引用本文： 唐彪, 段群欢. COPS3在肝癌中的表达. 中国普外基础与临床杂志, 2015, 22(12): 1507-1509. doi: 10.7507/1007-9424.20150391 复制
原发性肝癌（以下简称“肝癌”）是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其临床疗效欠佳。我国是肝癌高发国家，死亡率逐年升高[1]。目前人们对肝癌的发生机制仍不清楚，但普遍认为癌基因的激活和抑癌基因的失活是肝癌发生的基础。构成型光形态建成同源亚基3（COPS3）是构成型光形态建成9（COP9）信号复合体的第3个亚基，是一种蛋白激酶。近年来研究[2]证实，COPS3可分解p53蛋白，从而导致其下游基因的改变，引起基因组突变。COPS3蛋白在骨肉瘤组织中高表达，其在骨肉瘤中以原癌基因的形式发挥效应[3]。但是，COPS3在原发性肝癌发生和发展中的作用机制尚不清楚。本研究旨在研究COPS3在肝癌组织中的表达情况，为肝癌分子靶向治疗寻找新的分子靶标提供研究基础。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2010年1月至2014年6月期间于我院接受手术治疗的肝癌患者的临床病理资料保存完整的肝癌组织标本共30例，其中男16例，女14例；年龄35～73岁，（59.5±13.1）岁。所有病例术前均未行放疗、化疗。30例肝癌患者的外周血及肝癌组织呈HBsAg（+）。同时选取30例乙型肝炎肝硬变患者肝脏组织（肝脏穿刺组织和手术存档标本）及30例正常组织（肝移植病理检查存档标本）作为对照，所有的标本均经患者及其家属同意，并签署知情同意书。上述所有组织均由两位资深的病理科医师阅片明确诊断。
1.2 免疫组织化学方法检测各组织中COPS3蛋白的表达
1.2.1 方法
取新鲜组织标本，10%甲醛浸泡12 h后，用15% EDTA浸泡，其间每周更换EDTA溶液1次，3周左右时间，用大头针检查标本的脱钙情况，然后进行封蜡。连续切片，厚度4μm，贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片，60℃烘烤2 h。采用免疫组织化学SP法，兔抗人COPS3单克隆抗体购自Abcam公司，工作浓度1：100，SP免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物公司，实验步骤按试剂盒说明书进行。
1.2.2 结果判定
细胞内出现棕色或褐色颗粒者为染色阳性依据。根据Shimizu等[4]的标准，随机选取10个高倍视野，计算每1 000个细胞中染色细胞的数量。阳性细胞百分率=阳性细胞数/总细胞数×100%。根据染色细胞百分率计分标准：0分为≤10%，1分为11%～25%，2分为26%～50%，3分为51%～75%，4分为> 75%；染色强度的计分标准：无着色计为0分，浅棕色计为1分，棕色计为2分，深棕色计为3分。根据染色阳性细胞百分率的分值和染色强度的分值之和判断其结果：0分为（-），2～3分为（+），4分为（++），5～6分为（+++）。评分之和2分以上均为阳性。
1.3 -RT-PCR检测各组织中COPS3 mRNA的表达
将组织剪碎后提取总RNA，按照试剂盒说明书步骤进行RT-PCR检测，利用GeneSnap软件对成像进行分析。计算各组条带的灰度值，以GAPDH内参的表达作为对照。
1.4 统计学方法
采用SPSS 19.0软件包进行数据分析，计数资料采用百分率（%）表示，3组间比较采用F检验，2组间比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 COPS3蛋白在肝癌、肝硬变及正常肝组织中的表达情况
