引用本文： 毕继旺, 刘冰, 马媛媛, 杨跃. 组蛋白去乙酰化酶 9 表达水平与肺鳞癌不良预后相关性研究. 中国胸心血管外科临床杂志, 2020, 27(6): 649-656. doi: 10.7507/1007-4848.202001069 复制
在全球范围内，肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1-2]。最新数据显示，我国 2015 年肺癌新发病例 78.7 万例，死亡病例 63.1 万例，位居恶性肿瘤之首[3]。根据组织学类型，肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者占全部肺癌的 85% 左右。肺鳞状细胞癌（鳞癌）是非小细胞肺癌的主要类型之一，约占全部肺癌患者的 25%[4]。早期肺鳞癌以手术治疗为主，辅以放化疗；对于晚期肺鳞癌，则以放化疗为主。靶向药物的出现极大改善了肺腺癌的预后，但由于基因突变谱不同于肺腺癌，肺鳞癌患者中表皮生长因子受体（EGFR）基因突变和中间变性淋巴瘤微酶（ALK）基因融合等并不常见，这导致肺鳞癌缺乏有效的治疗靶点[5]。近年来，针对免疫检查点程序性死亡受体 1（PD-1）/PD-L1等的单克隆抗体的应用显著改善了部分晚期肺鳞癌的预后，但总体有效率仅约为 20%[6-7]。因此，寻找影响肺鳞癌预后的分子，并据此开发新的治疗靶点对于提高肺鳞癌治疗效果十分重要。
为寻找肺鳞癌新的有效治疗靶点，本实验室前期通过对 11 对 LUSC 原发肿瘤及对应患者来源的异种移植模型（patients derived xenografts，PDXs）进行全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）和全外显子组测序（whole exosome sequencing，WES）[8]，并结合 TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库和 COSMIC（Catalogue of Somatic Mutations in Cancer）数据库等，筛选出 56 个携带高频单碱基变异（single nucleotide variations，SNVs）或拷贝数变异（copy number variations，CNVs）的基因，并进一步采用靶向测序在 80 例肺鳞癌标本内检测其突变情况，结果显示组蛋白去乙酰化酶 9（HDAC9）基因在肺鳞癌内呈高频扩增。
表观遗传异常改变是肿瘤的一大特征[9]，而乙酰化修饰是一种重要的表观遗传调控方式。组蛋白乙酰化酶（HATs）和HDACs 共同调节组蛋白的乙酰化修饰，其中 HDACs 通过与其它分子形成复合物催化移除组蛋白 N 末端赖氨酸残基上的乙酰基团，促使组蛋白与 DNA 结合，从而发挥转录抑制作用。文献[10]报道 HDACs 可抑制抑癌基因的表达或调节促癌信号通路中关键分子的表达而促进肿瘤发生。HDAC9 是Ⅱ型 HDAC 分子，与多种恶性肿瘤的增殖转移相关[11-14]，但 HDAC9 与肺鳞癌的关系尚未明确。本研究旨在通过检测 HDAC9 在肺鳞癌组织中的表达水平，分析其与肺鳞癌临床病理特征及预后的相关性，并探究其对肺鳞癌细胞增殖的影响，为将来进一步开发治疗靶点打下基础。
1 资料与方法
1.1 临床资料与组织标本
收集 2010 年 7 月至 2014 年 4 月期间于北京大学肿瘤医院胸外二科进行手术切除的 129 例肺鳞癌患者组织标本及其临床资料。入选标准：（1）术前未接受任何治疗；（2）术后经过组织病理诊断属于肺鳞癌；（3）不合并身体其它部位的恶性肿瘤且无其它恶性肿瘤史。排除标准：除单纯肺鳞癌以外的其它类型，如腺鳞癌等各种混合癌均不纳入。本组患者男 118 例、女 11 例，中位年龄 61（37～79）岁；肿瘤分化程度为高中分化 58 例，低分化 71 例；肿瘤大小<3 cm 37 例，≥3 cm 92 例；淋巴结阳性 34 例，淋巴结阴性 95 例；胸膜侵犯 22 例。59 例患者行术后辅助治疗（化疗 54 例，放疗 3 例，同步放化疗 2 例）。按照国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，UICC）于 2009 年颁布的《肺癌 TNM 分期标准（第 7 版）》对患者进行分期[15]。
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学染色
