引用本文： 杨晓, 李思, 向尚, 吴衣论, 王琳, 彭锦, 冯颖. RNA 干扰降低唾液酸酶 3 表达对骨肉瘤 MG-63 细胞增殖和凋亡影响的实验研究. 中国修复重建外科杂志, 2018, 32(7): 887-892. doi: 10.7507/1002-1892.201801077 复制
糖基化异常是肿瘤细胞特异性特征之一，唾液酸是广泛存在于生物体内的一类九碳糖类化合物[1-2]。在恶性转化过程中，唾液酸化改变被认为与肿瘤细胞转移和侵袭力密切相关。恶性肿瘤细胞表面常呈现糖蛋白唾液酸化程度升高[3-4]。机体内控制唾液酸水平的代谢关键酶是唾液酸酶（neuraminidase，NEU）和唾液酸糖基转移酶，其中 NEU 是一种糖苷酶，能催化去除糖蛋白和糖酯末端的唾液酸残基[5]。在哺乳动物体内，目前已鉴定并克隆出 4 种 NEU，根据其一级结构、定位、底物特性和酶学特性分为 NEU1、NEU2、NEU3 和 NEU4[6]，其中 NEU3 仅特异性水解神经节苷酯，几乎不作用于其他底物；人源性 NEU3 在细胞膜和膜性细胞器上均有表达，并且在生长刺激下可以迁移浓聚[7]。一系列研究表明 NEU 活性与细胞分化、细胞增殖以及细胞黏附侵袭均密切相关，且 NEU3 是在肿瘤发生过程中唯一上调的 NEU[8-10]。
骨肉瘤是常见的骨原发性恶性肿瘤之一，好发于青少年，其恶性程度较高、预后较差。由于缺少有效的早期诊断方法，骨肉瘤确诊时大多已为晚期，手术切除的预后并不理想。已有研究发现细胞质 NEU2 可抑制 FBJ 病毒诱导的小鼠骨肉瘤 FBJ-LL 细胞生长[11]。Sandhu 等[12]发现骨肉瘤及其他骨形成肿瘤患者血清唾液酸含量明显增高，提示骨肉瘤的发生发展可能与唾液酸相关。本研究应用 RNA 干扰（RNA interfering，RNAi）技术，降低骨肉瘤 MG-63 细胞中 NEU3 基因的表达，并检测此条件下 MG-63 细胞增殖和凋亡的情况，以分析 NEU3 在骨肉瘤 MG-63 细胞增殖和凋亡过程中的作用，以期为骨肉瘤治疗提供可能的治疗靶点和新思路。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
骨肉瘤 MG-63 细胞由四川大学基础医学与法医学院孙晓东博士赠送。MEM 培养基、FBS、青霉素-链霉素双抗（HyClone 公司，美国）；0.25% EDTA-胰蛋白酶（GIBCO 公司，美国）；RNAi 试剂 genOFFTM st-h-NEU3（广州锐博生物科技有限公司）；Bcl-2 抗兔多克隆抗体、Ras 抗兔多克隆抗体、β-actin 抗鼠单克隆抗体（成都正能生物技术有限责任公司）；NEU3 抗羊多克隆抗体（Santa Cruz 公司，美国）；脂质体转染试剂盒 Lipofectamine 3000、驴抗山羊二抗（Thermo Fisher 公司，美国）；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；抗荧光淬灭封片液（上海碧云天生物技术有限公司）；PrimeScript RT Reagent Kit 逆转录试剂盒（Takara 公司，日本）；DNA 酶（Thermo Scientific 公司，美国）；SYBR Select Master Mix（Applied Biosystems 公司，美国）；TrizolTM（Ambion 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；DOJINDO 公司，日本）。流式细胞仪（MILLOPORE 公司，美国）；酶标仪（Bio-Rad 公司，美国）；荧光定量 PCR 仪（Thermo Scientific 公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
取 MG-63 细胞置于含 10%FBS 的 MEM 培养基中，于 37℃、5%CO2 条件下常规培养。待细胞贴壁，呈上皮细胞样后，取对数生长期 MG-63 细胞，根据处理方法不同分为 5 组： 正常对照组（A 组），不作任何处理； 30、50、100 nmol/L NEU3 RNA 干扰组（分别为 B、C、D 组），分别以浓度为 30、50、100 nmol/L 的 NEU3 小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）转染细胞；阴性对照组（E 组），使用不同种属阴性对照 siRNA （小鼠 actin siRNA，50 nmol/L）转染细胞。转染后细胞培养 24 h 或 48 h 后用于后续实验检测。
