Insertionsspezifische Nachweisverfahren für transgene Pflanzenlinien unter Anwendung der inversen PCR

Zusammenfassung

In der Genehmigungspraxis für Freisetzungen und Inverkehrbringen sind die Zulassungen von Pflanzen auf die Transformationsereignisse (sog. “events”) und deren Nachkommen beschränkt. Standardisierungsfähige Nachweismethoden für diese Ereignisse sind bislang nur unzureichend entwickelt worden. Im Sinne der Rückverfolgbarkeit und des Monitorings von gentechnisch veränderten Organismen (GVO) in der Umwelt gemäß der novellierten Freisetzungsrichtlinie der EU sollten einfache Methoden verfügbar sein, die die Identität eines GVO zweifelsfrei belegen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Methode der inversen PCR angewandt, um in transgenen Linien der Kulturarten Kartoffel, Mais, Zuckerrübe und Raps die das Transgen flankierenden pflanzlichen Sequenzen zu ermitteln. Von diesen DNA-Sequenzen wurden Primer abgeleitet, durch deren Einsatz in Standard-PCRs der Integrations- und damit linienspezifische Nachweis von Inserts ermöglicht wurde. Es konnte gezeigt werden, dass die inverse PCR unabhängig von der Transformationsmethode und der Kulturpflanzenart einsetzbar ist. Selbst bei Verwendung gleicher Transformationsvektoren war es möglich, einzelne Transformationsereignisse auch nach langer züchterischer Bearbeitung der transgenen Linien zu identifizieren und gegeneinander abzugrenzen. Unabdingbar für die Anwendung der Methode ist die Kenntnis der Vektorsequenzen und im Fall des direkten Gentransfers die Kenntnis des molekularen Zustandes der übertragenen Fremd-DNA am Integrationsort.

Abstract

According to the current EU practice, authorisations for the marketing of genetically modified plants (GMP) on the basis of directives 90/220 and 2001/18 are granted exclusively for individual transformation events and their progeny. In the past the development of detection methods for GMP focussed largely on verifying the presence of characteristic transgenes rather than on unique transformation events. However, in the near future simple methods have to be made available to ascertain the exact identity of a GMP, in particular to allow the traceability and the environmental monitoring of GMPs during the post-marketing phase. In this study we used the method of inverse PCR (IPCR) to determine the plant genomic sequences flanking the inserts in transgenic lines of potato, corn, sugar beet, and oilseed rape. The sequence information was used to select primers for standard PCR protocols covering the transgene integration site and thus permitting an event-specific proof. We were able to show that the success of the inverse PCR was independent of the transformation method as well as of the plant species used. An absolute prerequisite for this approach to work is the availability of detailed information on vector sequences. In the case of direct gene transfer, information on the internal structure of the transferred DNA at its integration site is desirable.