deutlich erhöhte Fluoreszenz im Vergleich zu Pdx1-negativen Fibroblasten und ES-Zellen. Per qPCR konnte die Integration der Genkassette in das Genom der transduzierten Zellen nachgewiesen werden. Zellen die mit dem Konstrukt pLenti-Hnf6-GFP2 transduziert wurden, zeigten eine leichte Zunahme der Fluoreszenz. ES-Zellen der Maus wurden nach Transduktion klonal selektioniert und zeigten ein normales, für ES-Zellen typisches, Wachstumsverhalten sowie ein klassisches morphologisches Erscheinungsbild. Eine Charakterisierung embryonaler Marker erbrachte positive Färbungen für Alkalische Phosphatase, immunhistochemische Färbung von Oct4 und Nanog im Zellkern.

Schlussfolgerungen: Die Differenzierung von ES-Zellen in insulinproduzierende Betazellen ist ein vielversprechendes Therapiekonzept des Typ 1 Diabetes. Bisherige Ergebnisse zeigen, dass neben insulinproduzierenden Zellen weitere unerwünschte Zelltypen erzeugt werden, weshalb ein Selektions- oder Aufreinigungsschritt unerlässlich ist, um eine biochemische und funktionelle Analyse differenzierter, insulinproduzierender Zellen vornehmen zu können. Eine Möglichkeit, dies technisch umzusetzen, ist die gewebespezifische Expression von Reportergenen. Die Expression eines fluoreszenten Reportergens unter der Kontrolle des etablierten Pdx1-Promoters (Pdx1 ist essentiell für die Pankreasorganogenese) ist ein möglicher Schritt, um Pdx1-positive pankreatische Vorläuferzellen aus Differenzierungskulturen aufzureinigen.