1.3 观测指标
1.3.1 免疫荧光染色观察
将 MG-63 细胞接种于 24 孔板圆形防脱玻璃盖玻片上，培养 24 h，弃上清；室温下多聚甲醛固定 30 min 后，0.1%PBS-Tween 溶液（PBST）洗 3 次；0.1%皂苷溶液室温通透 15 min；1%牛血清白蛋白+3%山羊血清 PBST 溶液室温封闭 1 h；NEU3 一抗（1∶100）4℃ 孵育过夜，DyLight680 山羊抗鼠二抗（1∶500）室温避光 孵育1 h；DAPI 溶液（15 μg/mL）室温避光孵育 15 min。用抗荧光淬灭封片剂封片后，荧光显微镜下观察 MG-63 细胞中 NEU3 的表达情况。
1.3.2 实时荧光定量 PCR 检测 NEU3 mRNA 表达水平
将 MG-63 细胞接种于 12 孔板后，按照 1.2 分组方法进行细胞转染。24 h 后，各组取 3 孔细胞，以 Trizol 提取总 RNA，检测 RNA 质量，并记录浓度。使用 DNA 酶 37℃ 消化处理基因组 DNA 30 min，加入 1 μL 50 mmol/L EDTA 65℃ 灭活 10 min。然后使用逆转录试剂盒合成 cDNA，反应条件为：37℃、15 min，85℃、5 s。以此 cDNA 为模板进行 PCR，引物序列见表 1。PCR 反应条件：95℃、10 min；95℃、15 s，60℃、1 min，40 个循环。以 GAPDH 作为内参基因，使用 2–ΔΔCt法计算各组中 NEU3 mRNA 相对表达量。
表1
引物序列及扩增片段长度
Table1.
Primer sequence and amplification section length of real-time fluorescence quantitative PCR
1.3.3 CCK-8 法检测细胞增殖
取对数生长期 MG-63 细胞，常规消化计数，以 1×104个/孔密度接种于 96 孔板中；细胞贴壁后，更换含 10%FBS 的 MEM 培养基培养 24 h 使细胞同步化。按照 1.2 分组方法转染细胞后培养 48 h，每孔加入 CCK-8 溶液 10 μL，继续培养 4 h 后，使用酶标仪在 450 nm 处测定各孔吸光度（A）值，计算细胞成活率=（A 值 实验孔 – A 值 空白孔）/（A 值 正常对照孔 – A 值 空白孔）×100%；抑制率=（A 值 正常对照孔 – A 值 实验孔）/（A 值 正常对照孔 – A 值 空白孔）×100%。
1.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡
将 MG-63 细胞以 1×106个/孔密度接种于 12 孔板中，培养过夜。按照 1.2 分组方法转染细胞后培养 24 h，弃上清，以细胞刮刀收集细胞；70% 冷乙醇固定细胞 2 h；乙醇重悬细胞后，以离心半径 5 cm、1 500 r/min 离心 5 min；弃乙醇，PBS 洗涤 1 次，将细胞重悬于含碘化丙啶的 PBS 中，室温避光孵育 1 h。将样品转移至流式管，分别于激发波长 488 nm、发射波长 610 nm 处测荧光值。分布于散点图左下象限散点代表正常细胞，右下象限的散点代表早期凋亡细胞，右上象限的散点代表中晚期凋亡细胞，左上象限散点代表细胞碎片和坏死细胞，计算细胞凋亡率。
1.3.5 Western blot 检测 NEU3 表达抑制后细胞凋亡相关蛋白表达
取对数生长期 MG-63 细胞，常规消化计数，以 1×105个/孔密度接种于 6 孔板中，培养过夜。按照 1.2 分组方法转染细胞后培养 24 h，弃上清，以细胞刮刀收集细胞；以 RIPA 裂解液+蛋白酶抑制剂 4℃ 裂解，将各组细胞裂解液以 BCA 法测定蛋白浓度后，进行 SDS-PAGE 电泳。电转蛋白至聚偏氟乙烯膜，用 5%脱脂牛奶室温封闭 60 min，加入相应比例的一抗 Ras、Bcl-2（1∶2 000）；actin（1∶4 000）室温孵育 2 h，TBST 洗涤；加入相对应的二抗室温孵育 1 h，TBST 洗涤；暗室 ECL 化学发光法显影，Image J 软件胶片条带分析灰度值。