129 例肺鳞癌组织标本均由北京大学肿瘤医院病理科常规固定、石蜡包埋、切片。5 μm 厚的石蜡病理切片，65 ℃ 烤片 60 min，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后，经柠檬酸钠抗原修复液（pH 6.0）（中杉金桥 ZLI-9064）进行高压热修复 5 min，3% H2O2 室温孵育 10 min 灭活内源性过氧化物酶，山羊血清（中杉金桥 ZLI-9022）室温湿盒内封闭 60 min，HDAC9 一抗（Abcam 兔抗人重组单克隆抗体 ab109446 1∶1 000）4℃ 湿盒内过夜孵育，辣根过氧化物酶标记的二抗（中杉金桥 PV-6000）室温湿盒内孵育 45 min，DAB 显色液（中杉金桥 ZLI-9018）显色，苏木素复染 5 min。
1.2.2 免疫组织化学结果判读
每张切片随机选取 10 个高倍（400×）视野，每个视野计数 100 个细胞，根据细胞染色强度和阳性细胞比例评判实验结果。所有染色结果均由两位病理医生分别在没有事先了解患者信息的情况下给出分数，然后在讨论后达成共识。对 HDAC9 的着色强度和阳性细胞百分比进行评分。根据着色强度分级为 0（无染色）、1（轻度染色）、2（中度染色）、3（强染色）。根据着色肿瘤细胞的百分比，评分如下：0（<25%）、1（25%～49%）、2（50%～74%）、3（≥75%）。将两得分相乘得到最终评分，高表达（≥6）或低表达（<6）。
1.2.3 细胞培养
MEM 培养基、胎牛血清、Sodium Pyruvate、MEM NEAA、胰酶均采购自美国 GIBCO 公司。肺鳞癌细胞系 EBC-1 采用 MEM 培养基（含 10% 胎牛血清，10% Sodium Pyruvate，10% MEM NEAA，1% 青链霉素双抗）于 37℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养。当细胞进入对数生长期（细胞密度 80% 左右）时，用胰酶消化贴壁细胞，离心后用新鲜培养基重悬，进行后续传代或铺板转染实验。
1.2.4 CRISPR/dCas9 转录激活系统及质粒构建
CRISPR/dCas9 转录激活系统［lentiSAM v2（Puro）& lentiMPH v2（Neo）］由 Adam Karpf 实验室通过非营利性组织 Addgene 平台赠与（Addgene plasmid # 92062；
1.2.5 细胞转染
Lipo3000 转染试剂盒购自 Invitrogen 公司。转染前 1 d，将细胞铺于 6 孔板中，铺板密度为 50% 左右。铺板后第 2 d，按照 Lipo3000 转染试剂盒说明书进行细胞转染。细胞转染 24 h 后，收集细胞进行后续细胞实验；细胞转染 48 h 后，利用实时荧光定量 PCR（real-time fluorogentic quantitative polymerase chain reaction，qPCR）和蛋白质免疫印迹（Western Blotting，WB）实验对转染效率进行验证。
1.2.6 实时荧光定量 PCR
收集转染 48 h 后的细胞，按照 Trizol（Invitrogen）法提取细胞总 RNA，并按 TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒（#AE301-02，Transgene Biotech）说明书用 Random Primer 对 2 μg 总 RNA 进行反转录合成 cDNA。按照 GoTaq qPCR Master Mix 试剂盒（#A6001，Promega）说明书进行 PCR 反应，PCR 反应条件为 95℃ 预变性 5 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，共 45 个循环；融解曲线反应条件为 95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s。以 β-ACTIN 为内参。用 2-ΔΔCt 法计算相对表达量。β-ACTIN、HDAC9 的引物序列如下：β-ACTIN 引物序列 F: TTAGTTGCGTTACACCCTTT，R: ACCTTCACCGTTCCAGTTT；HDAC9 引物序列 F: TGATGACATTGGCTGATGG，R: CTGCTTAGAATTTTTAAGAGAACTT。实验至少重复 3 次。
1.2.7 蛋白质免疫印迹实验
收集转染 48 h 后的细胞，加入 RIPA（strong）蛋白裂解液（含 Cocktail 蛋白酶抑制剂）裂解细胞，提取细胞总蛋白，利用 BCA 法测定蛋白浓度。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，将等量 30 μg 变性后样品经 8% 的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白，而后将胶内蛋白电转至硝酸纤维素膜上。5% 脱脂奶粉室温封闭 1 h，一抗［HDAC9（Abcam ab109446）1∶10 000，GAPDH（CST #97166）1∶10 000］4℃ 孵育过夜，TBST 缓冲液洗膜后相应二抗（1∶10 000）室温孵育 1 h，TBST 洗膜后进行化学发光显色。实验至少重复 3 次。
