Analysis of metabolic transients in intact cells by rapid microfluorimetry

Summary

The analysis of NAD⁺ (or NADP⁺) reduction-reoxidation transients in single living cells by rapid microfluorimetry provides a mean to screen the activity of various intracellular enzymes, the interplay of regulating cofactors as well as the influence of structural compartmentalization or membrane barriers. Examples of possible applications refer to the analysis of transient parameters, the pattern of enzymatic pathways in relation to cell growth, effects of cofactors or metabolic “preloading”, etc. Through the incorporation of a nitrogen chamber the method has been extended to cells (e. g. L cells, human astrocytoma) which require anaerobiosis for glycolytic reduction of NAD⁺. When glucose-6-phosphate is replaced by glucose-1-phosphate the lag which precedes NAD⁺ reduction is prolonged from 100–200 msec up to 500–1000 msec. This can be shortened in presence of glucose-1,6-phosphate (a coenzyme for phosphoglucomutase). Differences in the flux pattern of the forward reaction at the phosphoglucomutase are found in a pleiomorphic population of L cells: e. g. glucose-1-phosphate more easily channeled towards the Embden-Meyerhof sequence in the larger non-dividing individuals. Preincubation with glycerol or xylitol leads to a prolongation of all parameters in the fluorescence transients, while cyclic AMP and ethionine lead to the opposite. The pattern of fluorescence transients makes possible a differentiation between reversible and irreversible inhibitors of LDH. Thus, by rapid microfluorimetry it is possible to resolve the early and later phases of fluorescence transients into components corresponding to characteristic steps in the sequence of intracellular events or control states.

Zusammenfassung

Die Analyse von NAD⁺- (oder NADP⁺-)Reduktions-Reoxidationsübergängen in einzelnen lebenden Zellen durch schnelle Mikrofluorimetrie bietet eine Möglichkeit, die Aktivität verschiedener intrazellulärer Enzyme zu testen, das Zwischenspiel regulatorischer Faktoren zu studieren und den Einfluß struktureller Abteilungsbildung oder von Membranbarrieren zu untersuchen. Anwendungsbeispiele werden gebracht für die Analyse von Übergangsparametern, für die Untersuchung des Musters enzymatischer Stoffwechselschritte während des Zellwachstums und für die Untersuchung der Wirkung von Cofaktoren oder von „Stoffwechselvorbelastungen“. Durch Einbeziehung einer Stickstoffkammer konnte die Methode auf Zellen angewendet werden, die für die glykolytische Reduktion von NAD⁺ anaerobe Bedingungen verlangen (z. B. L-Zellen, menschliches Astrocytom). Wird Glucose-6-phosphat durch Glucose-1-phosphat ersetzt, so wird die NAD⁺-Reduktion von 100 bis 200 msek bis auf 500 bis 1000 msek verzögert. Diese Zeit kann bei Anwesenheit von Glucose-1,6-phosphat (einem Coenzym für Phosphoglucomutase) verkürzt werden. Differenzen im Fließmuster der vorgenannten Reaktion der Phosphoglucomutase werden in pleiomorphen Populationen von L-Zellen gefunden. So ging z. B. Glucose-1-phosphat leichter in die Embden-Meyerhof-Reaktionsfolge ein in den größeren, sich nicht teilenden Individuen.

Vorinkubation mit Glycerin oder Xylit führt zu einer Verlängerung aller Parameter der Fluoreszenzübergänge, während cyklisches AMP und Äthionin das Gegenteil bewirken. Das Muster der Fluoreszenzübergänge ermöglicht eine Differenzierung zwischen reversiblen und irreversiblen Inhibitoren von LDH. So können durch schnelle Mikrofluorimetrie die frühen und späteren Phasen der Fluoreszenzübergänge in Teilschritte aufgelöst werden, die für den Ablauf intrazellulärer Vorgänge oder für Kontrollzustände charakteristisch sind.