1.4 统计学方法
采用 Graphpad prism 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 免疫荧光染色观察
荧光显微镜观察示，NEU3 表达集中在 MG-63 细胞的细胞质中。见图 1。
2.2 实时荧光定量 PCR 检测
培养 24 h 后，B、C、D 组 NEU3 mRNA 相对表达量分别为 0.66±0.07、0.34±0.07、0.12±0.07，明显低于 A 组（1.00±0.06）及 E 组（1.01±0.05），比较差异有统计学意义（P<0.05）。随着 siRNA 浓度升高，B、C、D 组 NEU3 mRNA 相对表达量呈下降趋势，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3 CCK-8 法检测细胞增殖
培养 48 h 后，B、C、D、E 组细胞成活率分别为 44.80%±4.68%、21.85%±5.93%、15.08%±3.66%、80.04%±2.28%，抑制率分别为 55.20%±4.68%、78.15%±5.93%、84.92%±3.66%、19.96%±2.28%；随 NEU3 siRNA 浓度升高，MG-63 细胞抑制率显著升高，成活率显著降低，组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.4 流式细胞术检测细胞凋亡
培养 24 h 后，A、B、C、D、E 组细胞凋亡率分别为 3.23%±0.06%、12.57%±0.64%、4.63%±0.52%、2.89%±0.72%、10.55%±0.87%。B、C、D 组与 A 组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；与 E 组比较，C、D 组细胞凋亡率显著降低（P<0.05），B、E 组间差异无统计学意义（P>0.05）。随 siRNA 浓度增加，B、C、D 组细胞凋亡率呈下降趋势，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 2。
2.5 Western blot 检测细胞 Ras 和 Bcl-2 蛋白表达
培养 24 h，随 NEU3 siRNA 浓度升高，Ras 蛋白和 Bcl-2 蛋白的表达逐渐降低。与 A 组和 E 组比较，B、C 组 Ras 和 Bcl-2 蛋白相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）；而 D 组以上蛋白表达均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
3 讨论
当前国内外公认的骨肉瘤治疗模式为术前新辅助化疗+肿瘤手术切除+术后辅助化疗，辅以介入治疗、冷热消融治疗、分子靶向治疗等[13]。目前骨肉瘤的分子靶向治疗焦点主要集中于埃兹蛋白、表皮生长因子受体 2，但骨肉瘤患者长期生存率并未明显提高[14]。因此，探索新的与骨肉瘤发病和转移相关的分子机制及信号转导途径，从而提供可能更为有效的骨肉瘤治疗靶点，以提高患者长期生存率，具有重要临床意义。
研究表明 NEU3 在多种肿瘤中表达上调，其表达水平与肿瘤恶性程度成正相关，且其可能导致跨膜信号转导的紊乱[15]。然而 NEU3 参与肿瘤发生发展的具体分子机制尚待明确。NEU3 可能通过多种机制参与肿瘤的发生发展：一方面，可能通过其 NEU 活性改变肿瘤细胞表面唾液酸修饰状态，从而改变肿瘤细胞活性；另一方面，其作为信号转导中间蛋白，参与和肿瘤发生发展相关的信号通路[16]。本研究通过 RNA 干扰的方式降低 NEU3 在骨肉瘤细胞 MG-63 中的表达，发现 NEU3 表达下降后，MG-63 细胞成活率显著降低、凋亡率显著升高，且与 NEU3 表达量相关。说明 NEU3 在 MG-63 细胞中的表达量与该细胞的生存具有紧密联系。然而，本研究仅为体外实验，确认 NEU3 在骨肉瘤发生发展中的具体作用，仍需要结合体内实验进一步研究。NEU3 在 MG-63 细胞生存的促进作用，究竟是通过其 NEU 活性，还是参与肿瘤发生发展信号通路来发挥的，仍然有待进一步探索。