1.2.8 CCK8 细胞增殖实验
CCK8 细胞增殖与毒性检测试剂盒购自日本 Dojindo 公司。收集转染 24 h 后的细胞，每孔 5 000 个细胞均匀接种于 96 孔板中，体积 100 μL，每组设置 3 个复孔，5 个观察时间点，分别于 0 h、24 h、48 h、72 h、96 h 加入 CCK8 试剂后 37℃ 培养箱孵育 2 h，后于酶标仪上测定 450 nm 的光密度值。0 h 孔在接种细胞后直接加入 10 μL CCK8 试剂孵育 2 h 后测光密度值，其它孔在加入 CCK8 试剂孵育前更换新鲜培养基 100 μL，再加入 10 μL CCK8 试剂孵育 2 h 后测光密度值。根据各时间点与 0 h 平均光密度值的差值绘制增殖曲线。实验至少重复 3 次。
1.2.9 克隆形成实验
收集转染 24 h 后的细胞，每孔 1 000 个细胞均匀接种于 6 孔板，培养基 2 mL，每组设置 3 个复孔，37℃ 培养箱内培养 9 d。弃去培养基，磷酸盐缓冲液洗 1 次，4% 多聚甲醛室温固定 10 min，0.1% 结晶紫水溶液室温染色 10 min，去离子水洗去多余染液，室温干燥后拍照。
1.3 统计学分析
采用 IBM SPSS 24.0（Chicago，USA）软件进行统计学分析。分类资料采用 χ2 检验，采用 Kaplan-Meier 法进行生存分析并采用 log-rank 检验方法进行显著性检验，检验水准 α=0.05。采用单因素和多因素 Cox 比例风险回归模型分析影响患者总生存期（overall survival，OS）的独立预测因子，多因素 Cox 比例风险回归模型纳入的变量为单因素 Cox 分析中 P<0.100 的变量。
1.4 伦理审查
本研究获得北京大学肿瘤医院医学伦理委员会批准（批准号：2018KT43）。所有患者术前均签署知情同意书。
2 结果
2.1 HDAC9 蛋白在肺鳞癌组织中的表达及其与临床病理特征的相关性
HDAC9 蛋白于细胞核中表达，阳性染色细胞排列呈巢状，周围被结缔组织分割（图 1）。在全部染色 129 例肺鳞癌患者中，39 例（30.2%）呈低表达，90 例（69.8%）呈高表达。采用 χ2 检验分析 129 例肺鳞癌组织中 HDAC9 表达水平与患者的临床病理特征之间的相关性，发现 HDAC9 表达水平与肿瘤分化程度（P=0.035）、肿瘤大小（P=0.041）、淋巴结转移情况（P=0.013）相关，而与年龄、性别、吸烟史、脉管癌栓、辅助治疗情况无明确相关性（表 1）。
图1
HDAC9 免疫组化染色结果示意图（×100 倍）
a：无染色；b：轻度染色；c：中度染色；d：强染色
表1
HDAC9 在 129 例肺鳞癌患者中的表达情况及其与其他临床病理特征的关联［例/例（%）］
2.2 HDAC9 表达水平与肺鳞癌患者总生存的 Kaplan-Meier 生存分析
在线基因表达分析工具 GEPIA[16]（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）（
图2
HDAC9 表达水平与肺鳞癌患者总生存期的 Kaplan-Meier 生存分析曲线
a：HDAC9 在转录水平的 Kaplan-Meier 生存分析曲线；b：HDAC9 在蛋白水平的 Kaplan-Meier 生存分析曲线
2.3 肺鳞癌患者预后的单因素和多因素分析
采用 Cox 比例风险回归模型分析肺鳞癌预后的影响因素，单因素分析发现脉管癌栓（P=0.006）、肿瘤分化程度（P=0.005）、肿瘤大小（P=0.027）、淋巴结转移情况（P=0.036）及 HDAC9 表达水平（P=0.032）是影响患者预后的因素；多因素分析显示，肿瘤分化程度（P=0.003）、肿瘤大小（P=0.003）、淋巴结转移情况（P=0.002）及 HDAC9 表达水平（P=0.023）是患者预后的独立预测因子（表 2）。
表2
肺鳞癌患者总生存单因素和多因素 Cox 比例风险回归模型分析
2.4 转录激活 HDAC9 促进肺鳞癌细胞系 EBC-1 增殖
为进一步探究 HDAC9 分子对肺鳞癌增殖的影响，应用 CRISPR/dCas9 转录激活系统激活肺鳞癌细胞系 EBC-1 内 HDAC9 基因的转录并观察细胞增殖表型的改变。首先，在 EBC-1 细胞中分别转染插入 sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3 的 CRISPR/dCas9 转录激活系统以挑选最佳 sgRNA，利用 qPCR 法在 mRNA 水平检测 HDAC9 基因转录激活效率（图 3a），其中 sgRNA2 使 HDAC9 转录水平上调倍数最高。CCK8 细胞增殖曲线显示 HDAC9 转录激活组较阴性对照组生长能力提高，组间差异有统计学意义（图 3b，F=52.7，P=0.002）。WB 结果显示转录激活 HDAC9 基因后，HDAC9 蛋白表达水平上调（图 3c）。克隆形成实验结果显示，转录激活 HDAC9 增强 EBC-1 细胞的集落形成能力（图 3d）。
