引用本文: 张磊, 朱骏, 朱晓亮, 宋晓静, 岳平, 朱克祥, 周文策, 李汛. 急性胰腺炎导致家兔Oddi括约肌一氧化氮合成酶和血管活性肠肽阳性神经细胞的减少. 中国普外基础与临床杂志, 2014, 21(4): 420-424. doi: 10.7507/1007-9424.20140103 复制
Oddi括约肌是位于胆管和十二指肠交界处的神经肌肉复合结构,表现出与基本电节律叠加的阶段性的收缩。正常情况下,Oddi括约肌负责调节胰胆管树的压力,决定排入十二指肠的胆汁和胰液的流动方向和速度,转移胆汁进入胆囊,并防止液体从十二指肠回流到肝脏和胰腺。Oddi括约肌功能障碍是指Oddi括约肌异常收缩而导致的胆汁和胰液通过乏特壶腹部的流动受阻[1-3]。Oddi括约肌功能障碍可能是由于胆结石通过后造成乏特壶腹部的结构狭窄或由于先天性肥厚括约肌或括约肌张力过高造成对激素和神经刺激的过度敏感[3];胆胰疾病可致Oddi括约肌功能障碍的发病率明显增高[4];许多胆道疾病会引起Oddi括约肌活动功能的变化[5-8]。急性胰腺炎是一种病理生理学尚存争议的多病因疾病并伴随不可预测的临床演变。临床上该病分为轻症和重症急性胰腺炎[9],该分型是基于其临床现、实验室参数、多器官功能衰竭的发生以及CT增强扫描的结果[10-11]。尽管对该疾病有了更好的了解,以及放射学、组织病理学、细菌学和重症监护方面的技术创新,但重症急性胰腺炎(SAP)仍然有2%~20%的死亡率[10, 12]。SAP常导致多器官功能障碍综合征的发生[13]。关于兔SAP时其对Oddi括约肌功能的影响尚未见报道。本研究拟通过检测兔急性胰腺炎模型中Oddi括约肌中神经细胞的变化来阐述其与SAP的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物、材料及主要试剂
12周龄SPF级新西兰白兔购自兰州大学实验动物中心,12只,兔龄3~4个月,雌性,体质量2.5 kg左右。实验动物采用随机数字表法随机分成对照组(n=6)和SAP组(n=6)2组。每只白兔单独喂养在兰州大学第一医院SPF级动物房内,所有白兔均自由进食和饮水。实验用主要试剂:磷酸钠,磷酸氢钠,柠檬酸,乙酰丙嗪、赛拉嗪、氯胺酮和牛黄胆酸钠购自Sigma公司(美国);S-10(ab66028)、一氧化氮合成酶(NOS)抗体(ab1376)和血管活性肠肽(VIP)抗体(ab6184)购自Abcam公司(美国);胰酶购自上海英骏生物技术有限公司;链亲和素-过氧化物酶、脱脂奶粉、DAB显色液和苏木精购自北京中杉金桥公司;3%甲醇双氧水、乙醇、二甲苯和中性树胶购自南京化工试剂有限公司;莱卡DMI-3000B倒置荧光显微镜(北京中显恒业仪器仪表有限公司)。
1.2 兔SAP模型的建立
实验动物经肌肉注射10 mg/kg乙酰丙嗪(配制10 min内)、10 mg/kg赛拉嗪和50 mg/kg氯胺酮进行麻醉,在手术过程中静脉滴注半剂量赛拉嗪和氯胺酮以维持麻醉状态并用氧气面罩自主呼吸。消毒后,取兔腹部正中8.0 cm长切口入腹,在幽门以远约20 cm处找到胰管,打开十二指肠后,将一连接24号针头的导管逆行插入胰管,用手动压力将5%的牛黄胆酸钠溶液(1 mL/kg体质量)于1 min内推注入胰管内,然后缝合肠管切口并关闭腹壁,SAP模型建立完成。对照组动物只进行同样的开腹手术处理,但不逆行推注牛黄胆酸钠溶液。
1.3 标本采集
于模型建立术后8 h处死对照组和SAP组动物,取胰腺组织和Oddi括约肌组织,用10%甲醛溶液固定、石蜡包埋备用。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 胰腺组织的病理学改变观察