Ras 基因与 Bcl-2 基因是肿瘤研究中两个重要基因。当原癌基因 Ras 异常活化时，Ras 蛋白持续处于活化状态进而激活下游信号通路，使细胞无限增殖而引起肿瘤 [17-18]；而 Bcl-2 基因家族表达的凋亡抑制蛋白可通过抑制凋亡信号，从而阻碍细胞凋亡的激活，使肿瘤发生[19-20]。本研究结果发现，NEU3 的表达对原癌基因 Ras 蛋白以及凋亡抑制蛋白 Bcl-2 的影响只在 100 nmol/L NEU3 siRNA 处理时与正常对照组有显著性区别，提示 NEU3 对 MG-63 的抑制有可能与其他信号通路有关。
综上述，本实验研究结果表明，通过抑制 NEU3 的表达可以抑制骨肉瘤 MG-63 细胞的增殖、增加其凋亡。提示若能找到一种稳定、安全、可靠地降低 NEU3 表达的方法，就可以抑制骨肉瘤细胞的增殖，进一步实现诱导人骨肉瘤细胞凋亡的目的，为骨肉瘤治疗带来新的方法。
图1
免疫荧光染色观察 NEU3 在 MG-63 细胞中的表达（荧光显微镜×400）
从左至右分别为 NEU3、DAPI 及两者叠加
Figure1. NEU3 expression in MG-63 cells via immunofluorescence staining (Fluorescent microscope×400)From left to right for NEU3, DAPI, and merge
图2
流式细胞仪检测各组 MG-63 细胞凋亡情况
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure2. The apoptosis of MG-63 cells in different groups detected by flow cytometrya. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
图3
Western blot 检测各组 Ras 和 Bcl-2 蛋白表达
a. 电泳图 1：B 组 2：C 组 3：D 组 4：E 组 5：A 组；b. 各组 Ras 蛋白相对表达量；c. 各组 Bcl-2 蛋白相对表达量
Figure3. Protein expressions of Ras and Bcl-2 in different groups detected by Western blota. Electrophorogram 1: Group B 2: Group C 3: Group D 4: Group E 5: Group A; b. Relative expression of Ras protein in different groups; c. Relative expression of Bcl-2 protein in different groups
糖基化异常是肿瘤细胞特异性特征之一，唾液酸是广泛存在于生物体内的一类九碳糖类化合物[1-2]。在恶性转化过程中，唾液酸化改变被认为与肿瘤细胞转移和侵袭力密切相关。恶性肿瘤细胞表面常呈现糖蛋白唾液酸化程度升高[3-4]。机体内控制唾液酸水平的代谢关键酶是唾液酸酶（neuraminidase，NEU）和唾液酸糖基转移酶，其中 NEU 是一种糖苷酶，能催化去除糖蛋白和糖酯末端的唾液酸残基[5]。在哺乳动物体内，目前已鉴定并克隆出 4 种 NEU，根据其一级结构、定位、底物特性和酶学特性分为 NEU1、NEU2、NEU3 和 NEU4[6]，其中 NEU3 仅特异性水解神经节苷酯，几乎不作用于其他底物；人源性 NEU3 在细胞膜和膜性细胞器上均有表达，并且在生长刺激下可以迁移浓聚[7]。一系列研究表明 NEU 活性与细胞分化、细胞增殖以及细胞黏附侵袭均密切相关，且 NEU3 是在肿瘤发生过程中唯一上调的 NEU[8-10]。
骨肉瘤是常见的骨原发性恶性肿瘤之一，好发于青少年，其恶性程度较高、预后较差。由于缺少有效的早期诊断方法，骨肉瘤确诊时大多已为晚期，手术切除的预后并不理想。已有研究发现细胞质 NEU2 可抑制 FBJ 病毒诱导的小鼠骨肉瘤 FBJ-LL 细胞生长[11]。Sandhu 等[12]发现骨肉瘤及其他骨形成肿瘤患者血清唾液酸含量明显增高，提示骨肉瘤的发生发展可能与唾液酸相关。本研究应用 RNA 干扰（RNA interfering，RNAi）技术，降低骨肉瘤 MG-63 细胞中 NEU3 基因的表达，并检测此条件下 MG-63 细胞增殖和凋亡的情况，以分析 NEU3 在骨肉瘤 MG-63 细胞增殖和凋亡过程中的作用，以期为骨肉瘤治疗提供可能的治疗靶点和新思路。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