图3
转录激活 HDAC9 促进肺鳞癌细胞系 EBC-1 增殖
a：靶向 HDAC9 启动子区三个 sgRNAs 的转录激活效率；b：CCK8 细胞增殖曲线；c：转录激活 HDAC9 后蛋白水平改变；d：克隆形成实验结果图；NC：非靶向对照组；AC：靶向 HDAC9 转录激活组；***与 NC 组比较，
3 讨论
虽然同属非小细胞肺癌，但肺鳞癌与肺腺癌基因突变谱不同。肺腺癌的高频突变，如 EGFR 突变、ALK 基因融合突变等在肺鳞癌内并不常见。寻找影响肺鳞癌发生发展及患者预后的相关基因对于评估患者预后、指导临床治疗、开发治疗靶点都十分重要。据此，本实验室通过前期测序发现 HDAC9 基因在肺鳞癌中呈高频扩增，并在本实验中探究其在肺鳞癌中发挥的作用。
作为表观遗传修饰的重要方式，组蛋白翻译后修饰参与基因转录调控、染色体重塑等过程，在肿瘤的发生发展中扮演重要角色[10]。组蛋白乙酰化修饰是一种研究较为成熟的组蛋白翻译后修饰方式，由 HATs 和 HDACs 共同调节。HDACs 通过催化移除组蛋白 N 末端赖氨酸残基上的乙酰基团，促使组蛋白与 DNA 结合，从而发挥转录抑制作用。基于与酵母菌同源序列的比对，可将 18 种 HDACs 分为 4 型，Ⅰ型为 Rpd3 样酶，包括 HDAC1、2、3、8；Ⅱ型为 Had-1 样酶，可细分为两个亚型Ⅱa（HDAC4、5、6、7、9）和Ⅱb（HDAC6、10）；Ⅲ型为 Sir2 样酶，包括 7 种 sirtuins，为 NAD 依赖蛋白的去乙酰化酶或 ADP 核糖基化酶；Ⅳ型仅包括 HDAC11[17]。多项研究表明，HDACs 家族分子的基因突变或调节异常参与细胞周期、细胞凋亡、细胞自噬、血管生成、上皮向间质转化等生物学过程，促进多种实体肿瘤和血液肿瘤的发生发展，且多数情况下，HDACs 的高表达水平与疾病晚期和患者预后差相关[10]。
HDAC9 作为 HDACs 家族Ⅱ型分子的一员，已被报道与多种恶性肿瘤密切相关。Xiong 等[11]发现 HDAC9 在胃癌中高表达，敲低 HDAC9 可抑制胃癌细胞增殖并增加其对顺铂的敏感性。Salgado 等[12]发现三阴性乳腺癌细胞系中 HDAC9 的表达水平显著高于非三阴性乳腺癌细胞系，且其蛋白表达与 miR-206 表达呈显著负相关，HDAC9 通过抑制 miR-206 进而增加血管内皮生长因子（VEGF）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）蛋白表达，促进三阴性乳腺癌的侵袭转移和血管生成。Li 等[13]发现 HDAC9 高表达与胰腺导管腺癌预后差相关。尽管也有相关研究探究了 HDAC9 与肺癌预后的相关性，但研究对象集中于全体非小细胞肺癌[14]，而 HDAC9 在肺鳞癌这一亚型中的作用并不清楚。
本研究发现在肺鳞癌组织中，HDAC9 表达水平与肿瘤分化程度（P=0.035）、肿瘤大小（P=0.041）、淋巴结转移情况（P=0.013）相关。单因素 Cox 比例风险回归模型分析结果显示脉管癌栓（P=0.006）、肿瘤分化程度（P=0.005）、肿瘤大小（P=0.027）、淋巴结转移情况（P=0.036）及 HDAC9 表达水平（P=0.032）与患者的 OS 相关。进一步将上述因素纳入多因素 Cox 比例风险回归模型进行分析，发现 HDAC9 表达水平（P=0.023）、肿瘤分化程度（P=0.003）、肿瘤大小（P=0.003）、淋巴结转移情况（P=0.002）是影响肺鳞癌患者 OS 的独立预测因子。Kalpan-Meier 生存分析显示 HDAC9 高表达组患者的 OS 较低表达组差，差异有统计学意义（P=0.032）。CCK8 细胞增殖实验及克隆形成实验结果显示，激活 HDAC9 基因转录可上调 HDAC9 蛋白表达水平并促进肿瘤细胞增殖，提示 HDAC9 在肺鳞癌的发生发展中发挥着促癌作用。
综上所述，HDAC9 高表达肺鳞癌患者的预后较低表达患者差，是影响肺鳞癌患者 OS 的独立预测因子，其表达水平与肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移相关。HDAC9 高表达可促进肺鳞癌细胞增殖。提示 HDAC9 可能成为肺鳞癌新的预后生物标志物。但 HDAC9 促进肺鳞癌发生的详细分子机制尚不明确，并且其作为治疗靶点的可能性有待进一步探索。