免疫组织化学染色结果见图 1。COPS3蛋白可表达于细胞核或细胞浆中，呈均质性或颗粒状着色，淡黄至棕褐色，在正常肝脏组织中几乎不表达，肝硬变组织中弱表达，肝癌组织中强表达。COPS3蛋白表达阳性率在肝癌组织中明显高于肝硬变组织（χ2=4.979，P=0.026）和正常肝组织（χ2=5.654，P=0.017），在肝硬变组织中与正常肝脏组织的比较差异无统计学意义（χ2=1.375，P=0.241）。在肝癌组织中，COPS3在细胞核中的表达阳性率明显高于其在细胞浆中的表达阳性率（χ2=6.674，P=0.009）。见表 1。
图1
COPS3蛋白在肝癌、肝硬变及正常肝组织中的表达（SP×200）。1A：正常肝组织；1B：肝硬变组织；1C：肝癌组织
表1
COPS3蛋白在肝癌、肝硬变及正常肝组织中的阳性表达情况〔例（%）〕
2.2 COPS3 mRNA在肝癌、肝硬变及正常肝组织中的表达情况
根据GeneSnap软件分析提示，肝癌组织中COPS3 mRNA的转录水平明显高于肝硬变和正常肝组织，差异有统计学意义（P < 0 05），见图 2。
图2
COPS3 mRNA在肝癌、肝硬变及正常肝组织中的表达情况。2A：定性结果。M：DNA marker；1：肝硬变；2：肝癌；3：正常肝组织。2B：半定量结果。与肝硬变组织和正常肝脏组织比较，* P < 0.05
3 讨论
肝癌是世界上恶性程度较高且治疗效果较差的恶性肿瘤之一。目前我国肝癌死亡率已处于恶性肿瘤死亡率的第2位并呈逐年上升趋势[1-2]，肝癌被认为是多基因、多步骤相互协同、相互作用的细胞癌变过程。COPS3是COP9信号复合体（CSN）的第3个亚基[5]。COP9是光介导发育过程中的重要调节因子[6]，在泛素-26S蛋白酶体介导的蛋白降解过程中发挥重要作用[7]。对Jun、p53、p27基因也具有调节作用[8-9]。目前研究证实，COPS3在骨肉瘤组织中高表达。Henriksen等[10]研究结果提示，23例骨肉瘤细胞系中10例存在COPS3扩增或过表达，3种出现泛素蛋白连接酶鼠双微粒体（MDM2）高表达，因此他认为COPS3、MDM与骨肉瘤的发生和发展有密切联系，但Yan等[11]研究发现，COPS3的扩增和p53的突变可同时存在于恶性骨肉瘤中，而且两者同时存在，在一定时间内可带来更严重的结果，同时导致染色体高度不稳性，这一研究结果对骨肉瘤的发生、发展以及早期诊断和治疗具有一定的潜在意义。2011年Yan等[9]报道了COPS3基因表达与肿瘤转移的关系，对65例骨肉瘤的样本（37例无转移，28例转移）进行COPS3免疫组织化学染色，57.1%（16/28）有转移的患者标本和18.9%（7/37）无转移患者标本表现为COPS3染色强阳性；COPS3惰性转移骨肉瘤细胞株（SAOS-2）和高转移骨肉瘤细胞株（HOS）之间的表达比较，HOS细胞株表现出较强的COPS3表达；siRNA抑制COPS3功能，能减少HOS细胞株的增殖和迁移，COPS3 MAPK信号通路下调，后者在骨肉瘤转移中起重要作用的一个基因，结果表明，过度表达的COPS3基因可能在骨肉瘤细胞转移中起重要作用。这些研究结果COPS3对骨肉瘤的发生、发展以及早期诊断和治疗具有潜在的意义。
目前对于COPS3与肝癌组织关系的文献报道极少。在本研究中我们利用免疫组织化学SP方法观察了COPS3在肝癌、肝硬变及正常肝组织中的表达，希望为下一步研究提供依据。结果表明，COPS3蛋白表达阳性率在肝癌组织中明显高于肝硬变组织及正常肝组织，差异具有统计学意义；COPS3蛋白在肝癌组织中主要表达于细胞核，而在正常肝组织中主要在细胞浆。肝癌组织中COPS3 mRNA的转录水平明显高于肝硬变、正常肝组织，差异具有统计学意义（P < 0.05），结果提示，COPS3在肝癌组织中表达水平和定位均发生改变，初步提示其可能参与了肝癌的发生和发展过程。上述研究结果提示，COPS3的表达和细胞内定位在正常肝组织、肝硬变和肝癌组织中存在不同，COPS3蛋白在肝癌中可能受到某些因子的刺激，发生基因转录和翻译水平的异常，导致表达水平上调和细胞分布改变。