骨肉瘤 MG-63 细胞由四川大学基础医学与法医学院孙晓东博士赠送。MEM 培养基、FBS、青霉素-链霉素双抗（HyClone 公司，美国）；0.25% EDTA-胰蛋白酶（GIBCO 公司，美国）；RNAi 试剂 genOFFTM st-h-NEU3（广州锐博生物科技有限公司）；Bcl-2 抗兔多克隆抗体、Ras 抗兔多克隆抗体、β-actin 抗鼠单克隆抗体（成都正能生物技术有限责任公司）；NEU3 抗羊多克隆抗体（Santa Cruz 公司，美国）；脂质体转染试剂盒 Lipofectamine 3000、驴抗山羊二抗（Thermo Fisher 公司，美国）；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）；抗荧光淬灭封片液（上海碧云天生物技术有限公司）；PrimeScript RT Reagent Kit 逆转录试剂盒（Takara 公司，日本）；DNA 酶（Thermo Scientific 公司，美国）；SYBR Select Master Mix（Applied Biosystems 公司，美国）；TrizolTM（Ambion 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；DOJINDO 公司，日本）。流式细胞仪（MILLOPORE 公司，美国）；酶标仪（Bio-Rad 公司，美国）；荧光定量 PCR 仪（Thermo Scientific 公司，美国）。
1.2 实验分组及方法
取 MG-63 细胞置于含 10%FBS 的 MEM 培养基中，于 37℃、5%CO2 条件下常规培养。待细胞贴壁，呈上皮细胞样后，取对数生长期 MG-63 细胞，根据处理方法不同分为 5 组： 正常对照组（A 组），不作任何处理； 30、50、100 nmol/L NEU3 RNA 干扰组（分别为 B、C、D 组），分别以浓度为 30、50、100 nmol/L 的 NEU3 小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）转染细胞；阴性对照组（E 组），使用不同种属阴性对照 siRNA （小鼠 actin siRNA，50 nmol/L）转染细胞。转染后细胞培养 24 h 或 48 h 后用于后续实验检测。
1.3 观测指标
1.3.1 免疫荧光染色观察
将 MG-63 细胞接种于 24 孔板圆形防脱玻璃盖玻片上，培养 24 h，弃上清；室温下多聚甲醛固定 30 min 后，0.1%PBS-Tween 溶液（PBST）洗 3 次；0.1%皂苷溶液室温通透 15 min；1%牛血清白蛋白+3%山羊血清 PBST 溶液室温封闭 1 h；NEU3 一抗（1∶100）4℃ 孵育过夜，DyLight680 山羊抗鼠二抗（1∶500）室温避光 孵育1 h；DAPI 溶液（15 μg/mL）室温避光孵育 15 min。用抗荧光淬灭封片剂封片后，荧光显微镜下观察 MG-63 细胞中 NEU3 的表达情况。
1.3.2 实时荧光定量 PCR 检测 NEU3 mRNA 表达水平
将 MG-63 细胞接种于 12 孔板后，按照 1.2 分组方法进行细胞转染。24 h 后，各组取 3 孔细胞，以 Trizol 提取总 RNA，检测 RNA 质量，并记录浓度。使用 DNA 酶 37℃ 消化处理基因组 DNA 30 min，加入 1 μL 50 mmol/L EDTA 65℃ 灭活 10 min。然后使用逆转录试剂盒合成 cDNA，反应条件为：37℃、15 min，85℃、5 s。以此 cDNA 为模板进行 PCR，引物序列见表 1。PCR 反应条件：95℃、10 min；95℃、15 s，60℃、1 min，40 个循环。以 GAPDH 作为内参基因，使用 2–ΔΔCt法计算各组中 NEU3 mRNA 相对表达量。
表1
引物序列及扩增片段长度
Table1.
