引用本文： 张楠, 刘娜, 孙楚, 朱剑峰, 王东旭, 戴云峰, 吴云峰, 王亚明, 李军雷, 赵德伟, 闫景龙. 新型微弧氧化涂层镁-锌-钙合金支架/自体颗粒骨修复兔临界性骨缺损的研究. 中国修复重建外科杂志, 2018, 32(3): 298-305. doi: 10.7507/1002-1892.201710003 复制
临界性骨缺损（critical size bone defect，CSD）是指由严重的创伤、感染、骨肿瘤切除、人工关节置换术后翻修、先天畸形等原因引起的，达到一定长度或范围后不能自然愈合，又不能通过单纯固定解决的骨缺损[1]，一直是临床骨科治疗的难点。目前常用带血管蒂骨移植修复大段骨缺损，但存在骨瓣营养血管位置不确定、手术创伤大、受局部血运影响大、学习曲线高、一旦失败后果严重等问题[2-3]。自体颗粒骨移植虽然一直被认为是治疗骨缺损的“金标准”[4]，但也存在供骨量有限、供区并发症、结构松散、易被机体吸收等缺陷，在修复长骨缺损时常需同时植入金属钛网给予支撑稳定。但金属钛网无诱导成骨能力，植入后易引起局部塌陷、慢性炎症、异物反应等并发症；同时，因其不可降解会在体内永久存留，进而对机体造成不良影响[5]。近年来，由于镁（Mg）及其合金机械性能与人骨接近[6-7]，Mg2+ 在维持细胞结构和功能方面具有重要作用[8-9]，人体内约一半含量的 Mg 存在于骨组织中[10-11]，而且 Mg 及其合金能够促进局部钙沉积，具有良好的骨传导性和骨诱导性[12-14]。因此，Mg 合金作为一种潜在骨科内植物材料受到广泛关注。
Mg 合金作为唯一具有可降解性的金属生物材料，近年来虽然有研究将其作为骨替代物来尝试修复骨缺损，并获得良好效果[15-16]，但是将 Mg 合金制备成支架修复大段长骨缺损依然鲜有报道。本研究采用 Mg-锌（Zn）-钙（Ca）合金为材料，首次设计制造了一种新型中空圆柱形支架，这种结构在降低支架质量（约 50%）同时，还能维持足够机械强度，内部类似皮质骨的空间允许填充自体颗粒骨，表面均匀分布的网孔有助于骨痂长入。我们假设结合自体颗粒骨诱导成骨的特性，发挥 Mg 合金良好的骨诱导性、可降解性和力学性能，尝试利用这种新型支架修复 CSD。同时为了增加这种支架在体内的抗腐蚀性和生物相容性，我们采用微弧氧化（micro-arc oxidation，MAO）技术在其表面添加一层 10 μm 厚生物陶瓷涂层，并通过动物实验来评估这种支架修复 CSD 的效果，同时进一步评估 MAO 涂层对支架体内抗腐蚀性和生物相容性的影响。
1 材料与方法
1.1 Mg-Zn-Ca 合金支架材料
本研究采用的 Mg-Zn-Ca 合金支架由哈尔滨工业大学材料学院提供，以 Mg-Zn-Ca 合金为主要基质材料［2.5 wt%～3.0 wt% Ca，0.7 wt%～1.3 wt% Zn，0.2 wt%锰（Mn）和纯 Mg］，采用压铸工艺制备成圆柱形管状支架（长 15 mm、内径 3 mm、外径 5 mm），表面均匀分布 12 个直径 1 mm 的圆孔；并通过 MAO 技术对其表面改型，制备一层约 10 μm 厚的生物陶瓷涂层[17]，主要成分为 MgO，此外还含有 Mg 和 Ca 的磷酸盐。见图 1a。所有支架在植入前均采用环氧乙烷气体消毒。
1.2 实验动物及主要试剂、仪器
成年新西兰白兔 72 只，雌雄各半，体质量（2.71±0.32）kg，由齐齐哈尔医学院动物实验中心提供。