综上所述，COPS3在肝癌组织中高表达，可能参与肝癌的发生、发展过程，本实验的结果也为深入研究COPS3基因在肝癌中作用提供了实验基础。
原发性肝癌（以下简称“肝癌”）是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其临床疗效欠佳。我国是肝癌高发国家，死亡率逐年升高[1]。目前人们对肝癌的发生机制仍不清楚，但普遍认为癌基因的激活和抑癌基因的失活是肝癌发生的基础。构成型光形态建成同源亚基3（COPS3）是构成型光形态建成9（COP9）信号复合体的第3个亚基，是一种蛋白激酶。近年来研究[2]证实，COPS3可分解p53蛋白，从而导致其下游基因的改变，引起基因组突变。COPS3蛋白在骨肉瘤组织中高表达，其在骨肉瘤中以原癌基因的形式发挥效应[3]。但是，COPS3在原发性肝癌发生和发展中的作用机制尚不清楚。本研究旨在研究COPS3在肝癌组织中的表达情况，为肝癌分子靶向治疗寻找新的分子靶标提供研究基础。
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2010年1月至2014年6月期间于我院接受手术治疗的肝癌患者的临床病理资料保存完整的肝癌组织标本共30例，其中男16例，女14例；年龄35～73岁，（59.5±13.1）岁。所有病例术前均未行放疗、化疗。30例肝癌患者的外周血及肝癌组织呈HBsAg（+）。同时选取30例乙型肝炎肝硬变患者肝脏组织（肝脏穿刺组织和手术存档标本）及30例正常组织（肝移植病理检查存档标本）作为对照，所有的标本均经患者及其家属同意，并签署知情同意书。上述所有组织均由两位资深的病理科医师阅片明确诊断。
1.2 免疫组织化学方法检测各组织中COPS3蛋白的表达
1.2.1 方法
取新鲜组织标本，10%甲醛浸泡12 h后，用15% EDTA浸泡，其间每周更换EDTA溶液1次，3周左右时间，用大头针检查标本的脱钙情况，然后进行封蜡。连续切片，厚度4μm，贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片，60℃烘烤2 h。采用免疫组织化学SP法，兔抗人COPS3单克隆抗体购自Abcam公司，工作浓度1：100，SP免疫组织化学试剂盒购自北京中杉金桥生物公司，实验步骤按试剂盒说明书进行。
1.2.2 结果判定
细胞内出现棕色或褐色颗粒者为染色阳性依据。根据Shimizu等[4]的标准，随机选取10个高倍视野，计算每1 000个细胞中染色细胞的数量。阳性细胞百分率=阳性细胞数/总细胞数×100%。根据染色细胞百分率计分标准：0分为≤10%，1分为11%～25%，2分为26%～50%，3分为51%～75%，4分为> 75%；染色强度的计分标准：无着色计为0分，浅棕色计为1分，棕色计为2分，深棕色计为3分。根据染色阳性细胞百分率的分值和染色强度的分值之和判断其结果：0分为（-），2～3分为（+），4分为（++），5～6分为（+++）。评分之和2分以上均为阳性。
1.3 -RT-PCR检测各组织中COPS3 mRNA的表达
将组织剪碎后提取总RNA，按照试剂盒说明书步骤进行RT-PCR检测，利用GeneSnap软件对成像进行分析。计算各组条带的灰度值，以GAPDH内参的表达作为对照。
1.4 统计学方法
采用SPSS 19.0软件包进行数据分析，计数资料采用百分率（%）表示，3组间比较采用F检验，2组间比较采用χ2检验。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 COPS3蛋白在肝癌、肝硬变及正常肝组织中的表达情况