Primer sequence and amplification section length of real-time fluorescence quantitative PCR
1.3.3 CCK-8 法检测细胞增殖
取对数生长期 MG-63 细胞，常规消化计数，以 1×104个/孔密度接种于 96 孔板中；细胞贴壁后，更换含 10%FBS 的 MEM 培养基培养 24 h 使细胞同步化。按照 1.2 分组方法转染细胞后培养 48 h，每孔加入 CCK-8 溶液 10 μL，继续培养 4 h 后，使用酶标仪在 450 nm 处测定各孔吸光度（A）值，计算细胞成活率=（A 值 实验孔 – A 值 空白孔）/（A 值 正常对照孔 – A 值 空白孔）×100%；抑制率=（A 值 正常对照孔 – A 值 实验孔）/（A 值 正常对照孔 – A 值 空白孔）×100%。
1.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡
将 MG-63 细胞以 1×106个/孔密度接种于 12 孔板中，培养过夜。按照 1.2 分组方法转染细胞后培养 24 h，弃上清，以细胞刮刀收集细胞；70% 冷乙醇固定细胞 2 h；乙醇重悬细胞后，以离心半径 5 cm、1 500 r/min 离心 5 min；弃乙醇，PBS 洗涤 1 次，将细胞重悬于含碘化丙啶的 PBS 中，室温避光孵育 1 h。将样品转移至流式管，分别于激发波长 488 nm、发射波长 610 nm 处测荧光值。分布于散点图左下象限散点代表正常细胞，右下象限的散点代表早期凋亡细胞，右上象限的散点代表中晚期凋亡细胞，左上象限散点代表细胞碎片和坏死细胞，计算细胞凋亡率。
1.3.5 Western blot 检测 NEU3 表达抑制后细胞凋亡相关蛋白表达
取对数生长期 MG-63 细胞，常规消化计数，以 1×105个/孔密度接种于 6 孔板中，培养过夜。按照 1.2 分组方法转染细胞后培养 24 h，弃上清，以细胞刮刀收集细胞；以 RIPA 裂解液+蛋白酶抑制剂 4℃ 裂解，将各组细胞裂解液以 BCA 法测定蛋白浓度后，进行 SDS-PAGE 电泳。电转蛋白至聚偏氟乙烯膜，用 5%脱脂牛奶室温封闭 60 min，加入相应比例的一抗 Ras、Bcl-2（1∶2 000）；actin（1∶4 000）室温孵育 2 h，TBST 洗涤；加入相对应的二抗室温孵育 1 h，TBST 洗涤；暗室 ECL 化学发光法显影，Image J 软件胶片条带分析灰度值。
1.4 统计学方法
采用 Graphpad prism 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 免疫荧光染色观察
荧光显微镜观察示，NEU3 表达集中在 MG-63 细胞的细胞质中。见图 1。
2.2 实时荧光定量 PCR 检测
培养 24 h 后，B、C、D 组 NEU3 mRNA 相对表达量分别为 0.66±0.07、0.34±0.07、0.12±0.07，明显低于 A 组（1.00±0.06）及 E 组（1.01±0.05），比较差异有统计学意义（P<0.05）。随着 siRNA 浓度升高，B、C、D 组 NEU3 mRNA 相对表达量呈下降趋势，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。
2.3 CCK-8 法检测细胞增殖
培养 48 h 后，B、C、D、E 组细胞成活率分别为 44.80%±4.68%、21.85%±5.93%、15.08%±3.66%、80.04%±2.28%，抑制率分别为 55.20%±4.68%、78.15%±5.93%、84.92%±3.66%、19.96%±2.28%；随 NEU3 siRNA 浓度升高，MG-63 细胞抑制率显著升高，成活率显著降低，组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.4 流式细胞术检测细胞凋亡
培养 24 h 后，A、B、C、D、E 组细胞凋亡率分别为 3.23%±0.06%、12.57%±0.64%、4.63%±0.52%、2.89%±0.72%、10.55%±0.87%。B、C、D 组与 A 组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；与 E 组比较，C、D 组细胞凋亡率显著降低（P<0.05），B、E 组间差异无统计学意义（P>0.05）。随 siRNA 浓度增加，B、C、D 组细胞凋亡率呈下降趋势，各组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 2。
2.5 Western blot 检测细胞 Ras 和 Bcl-2 蛋白表达