取胰腺组织石蜡切片行HE染色,在光镜下观察其病理学改变。
1.4.2 Oddi括约肌中NOS和VIP阳性神经细胞检测
采用免疫组化染色方法(S-100双染色),按试剂盒说明书操作。取Oddi括约肌组织石蜡切片常规脱蜡,再用胰酶消化处理,然后水化,用3%甲醇双氧水室温阻断10 min,0.01 mmol/L(pH 7.2)磷酸盐缓冲液洗5 min 3次;加入0.01 mmol/L(pH 6.0)柠檬酸缓冲液置微波炉中修复抗原;自然冷却后用5%脱脂奶粉进行抗原封闭;然后滴加配制好的一抗4℃过夜,洗5 min 3次;再滴加生物素标记的二抗,室温孵育10 min;洗5 min 3次;滴加链亲和素-过氧化物酶,室温10 min;洗5 min 3次;新鲜配制的DAB溶液显色3~10 min;自来水冲洗,苏木精浅染细胞核。自来水冲洗返蓝,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固,于倒置显微镜下检测阳性细胞的数量和分部。每张切片在200倍放大倍数下随机观察5个视野,计数其NOS或VIP阳性细胞数以及总细胞数,然后计算阳性细胞百分率。
1.5 统计学方法
采用SSPS 17.0软件进行统计学分析。计量指标以均数±标准差(
2 结果
2.1 胰腺组织的病理学改变
对照组胰腺组织未观察到明显的改变(图 1A);SAP组的胰腺组织出现坏死、萎缩,结构破坏,有大量炎症细胞分布于小叶间及小叶内(图 1B)。
2.2 Oddi括约肌肌间神经丛的分布情况
NOS或VIP的S-100双染色可清楚地显示NOS和VIP在Oddi括约肌肌间神经丛的精确定位,神经节的雪旺细胞被S-100标记为深蓝色,而NOS或VIP阳性神经节则呈现棕黄色(图 2)。正常者(对照组)的神经丛弥散分布在环形肌内(图 3A)和胰管及胆总管(图 3B)之间隔膜内。大多数肌间神经丛的神经细胞体为圆形或椭圆形,呈现大而偏心的细胞核;在细胞质中观察到NOS免疫组化染色阳性颗粒(图 4A),而VIP免疫组化染色阳性物质存在于细胞质和少数短的神经轴突(图 4B)。同时,在Oddi括约肌肌肉层中可见许多神经纤维,有些为NOS阳性神经纤维(图 4C),但VIP阳性神经纤维更丰富(图 4D),在神经节内,神经细胞体的周围也可见VIP阳性神经纤维(图 4E)。
2.3 SAP组及对照组Oddi括约肌中NOS和VIP阳性神经细胞比例
SAP组S-100免疫组化染色阳性的神经细胞的平均密度为(12.68±1.23)个/mm2,与对照组的(14.27±1.74)个/mm2相似。SAP组肌间神经丛神经细胞的(11.26±0.93)%(6.33%~18.52%)为NOS阳性细胞,(28.62±2.83)%(19.44%~46.87%)为VIP阳性细胞;对照组肌间神经丛神经细胞的(45.83±2.17)%(38.67%~54.38%)为NOS阳性细胞,(52.46±2.47)%(43.72%~65.59%)为VIP阳性细胞;另外,有(22.73±1.95)%的神经细胞NOS和VIP均呈阳性。SAP组的NOS和VIP阳性神经细胞的比例均明显低于对照组(P < 0.01)。
3 讨论
本研究清楚地观察到了兔Oddi括约肌的基本结构,特别是有关平滑肌和神经元素的分布方面。兔Oddi括约肌主要由环形肌组成,纵向肌肉并不发达,肌间神经丛弥散分布于圆形肌肉中。十二指肠的肌纤维与Oddi括约肌相连,而肌间神经丛并没有观察到括约肌和十二指肠之间的连续性。这一发现与Simula等[14]在负鼠中观察到的肌间神经丛在括约肌和十二指肠之间存在连续性的情况不同。负鼠的括约肌由环形肌和纵肌组成,肌间神经丛位于环形肌和纵肌之间;Oddi括约肌完整的肌间神经丛与粘连的十二指肠连接能在整体组织染色中观察到。