免疫组织化学染色结果见图 1。COPS3蛋白可表达于细胞核或细胞浆中，呈均质性或颗粒状着色，淡黄至棕褐色，在正常肝脏组织中几乎不表达，肝硬变组织中弱表达，肝癌组织中强表达。COPS3蛋白表达阳性率在肝癌组织中明显高于肝硬变组织（χ2=4.979，P=0.026）和正常肝组织（χ2=5.654，P=0.017），在肝硬变组织中与正常肝脏组织的比较差异无统计学意义（χ2=1.375，P=0.241）。在肝癌组织中，COPS3在细胞核中的表达阳性率明显高于其在细胞浆中的表达阳性率（χ2=6.674，P=0.009）。见表 1。
图1
COPS3蛋白在肝癌、肝硬变及正常肝组织中的表达（SP×200）。1A：正常肝组织；1B：肝硬变组织；1C：肝癌组织
表1
COPS3蛋白在肝癌、肝硬变及正常肝组织中的阳性表达情况〔例（%）〕
2.2 COPS3 mRNA在肝癌、肝硬变及正常肝组织中的表达情况
根据GeneSnap软件分析提示，肝癌组织中COPS3 mRNA的转录水平明显高于肝硬变和正常肝组织，差异有统计学意义（P < 0 05），见图 2。
图2
COPS3 mRNA在肝癌、肝硬变及正常肝组织中的表达情况。2A：定性结果。M：DNA marker；1：肝硬变；2：肝癌；3：正常肝组织。2B：半定量结果。与肝硬变组织和正常肝脏组织比较，* P < 0.05
3 讨论
肝癌是世界上恶性程度较高且治疗效果较差的恶性肿瘤之一。目前我国肝癌死亡率已处于恶性肿瘤死亡率的第2位并呈逐年上升趋势[1-2]，肝癌被认为是多基因、多步骤相互协同、相互作用的细胞癌变过程。COPS3是COP9信号复合体（CSN）的第3个亚基[5]。COP9是光介导发育过程中的重要调节因子[6]，在泛素-26S蛋白酶体介导的蛋白降解过程中发挥重要作用[7]。对Jun、p53、p27基因也具有调节作用[8-9]。目前研究证实，COPS3在骨肉瘤组织中高表达。Henriksen等[10]研究结果提示，23例骨肉瘤细胞系中10例存在COPS3扩增或过表达，3种出现泛素蛋白连接酶鼠双微粒体（MDM2）高表达，因此他认为COPS3、MDM与骨肉瘤的发生和发展有密切联系，但Yan等[11]研究发现，COPS3的扩增和p53的突变可同时存在于恶性骨肉瘤中，而且两者同时存在，在一定时间内可带来更严重的结果，同时导致染色体高度不稳性，这一研究结果对骨肉瘤的发生、发展以及早期诊断和治疗具有一定的潜在意义。2011年Yan等[9]报道了COPS3基因表达与肿瘤转移的关系，对65例骨肉瘤的样本（37例无转移，28例转移）进行COPS3免疫组织化学染色，57.1%（16/28）有转移的患者标本和18.9%（7/37）无转移患者标本表现为COPS3染色强阳性；COPS3惰性转移骨肉瘤细胞株（SAOS-2）和高转移骨肉瘤细胞株（HOS）之间的表达比较，HOS细胞株表现出较强的COPS3表达；siRNA抑制COPS3功能，能减少HOS细胞株的增殖和迁移，COPS3 MAPK信号通路下调，后者在骨肉瘤转移中起重要作用的一个基因，结果表明，过度表达的COPS3基因可能在骨肉瘤细胞转移中起重要作用。这些研究结果COPS3对骨肉瘤的发生、发展以及早期诊断和治疗具有潜在的意义。
目前对于COPS3与肝癌组织关系的文献报道极少。在本研究中我们利用免疫组织化学SP方法观察了COPS3在肝癌、肝硬变及正常肝组织中的表达，希望为下一步研究提供依据。结果表明，COPS3蛋白表达阳性率在肝癌组织中明显高于肝硬变组织及正常肝组织，差异具有统计学意义；COPS3蛋白在肝癌组织中主要表达于细胞核，而在正常肝组织中主要在细胞浆。肝癌组织中COPS3 mRNA的转录水平明显高于肝硬变、正常肝组织，差异具有统计学意义（P < 0.05），结果提示，COPS3在肝癌组织中表达水平和定位均发生改变，初步提示其可能参与了肝癌的发生和发展过程。上述研究结果提示，COPS3的表达和细胞内定位在正常肝组织、肝硬变和肝癌组织中存在不同，COPS3蛋白在肝癌中可能受到某些因子的刺激，发生基因转录和翻译水平的异常，导致表达水平上调和细胞分布改变。
综上所述，COPS3在肝癌组织中高表达，可能参与肝癌的发生、发展过程，本实验的结果也为深入研究COPS3基因在肝癌中作用提供了实验基础。