利益冲突：无。
作者贡献：毕继旺为实验和文章主要完成人；刘冰修改文章；马媛媛修改文章，实验方法指导；杨跃提供实验指导。
在全球范围内，肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1-2]。最新数据显示，我国 2015 年肺癌新发病例 78.7 万例，死亡病例 63.1 万例，位居恶性肿瘤之首[3]。根据组织学类型，肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，后者占全部肺癌的 85% 左右。肺鳞状细胞癌（鳞癌）是非小细胞肺癌的主要类型之一，约占全部肺癌患者的 25%[4]。早期肺鳞癌以手术治疗为主，辅以放化疗；对于晚期肺鳞癌，则以放化疗为主。靶向药物的出现极大改善了肺腺癌的预后，但由于基因突变谱不同于肺腺癌，肺鳞癌患者中表皮生长因子受体（EGFR）基因突变和中间变性淋巴瘤微酶（ALK）基因融合等并不常见，这导致肺鳞癌缺乏有效的治疗靶点[5]。近年来，针对免疫检查点程序性死亡受体 1（PD-1）/PD-L1等的单克隆抗体的应用显著改善了部分晚期肺鳞癌的预后，但总体有效率仅约为 20%[6-7]。因此，寻找影响肺鳞癌预后的分子，并据此开发新的治疗靶点对于提高肺鳞癌治疗效果十分重要。
为寻找肺鳞癌新的有效治疗靶点，本实验室前期通过对 11 对 LUSC 原发肿瘤及对应患者来源的异种移植模型（patients derived xenografts，PDXs）进行全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）和全外显子组测序（whole exosome sequencing，WES）[8]，并结合 TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库和 COSMIC（Catalogue of Somatic Mutations in Cancer）数据库等，筛选出 56 个携带高频单碱基变异（single nucleotide variations，SNVs）或拷贝数变异（copy number variations，CNVs）的基因，并进一步采用靶向测序在 80 例肺鳞癌标本内检测其突变情况，结果显示组蛋白去乙酰化酶 9（HDAC9）基因在肺鳞癌内呈高频扩增。
表观遗传异常改变是肿瘤的一大特征[9]，而乙酰化修饰是一种重要的表观遗传调控方式。组蛋白乙酰化酶（HATs）和HDACs 共同调节组蛋白的乙酰化修饰，其中 HDACs 通过与其它分子形成复合物催化移除组蛋白 N 末端赖氨酸残基上的乙酰基团，促使组蛋白与 DNA 结合，从而发挥转录抑制作用。文献[10]报道 HDACs 可抑制抑癌基因的表达或调节促癌信号通路中关键分子的表达而促进肿瘤发生。HDAC9 是Ⅱ型 HDAC 分子，与多种恶性肿瘤的增殖转移相关[11-14]，但 HDAC9 与肺鳞癌的关系尚未明确。本研究旨在通过检测 HDAC9 在肺鳞癌组织中的表达水平，分析其与肺鳞癌临床病理特征及预后的相关性，并探究其对肺鳞癌细胞增殖的影响，为将来进一步开发治疗靶点打下基础。
1 资料与方法
1.1 临床资料与组织标本
收集 2010 年 7 月至 2014 年 4 月期间于北京大学肿瘤医院胸外二科进行手术切除的 129 例肺鳞癌患者组织标本及其临床资料。入选标准：（1）术前未接受任何治疗；（2）术后经过组织病理诊断属于肺鳞癌；（3）不合并身体其它部位的恶性肿瘤且无其它恶性肿瘤史。排除标准：除单纯肺鳞癌以外的其它类型，如腺鳞癌等各种混合癌均不纳入。本组患者男 118 例、女 11 例，中位年龄 61（37～79）岁；肿瘤分化程度为高中分化 58 例，低分化 71 例；肿瘤大小<3 cm 37 例，≥3 cm 92 例；淋巴结阳性 34 例，淋巴结阴性 95 例；胸膜侵犯 22 例。59 例患者行术后辅助治疗（化疗 54 例，放疗 3 例，同步放化疗 2 例）。按照国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，UICC）于 2009 年颁布的《肺癌 TNM 分期标准（第 7 版）》对患者进行分期[15]。
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学染色