NO是Oddi括约肌中一个重要的非去甲肾上腺素、非胆碱(NANC)神经递质[15-17]。通过使用Nc-硝基-L-精氨酸或N*-硝基-L-精氨酸甲酯(NOS的竞争性抑制剂)抑制内源性NO的产生可以增加猪、人和兔括约肌的收缩[15]。有人[18-20]还指出,在Oddi括约肌使用硝普钠或硝酸甘油(外源性NO)可导致其收缩力和电活动均下降。这些研究结果表明,内源性和外源性NO均可减少Oddi括约肌的收缩和电活动。这些现象表明,在大多数物种中,NO由肠溶性神经元释放作为一个内在的肌肉收缩抑制剂,但是最终的生理效果却在不同类型的Oddi括约肌中出现矛盾。如果Oddi括约肌的行为就像一个泵(Ⅰ类),那么抑制蠕动可能会降低胆汁流量;相反,如果Oddi括约肌的作用主要是阀门(Ⅱ类),那么抑制蠕动就会增加胆汁流量。本研究结果显示,NOS阳性神经细胞和神经纤维分布在兔的Oddi括约肌;约46%的肌间神经细胞为NOS阳性;大多数NOS阳性神经细胞呈圆形,NOS阳性颗粒存在于细胞质中;与对照组相比,SAP组Oddi括约肌中NOS阳性神经细胞的比例显着降低。该结果提示,SAP时Oddi括约肌无法充分松弛,进而导致胆汁和胰液不能正常排出。
除NO外,VIP是另一种已被证明存在于胃肠道各个区域的神经递质[21-24],并且呈剂量依赖性地诱导猫Oddi括约肌松弛[25]。在本研究中观察到VIP阳性神经细胞和神经纤维存在于Oddi括约肌中;在Oddi括约肌中,NOS阳性神经细胞中约有23%的神经细胞同时VIP也呈阳性。该结果和Simula等[14]观察到的负鼠Oddi括约肌中NOS和VIP的结果相似。
本研究观察到,在SAP组中,Oddi括约肌中NOS或VIP阳性的神经细胞比例显著减少,且在肠黏膜和Oddi括约肌中观察到明显的淋巴细胞浸润和纤维化。该结果提示,SAP可引起Oddi括约肌中NOS和VIP阳性神经细胞的比例明显减少,从而导致了Oddi括约肌功能的受损。
Oddi括约肌是位于胆管和十二指肠交界处的神经肌肉复合结构,表现出与基本电节律叠加的阶段性的收缩。正常情况下,Oddi括约肌负责调节胰胆管树的压力,决定排入十二指肠的胆汁和胰液的流动方向和速度,转移胆汁进入胆囊,并防止液体从十二指肠回流到肝脏和胰腺。Oddi括约肌功能障碍是指Oddi括约肌异常收缩而导致的胆汁和胰液通过乏特壶腹部的流动受阻[1-3]。Oddi括约肌功能障碍可能是由于胆结石通过后造成乏特壶腹部的结构狭窄或由于先天性肥厚括约肌或括约肌张力过高造成对激素和神经刺激的过度敏感[3];胆胰疾病可致Oddi括约肌功能障碍的发病率明显增高[4];许多胆道疾病会引起Oddi括约肌活动功能的变化[5-8]。急性胰腺炎是一种病理生理学尚存争议的多病因疾病并伴随不可预测的临床演变。临床上该病分为轻症和重症急性胰腺炎[9],该分型是基于其临床现、实验室参数、多器官功能衰竭的发生以及CT增强扫描的结果[10-11]。尽管对该疾病有了更好的了解,以及放射学、组织病理学、细菌学和重症监护方面的技术创新,但重症急性胰腺炎(SAP)仍然有2%~20%的死亡率[10, 12]。SAP常导致多器官功能障碍综合征的发生[13]。关于兔SAP时其对Oddi括约肌功能的影响尚未见报道。本研究拟通过检测兔急性胰腺炎模型中Oddi括约肌中神经细胞的变化来阐述其与SAP的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物、材料及主要试剂