培养 24 h，随 NEU3 siRNA 浓度升高，Ras 蛋白和 Bcl-2 蛋白的表达逐渐降低。与 A 组和 E 组比较，B、C 组 Ras 和 Bcl-2 蛋白相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）；而 D 组以上蛋白表达均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 3。
3 讨论
当前国内外公认的骨肉瘤治疗模式为术前新辅助化疗+肿瘤手术切除+术后辅助化疗，辅以介入治疗、冷热消融治疗、分子靶向治疗等[13]。目前骨肉瘤的分子靶向治疗焦点主要集中于埃兹蛋白、表皮生长因子受体 2，但骨肉瘤患者长期生存率并未明显提高[14]。因此，探索新的与骨肉瘤发病和转移相关的分子机制及信号转导途径，从而提供可能更为有效的骨肉瘤治疗靶点，以提高患者长期生存率，具有重要临床意义。
研究表明 NEU3 在多种肿瘤中表达上调，其表达水平与肿瘤恶性程度成正相关，且其可能导致跨膜信号转导的紊乱[15]。然而 NEU3 参与肿瘤发生发展的具体分子机制尚待明确。NEU3 可能通过多种机制参与肿瘤的发生发展：一方面，可能通过其 NEU 活性改变肿瘤细胞表面唾液酸修饰状态，从而改变肿瘤细胞活性；另一方面，其作为信号转导中间蛋白，参与和肿瘤发生发展相关的信号通路[16]。本研究通过 RNA 干扰的方式降低 NEU3 在骨肉瘤细胞 MG-63 中的表达，发现 NEU3 表达下降后，MG-63 细胞成活率显著降低、凋亡率显著升高，且与 NEU3 表达量相关。说明 NEU3 在 MG-63 细胞中的表达量与该细胞的生存具有紧密联系。然而，本研究仅为体外实验，确认 NEU3 在骨肉瘤发生发展中的具体作用，仍需要结合体内实验进一步研究。NEU3 在 MG-63 细胞生存的促进作用，究竟是通过其 NEU 活性，还是参与肿瘤发生发展信号通路来发挥的，仍然有待进一步探索。
Ras 基因与 Bcl-2 基因是肿瘤研究中两个重要基因。当原癌基因 Ras 异常活化时，Ras 蛋白持续处于活化状态进而激活下游信号通路，使细胞无限增殖而引起肿瘤 [17-18]；而 Bcl-2 基因家族表达的凋亡抑制蛋白可通过抑制凋亡信号，从而阻碍细胞凋亡的激活，使肿瘤发生[19-20]。本研究结果发现，NEU3 的表达对原癌基因 Ras 蛋白以及凋亡抑制蛋白 Bcl-2 的影响只在 100 nmol/L NEU3 siRNA 处理时与正常对照组有显著性区别，提示 NEU3 对 MG-63 的抑制有可能与其他信号通路有关。
综上述，本实验研究结果表明，通过抑制 NEU3 的表达可以抑制骨肉瘤 MG-63 细胞的增殖、增加其凋亡。提示若能找到一种稳定、安全、可靠地降低 NEU3 表达的方法，就可以抑制骨肉瘤细胞的增殖，进一步实现诱导人骨肉瘤细胞凋亡的目的，为骨肉瘤治疗带来新的方法。
图1
免疫荧光染色观察 NEU3 在 MG-63 细胞中的表达（荧光显微镜×400）
从左至右分别为 NEU3、DAPI 及两者叠加
Figure1. NEU3 expression in MG-63 cells via immunofluorescence staining (Fluorescent microscope×400)From left to right for NEU3, DAPI, and merge
图2
流式细胞仪检测各组 MG-63 细胞凋亡情况
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure2. The apoptosis of MG-63 cells in different groups detected by flow cytometrya. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
图3
Western blot 检测各组 Ras 和 Bcl-2 蛋白表达
a. 电泳图 1：B 组 2：C 组 3：D 组 4：E 组 5：A 组；b. 各组 Ras 蛋白相对表达量；c. 各组 Bcl-2 蛋白相对表达量
Figure3. Protein expressions of Ras and Bcl-2 in different groups detected by Western blota. Electrophorogram 1: Group B 2: Group C 3: Group D 4: Group E 5: Group A; b. Relative expression of Ras protein in different groups; c. Relative expression of Bcl-2 protein in different groups