129 例肺鳞癌组织标本均由北京大学肿瘤医院病理科常规固定、石蜡包埋、切片。5 μm 厚的石蜡病理切片，65 ℃ 烤片 60 min，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后，经柠檬酸钠抗原修复液（pH 6.0）（中杉金桥 ZLI-9064）进行高压热修复 5 min，3% H2O2 室温孵育 10 min 灭活内源性过氧化物酶，山羊血清（中杉金桥 ZLI-9022）室温湿盒内封闭 60 min，HDAC9 一抗（Abcam 兔抗人重组单克隆抗体 ab109446 1∶1 000）4℃ 湿盒内过夜孵育，辣根过氧化物酶标记的二抗（中杉金桥 PV-6000）室温湿盒内孵育 45 min，DAB 显色液（中杉金桥 ZLI-9018）显色，苏木素复染 5 min。
1.2.2 免疫组织化学结果判读
每张切片随机选取 10 个高倍（400×）视野，每个视野计数 100 个细胞，根据细胞染色强度和阳性细胞比例评判实验结果。所有染色结果均由两位病理医生分别在没有事先了解患者信息的情况下给出分数，然后在讨论后达成共识。对 HDAC9 的着色强度和阳性细胞百分比进行评分。根据着色强度分级为 0（无染色）、1（轻度染色）、2（中度染色）、3（强染色）。根据着色肿瘤细胞的百分比，评分如下：0（<25%）、1（25%～49%）、2（50%～74%）、3（≥75%）。将两得分相乘得到最终评分，高表达（≥6）或低表达（<6）。
1.2.3 细胞培养
MEM 培养基、胎牛血清、Sodium Pyruvate、MEM NEAA、胰酶均采购自美国 GIBCO 公司。肺鳞癌细胞系 EBC-1 采用 MEM 培养基（含 10% 胎牛血清，10% Sodium Pyruvate，10% MEM NEAA，1% 青链霉素双抗）于 37℃、5% CO2 的细胞培养箱中培养。当细胞进入对数生长期（细胞密度 80% 左右）时，用胰酶消化贴壁细胞，离心后用新鲜培养基重悬，进行后续传代或铺板转染实验。
1.2.4 CRISPR/dCas9 转录激活系统及质粒构建
CRISPR/dCas9 转录激活系统［lentiSAM v2（Puro）& lentiMPH v2（Neo）］由 Adam Karpf 实验室通过非营利性组织 Addgene 平台赠与（Addgene plasmid # 92062；
1.2.5 细胞转染
Lipo3000 转染试剂盒购自 Invitrogen 公司。转染前 1 d，将细胞铺于 6 孔板中，铺板密度为 50% 左右。铺板后第 2 d，按照 Lipo3000 转染试剂盒说明书进行细胞转染。细胞转染 24 h 后，收集细胞进行后续细胞实验；细胞转染 48 h 后，利用实时荧光定量 PCR（real-time fluorogentic quantitative polymerase chain reaction，qPCR）和蛋白质免疫印迹（Western Blotting，WB）实验对转染效率进行验证。
1.2.6 实时荧光定量 PCR
收集转染 48 h 后的细胞，按照 Trizol（Invitrogen）法提取细胞总 RNA，并按 TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒（#AE301-02，Transgene Biotech）说明书用 Random Primer 对 2 μg 总 RNA 进行反转录合成 cDNA。按照 GoTaq qPCR Master Mix 试剂盒（#A6001，Promega）说明书进行 PCR 反应，PCR 反应条件为 95℃ 预变性 5 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s，共 45 个循环；融解曲线反应条件为 95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s。以 β-ACTIN 为内参。用 2-ΔΔCt 法计算相对表达量。β-ACTIN、HDAC9 的引物序列如下：β-ACTIN 引物序列 F: TTAGTTGCGTTACACCCTTT，R: ACCTTCACCGTTCCAGTTT；HDAC9 引物序列 F: TGATGACATTGGCTGATGG，R: CTGCTTAGAATTTTTAAGAGAACTT。实验至少重复 3 次。
1.2.7 蛋白质免疫印迹实验
收集转染 48 h 后的细胞，加入 RIPA（strong）蛋白裂解液（含 Cocktail 蛋白酶抑制剂）裂解细胞，提取细胞总蛋白，利用 BCA 法测定蛋白浓度。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，将等量 30 μg 变性后样品经 8% 的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离蛋白，而后将胶内蛋白电转至硝酸纤维素膜上。5% 脱脂奶粉室温封闭 1 h，一抗［HDAC9（Abcam ab109446）1∶10 000，GAPDH（CST #97166）1∶10 000］4℃ 孵育过夜，TBST 缓冲液洗膜后相应二抗（1∶10 000）室温孵育 1 h，TBST 洗膜后进行化学发光显色。实验至少重复 3 次。
