Nitrogen-fixing symbioses had been established between the originally asymbiotic soil bacterium Azotobacter vinelandii CCM289 and different lower and higher plant species. Better characterization and further development of such artificial systems require a reliable genetic transformation method for the introduction of marker genes into symbiont candidates. The performance of electroporation was evaluated using pJB3 (4.8 kb), pBl121 (12.8 kb) and pFAJ31.2 (24 kb) plasmid DNAs containing selectable (Ap, Km, Tc) and screenable (gusA, lacZ) marker genes. The adapted methods for the preparation of transformation-competent azotobacters and their electroporation (18 kV/cm electric field strength, 5 ms time constant, 0°C) provided up to 6.8 × 105 transformants per μg plasmid DNA, which is about 103 times the transformation efficiency achieved in control experiments. No electrotransformants were obtained with the 24-kb pFAJ31.2. The size of plasmid DNA did not significantly affect the efficiency of transformation. Transformants were able to grow at antibiotic concentrations that were 100–200 times greater than the lowest amounts that completely inhibited the growth of wild-type bacteria. A constitutive expression of gusA gene was observed in transformants with the CaMV 35S promoter-gusA fusion containing pBl121, while lacZ expression was not detected under the control of the lac promoter in pJB3 transformants. Electroporated plasmids were reisolated from transformants in their original form, while non-transformed bacteria did not contain indigenous plasmids. PCR amplification and Southern DNA blot hybridization showed the integration of plasmid DNA into the host genome as well. Transformants retained their nitrogen-fixing ability and had normal morphological and growth characteristics. Experimental findings proved the stable maintenance of plasmid DNA in azotobacters, making possible the routine transformation and detection of these symbiont candidates.
Nous avons évalué les capacités de lélectroporation en utilisant les ADNs des plasmides pJB3 (4,8 kb), pBI121 (12,8 kb) et pFAJ31,2 (24 kb) contenant des gènes marqueurs qui permettent la sélection (Ap, Km et Tc) et le criblage (gusA et lacZ). Les méthodes de préparation de Azotobacter vinelandii CCM289 compétent et d'électroporation (18 kV/cm, 5 ms, 0°C) ont fourni 6,8×105 transformants par μg d'ADN plasmidique, ce qui represente une efficacité de transformation 1,000 fois supérieure à celle des témoins. Aucun électrotransformant n'a été obtenu avec le plasmide pFAJ31,2. La taille de l'ADN plasmidique n'influence pas significativement l'efficacité de transformation. Les transformants sont capables de croître de crôitre en présence de concentrations d'antibiotiques 100 à 200 plus fortes que celles qui inhibent la croissance des bactéries sauvages. Une expression consitutive du gène gusA est observée chez des transformants pBI121 avec des fusions promoteur CaMV 35S-gusA alors que l'expression de lacZ n'est pas décelée sous le contrôle du promoteur lac chez les transformants pjB3. Les plasmides d'électroporation sont réisolés chez les transformants dans leur forme originale alors que les bactéries non transformées ne contiennent pas de plasmides indigènes. La PCR et l'hybridation de type Southern démontrent l'intégration de l'ADN plasmidique dans le génome de l'hôte. Les transformants gardent leur aptitude à fixer l'azote et ils ont des caractères normaux de morphologie et de croissance. La stabilité de l'ADN plasmidique de Azotobacter peut assurer la transformation ainsi que la détection de tels candidats symbiontes.