12周龄SPF级新西兰白兔购自兰州大学实验动物中心,12只,兔龄3~4个月,雌性,体质量2.5 kg左右。实验动物采用随机数字表法随机分成对照组(n=6)和SAP组(n=6)2组。每只白兔单独喂养在兰州大学第一医院SPF级动物房内,所有白兔均自由进食和饮水。实验用主要试剂:磷酸钠,磷酸氢钠,柠檬酸,乙酰丙嗪、赛拉嗪、氯胺酮和牛黄胆酸钠购自Sigma公司(美国);S-10(ab66028)、一氧化氮合成酶(NOS)抗体(ab1376)和血管活性肠肽(VIP)抗体(ab6184)购自Abcam公司(美国);胰酶购自上海英骏生物技术有限公司;链亲和素-过氧化物酶、脱脂奶粉、DAB显色液和苏木精购自北京中杉金桥公司;3%甲醇双氧水、乙醇、二甲苯和中性树胶购自南京化工试剂有限公司;莱卡DMI-3000B倒置荧光显微镜(北京中显恒业仪器仪表有限公司)。
1.2 兔SAP模型的建立
实验动物经肌肉注射10 mg/kg乙酰丙嗪(配制10 min内)、10 mg/kg赛拉嗪和50 mg/kg氯胺酮进行麻醉,在手术过程中静脉滴注半剂量赛拉嗪和氯胺酮以维持麻醉状态并用氧气面罩自主呼吸。消毒后,取兔腹部正中8.0 cm长切口入腹,在幽门以远约20 cm处找到胰管,打开十二指肠后,将一连接24号针头的导管逆行插入胰管,用手动压力将5%的牛黄胆酸钠溶液(1 mL/kg体质量)于1 min内推注入胰管内,然后缝合肠管切口并关闭腹壁,SAP模型建立完成。对照组动物只进行同样的开腹手术处理,但不逆行推注牛黄胆酸钠溶液。
1.3 标本采集
于模型建立术后8 h处死对照组和SAP组动物,取胰腺组织和Oddi括约肌组织,用10%甲醛溶液固定、石蜡包埋备用。
1.4 检测指标及方法
1.4.1 胰腺组织的病理学改变观察
取胰腺组织石蜡切片行HE染色,在光镜下观察其病理学改变。
1.4.2 Oddi括约肌中NOS和VIP阳性神经细胞检测
采用免疫组化染色方法(S-100双染色),按试剂盒说明书操作。取Oddi括约肌组织石蜡切片常规脱蜡,再用胰酶消化处理,然后水化,用3%甲醇双氧水室温阻断10 min,0.01 mmol/L(pH 7.2)磷酸盐缓冲液洗5 min 3次;加入0.01 mmol/L(pH 6.0)柠檬酸缓冲液置微波炉中修复抗原;自然冷却后用5%脱脂奶粉进行抗原封闭;然后滴加配制好的一抗4℃过夜,洗5 min 3次;再滴加生物素标记的二抗,室温孵育10 min;洗5 min 3次;滴加链亲和素-过氧化物酶,室温10 min;洗5 min 3次;新鲜配制的DAB溶液显色3~10 min;自来水冲洗,苏木精浅染细胞核。自来水冲洗返蓝,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固,于倒置显微镜下检测阳性细胞的数量和分部。每张切片在200倍放大倍数下随机观察5个视野,计数其NOS或VIP阳性细胞数以及总细胞数,然后计算阳性细胞百分率。
1.5 统计学方法
采用SSPS 17.0软件进行统计学分析。计量指标以均数±标准差(
2 结果
2.1 胰腺组织的病理学改变
对照组胰腺组织未观察到明显的改变(图 1A);SAP组的胰腺组织出现坏死、萎缩,结构破坏,有大量炎症细胞分布于小叶间及小叶内(图 1B)。
2.2 Oddi括约肌肌间神经丛的分布情况
NOS或VIP的S-100双染色可清楚地显示NOS和VIP在Oddi括约肌肌间神经丛的精确定位,神经节的雪旺细胞被S-100标记为深蓝色,而NOS或VIP阳性神经节则呈现棕黄色(图 2)。正常者(对照组)的神经丛弥散分布在环形肌内(图 3A)和胰管及胆总管(图 3B)之间隔膜内。大多数肌间神经丛的神经细胞体为圆形或椭圆形,呈现大而偏心的细胞核;在细胞质中观察到NOS免疫组化染色阳性颗粒(图 4A),而VIP免疫组化染色阳性物质存在于细胞质和少数短的神经轴突(图 4B)。同时,在Oddi括约肌肌肉层中可见许多神经纤维,有些为NOS阳性神经纤维(图 4C),但VIP阳性神经纤维更丰富(图 4D),在神经节内,神经细胞体的周围也可见VIP阳性神经纤维(图 4E)。