1.2.8 CCK8 细胞增殖实验
CCK8 细胞增殖与毒性检测试剂盒购自日本 Dojindo 公司。收集转染 24 h 后的细胞，每孔 5 000 个细胞均匀接种于 96 孔板中，体积 100 μL，每组设置 3 个复孔，5 个观察时间点，分别于 0 h、24 h、48 h、72 h、96 h 加入 CCK8 试剂后 37℃ 培养箱孵育 2 h，后于酶标仪上测定 450 nm 的光密度值。0 h 孔在接种细胞后直接加入 10 μL CCK8 试剂孵育 2 h 后测光密度值，其它孔在加入 CCK8 试剂孵育前更换新鲜培养基 100 μL，再加入 10 μL CCK8 试剂孵育 2 h 后测光密度值。根据各时间点与 0 h 平均光密度值的差值绘制增殖曲线。实验至少重复 3 次。
1.2.9 克隆形成实验
收集转染 24 h 后的细胞，每孔 1 000 个细胞均匀接种于 6 孔板，培养基 2 mL，每组设置 3 个复孔，37℃ 培养箱内培养 9 d。弃去培养基，磷酸盐缓冲液洗 1 次，4% 多聚甲醛室温固定 10 min，0.1% 结晶紫水溶液室温染色 10 min，去离子水洗去多余染液，室温干燥后拍照。
1.3 统计学分析
采用 IBM SPSS 24.0（Chicago，USA）软件进行统计学分析。分类资料采用 χ2 检验，采用 Kaplan-Meier 法进行生存分析并采用 log-rank 检验方法进行显著性检验，检验水准 α=0.05。采用单因素和多因素 Cox 比例风险回归模型分析影响患者总生存期（overall survival，OS）的独立预测因子，多因素 Cox 比例风险回归模型纳入的变量为单因素 Cox 分析中 P<0.100 的变量。
1.4 伦理审查
本研究获得北京大学肿瘤医院医学伦理委员会批准（批准号：2018KT43）。所有患者术前均签署知情同意书。
2 结果
2.1 HDAC9 蛋白在肺鳞癌组织中的表达及其与临床病理特征的相关性
HDAC9 蛋白于细胞核中表达，阳性染色细胞排列呈巢状，周围被结缔组织分割（图 1）。在全部染色 129 例肺鳞癌患者中，39 例（30.2%）呈低表达，90 例（69.8%）呈高表达。采用 χ2 检验分析 129 例肺鳞癌组织中 HDAC9 表达水平与患者的临床病理特征之间的相关性，发现 HDAC9 表达水平与肿瘤分化程度（P=0.035）、肿瘤大小（P=0.041）、淋巴结转移情况（P=0.013）相关，而与年龄、性别、吸烟史、脉管癌栓、辅助治疗情况无明确相关性（表 1）。
图1
HDAC9 免疫组化染色结果示意图（×100 倍）
a：无染色；b：轻度染色；c：中度染色；d：强染色
表1
HDAC9 在 129 例肺鳞癌患者中的表达情况及其与其他临床病理特征的关联［例/例（%）］
2.2 HDAC9 表达水平与肺鳞癌患者总生存的 Kaplan-Meier 生存分析
在线基因表达分析工具 GEPIA[16]（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）（
图2
HDAC9 表达水平与肺鳞癌患者总生存期的 Kaplan-Meier 生存分析曲线
a：HDAC9 在转录水平的 Kaplan-Meier 生存分析曲线；b：HDAC9 在蛋白水平的 Kaplan-Meier 生存分析曲线
2.3 肺鳞癌患者预后的单因素和多因素分析
采用 Cox 比例风险回归模型分析肺鳞癌预后的影响因素，单因素分析发现脉管癌栓（P=0.006）、肿瘤分化程度（P=0.005）、肿瘤大小（P=0.027）、淋巴结转移情况（P=0.036）及 HDAC9 表达水平（P=0.032）是影响患者预后的因素；多因素分析显示，肿瘤分化程度（P=0.003）、肿瘤大小（P=0.003）、淋巴结转移情况（P=0.002）及 HDAC9 表达水平（P=0.023）是患者预后的独立预测因子（表 2）。
表2
肺鳞癌患者总生存单因素和多因素 Cox 比例风险回归模型分析
2.4 转录激活 HDAC9 促进肺鳞癌细胞系 EBC-1 增殖
为进一步探究 HDAC9 分子对肺鳞癌增殖的影响，应用 CRISPR/dCas9 转录激活系统激活肺鳞癌细胞系 EBC-1 内 HDAC9 基因的转录并观察细胞增殖表型的改变。首先，在 EBC-1 细胞中分别转染插入 sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3 的 CRISPR/dCas9 转录激活系统以挑选最佳 sgRNA，利用 qPCR 法在 mRNA 水平检测 HDAC9 基因转录激活效率（图 3a），其中 sgRNA2 使 HDAC9 转录水平上调倍数最高。CCK8 细胞增殖曲线显示 HDAC9 转录激活组较阴性对照组生长能力提高，组间差异有统计学意义（图 3b，F=52.7，P=0.002）。WB 结果显示转录激活 HDAC9 基因后，HDAC9 蛋白表达水平上调（图 3c）。克隆形成实验结果显示，转录激活 HDAC9 增强 EBC-1 细胞的集落形成能力（图 3d）。