2.3 SAP组及对照组Oddi括约肌中NOS和VIP阳性神经细胞比例
SAP组S-100免疫组化染色阳性的神经细胞的平均密度为(12.68±1.23)个/mm2,与对照组的(14.27±1.74)个/mm2相似。SAP组肌间神经丛神经细胞的(11.26±0.93)%(6.33%~18.52%)为NOS阳性细胞,(28.62±2.83)%(19.44%~46.87%)为VIP阳性细胞;对照组肌间神经丛神经细胞的(45.83±2.17)%(38.67%~54.38%)为NOS阳性细胞,(52.46±2.47)%(43.72%~65.59%)为VIP阳性细胞;另外,有(22.73±1.95)%的神经细胞NOS和VIP均呈阳性。SAP组的NOS和VIP阳性神经细胞的比例均明显低于对照组(P < 0.01)。
3 讨论
本研究清楚地观察到了兔Oddi括约肌的基本结构,特别是有关平滑肌和神经元素的分布方面。兔Oddi括约肌主要由环形肌组成,纵向肌肉并不发达,肌间神经丛弥散分布于圆形肌肉中。十二指肠的肌纤维与Oddi括约肌相连,而肌间神经丛并没有观察到括约肌和十二指肠之间的连续性。这一发现与Simula等[14]在负鼠中观察到的肌间神经丛在括约肌和十二指肠之间存在连续性的情况不同。负鼠的括约肌由环形肌和纵肌组成,肌间神经丛位于环形肌和纵肌之间;Oddi括约肌完整的肌间神经丛与粘连的十二指肠连接能在整体组织染色中观察到。
NO是Oddi括约肌中一个重要的非去甲肾上腺素、非胆碱(NANC)神经递质[15-17]。通过使用Nc-硝基-L-精氨酸或N*-硝基-L-精氨酸甲酯(NOS的竞争性抑制剂)抑制内源性NO的产生可以增加猪、人和兔括约肌的收缩[15]。有人[18-20]还指出,在Oddi括约肌使用硝普钠或硝酸甘油(外源性NO)可导致其收缩力和电活动均下降。这些研究结果表明,内源性和外源性NO均可减少Oddi括约肌的收缩和电活动。这些现象表明,在大多数物种中,NO由肠溶性神经元释放作为一个内在的肌肉收缩抑制剂,但是最终的生理效果却在不同类型的Oddi括约肌中出现矛盾。如果Oddi括约肌的行为就像一个泵(Ⅰ类),那么抑制蠕动可能会降低胆汁流量;相反,如果Oddi括约肌的作用主要是阀门(Ⅱ类),那么抑制蠕动就会增加胆汁流量。本研究结果显示,NOS阳性神经细胞和神经纤维分布在兔的Oddi括约肌;约46%的肌间神经细胞为NOS阳性;大多数NOS阳性神经细胞呈圆形,NOS阳性颗粒存在于细胞质中;与对照组相比,SAP组Oddi括约肌中NOS阳性神经细胞的比例显着降低。该结果提示,SAP时Oddi括约肌无法充分松弛,进而导致胆汁和胰液不能正常排出。
除NO外,VIP是另一种已被证明存在于胃肠道各个区域的神经递质[21-24],并且呈剂量依赖性地诱导猫Oddi括约肌松弛[25]。在本研究中观察到VIP阳性神经细胞和神经纤维存在于Oddi括约肌中;在Oddi括约肌中,NOS阳性神经细胞中约有23%的神经细胞同时VIP也呈阳性。该结果和Simula等[14]观察到的负鼠Oddi括约肌中NOS和VIP的结果相似。
本研究观察到,在SAP组中,Oddi括约肌中NOS或VIP阳性的神经细胞比例显著减少,且在肠黏膜和Oddi括约肌中观察到明显的淋巴细胞浸润和纤维化。该结果提示,SAP可引起Oddi括约肌中NOS和VIP阳性神经细胞的比例明显减少,从而导致了Oddi括约肌功能的受损。