图3
转录激活 HDAC9 促进肺鳞癌细胞系 EBC-1 增殖
a：靶向 HDAC9 启动子区三个 sgRNAs 的转录激活效率；b：CCK8 细胞增殖曲线；c：转录激活 HDAC9 后蛋白水平改变；d：克隆形成实验结果图；NC：非靶向对照组；AC：靶向 HDAC9 转录激活组；***与 NC 组比较，
3 讨论
虽然同属非小细胞肺癌，但肺鳞癌与肺腺癌基因突变谱不同。肺腺癌的高频突变，如 EGFR 突变、ALK 基因融合突变等在肺鳞癌内并不常见。寻找影响肺鳞癌发生发展及患者预后的相关基因对于评估患者预后、指导临床治疗、开发治疗靶点都十分重要。据此，本实验室通过前期测序发现 HDAC9 基因在肺鳞癌中呈高频扩增，并在本实验中探究其在肺鳞癌中发挥的作用。
作为表观遗传修饰的重要方式，组蛋白翻译后修饰参与基因转录调控、染色体重塑等过程，在肿瘤的发生发展中扮演重要角色[10]。组蛋白乙酰化修饰是一种研究较为成熟的组蛋白翻译后修饰方式，由 HATs 和 HDACs 共同调节。HDACs 通过催化移除组蛋白 N 末端赖氨酸残基上的乙酰基团，促使组蛋白与 DNA 结合，从而发挥转录抑制作用。基于与酵母菌同源序列的比对，可将 18 种 HDACs 分为 4 型，Ⅰ型为 Rpd3 样酶，包括 HDAC1、2、3、8；Ⅱ型为 Had-1 样酶，可细分为两个亚型Ⅱa（HDAC4、5、6、7、9）和Ⅱb（HDAC6、10）；Ⅲ型为 Sir2 样酶，包括 7 种 sirtuins，为 NAD 依赖蛋白的去乙酰化酶或 ADP 核糖基化酶；Ⅳ型仅包括 HDAC11[17]。多项研究表明，HDACs 家族分子的基因突变或调节异常参与细胞周期、细胞凋亡、细胞自噬、血管生成、上皮向间质转化等生物学过程，促进多种实体肿瘤和血液肿瘤的发生发展，且多数情况下，HDACs 的高表达水平与疾病晚期和患者预后差相关[10]。
HDAC9 作为 HDACs 家族Ⅱ型分子的一员，已被报道与多种恶性肿瘤密切相关。Xiong 等[11]发现 HDAC9 在胃癌中高表达，敲低 HDAC9 可抑制胃癌细胞增殖并增加其对顺铂的敏感性。Salgado 等[12]发现三阴性乳腺癌细胞系中 HDAC9 的表达水平显著高于非三阴性乳腺癌细胞系，且其蛋白表达与 miR-206 表达呈显著负相关，HDAC9 通过抑制 miR-206 进而增加血管内皮生长因子（VEGF）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）蛋白表达，促进三阴性乳腺癌的侵袭转移和血管生成。Li 等[13]发现 HDAC9 高表达与胰腺导管腺癌预后差相关。尽管也有相关研究探究了 HDAC9 与肺癌预后的相关性，但研究对象集中于全体非小细胞肺癌[14]，而 HDAC9 在肺鳞癌这一亚型中的作用并不清楚。
本研究发现在肺鳞癌组织中，HDAC9 表达水平与肿瘤分化程度（P=0.035）、肿瘤大小（P=0.041）、淋巴结转移情况（P=0.013）相关。单因素 Cox 比例风险回归模型分析结果显示脉管癌栓（P=0.006）、肿瘤分化程度（P=0.005）、肿瘤大小（P=0.027）、淋巴结转移情况（P=0.036）及 HDAC9 表达水平（P=0.032）与患者的 OS 相关。进一步将上述因素纳入多因素 Cox 比例风险回归模型进行分析，发现 HDAC9 表达水平（P=0.023）、肿瘤分化程度（P=0.003）、肿瘤大小（P=0.003）、淋巴结转移情况（P=0.002）是影响肺鳞癌患者 OS 的独立预测因子。Kalpan-Meier 生存分析显示 HDAC9 高表达组患者的 OS 较低表达组差，差异有统计学意义（P=0.032）。CCK8 细胞增殖实验及克隆形成实验结果显示，激活 HDAC9 基因转录可上调 HDAC9 蛋白表达水平并促进肿瘤细胞增殖，提示 HDAC9 在肺鳞癌的发生发展中发挥着促癌作用。
综上所述，HDAC9 高表达肺鳞癌患者的预后较低表达患者差，是影响肺鳞癌患者 OS 的独立预测因子，其表达水平与肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移相关。HDAC9 高表达可促进肺鳞癌细胞增殖。提示 HDAC9 可能成为肺鳞癌新的预后生物标志物。但 HDAC9 促进肺鳞癌发生的详细分子机制尚不明确，并且其作为治疗靶点的可能性有待进一步探索。
利益冲突：无。
作者贡献：毕继旺为实验和文章主要完成人；刘冰修改文章；马媛媛修改文章，实验方法指导；杨跃提供实验指导。