戊巴比妥钠（北京普博斯生物科技有限公司）；钙黄绿素（Sigma-Aldrich 公司，美国）；Van Gieson 染色液（上海博谷生物科技有限公司）。CR-IR 357 Capsula X 线机（富士公司，日本）；Siemens Inveon Micro-CT、Inveon 软件（Siemens 公司，德国）；EXAKT00CP 型切片机、EXAKT00CS 磨片机、DM4000B 荧光显微镜（Leica 公司，德国）；Hitachi 7600 自动生化分析仪（Hitachi 公司，日本）；X71 光学显微镜及成像系统（Olympus 公司，日本）。
1.3 实验分组及造模方法
将新西兰白兔随机分为 3 组，每组 24 只。A 组：无涂层 Mg-Zn-Ca 合金支架组；B 组：MAO 涂层 Mg-Zn-Ca 合金支架组；C 组：单纯自体颗粒骨植骨对照组。所有动物以 3% 戊巴比妥钠溶液（30 mg/kg）耳缘静脉注射麻醉，四肢固定于手术台上，双侧前肢剃毛备皮常规消毒。于前肢中段背侧作 4 cm 弧形切口，切开皮肤分离组织显露尺骨中段，用摆锯截骨制备 15 mm 长 CSD 模型（图 1b）。A、B 组将截取的尺骨咬碎制成颗粒骨（1～3 mm）填充于支架内，压实后植入尺骨缺损处（图 1c），生理盐水反复冲洗后通过缝合肌肉及筋膜固定支架；C 组将自体颗粒骨原位植入至骨缺损部位。关闭切口后无菌包扎。造模后动物分笼饲养，可在无外固定情况下立即自由活动并充分饮食、水；预防性肌肉注射青霉素 80 万 U 3 d，每天 2 次。术后 2、4、8、12 周每组各取 6 只动物进行研究。
1.4 观测指标
1.4.1 大体观察
观察动物一般状态、活动、摄入食水、体质量、切口愈合及炎性并发症发生情况等；同时监测 A、B 组动物局部皮下积气情况，利用无菌注射器局部穿刺收集局部皮下积气，记录积气量。
1.4.2 X 线片观察
利用 CR-IR 357 Capsula X 线机行侧位 X 线扫描，投射条件：70 V，0.69 mA，1.5 s。扫描后由 3 位放射科医师采用双盲法对骨缺损愈合情况进行评分，采用 Lane-Sandhu 评分标准[18]，范围从 0 分（未治疗）到 12 分（恢复正常骨结构），7 分以上认为骨缺损初步愈合。
1.4.3 Micro-CT 扫描
利用 Siemens Inveon Micro-CT 在电压 80 kV、电流 500 μA 下扫描，利用 Inveon 软件对数据进行处理。鉴于 C 组无支架，因此仅观察 A、B 组术后支架降解情况及术后 12 周缺损部位新骨形态。按以下公式计算术后 4、8、12 周支架降解丢失体积百分比（ΔV）和降解速度（corrosion rate，CR），ΔV=（V0–Vx）/V0×100%，其中 V0 为支架初始体积，Vx 为不同时间点支架剩余体积；CR=（V0–Vx）/（A×t），其中 A 是支架初始面积，t 是术后时间（单位为年）。
1.4.4 血清学指标检测
术后各时间点处死实验动物前，清晨空腹耳缘静脉采血，抗凝，将血样置于室温下静止 1 h，以离心半径 20 cm、3 500 r/min 离心 10 min，分离上清液，采用 Hitachi 7600 自动生化分析仪测量血清中 Mg2+ 和 Ca2+ 浓度。
1.4.5 Van Gieson 染色观察
术后各时间点采用驱血法处死动物后收集前肢，去除皮肤软组织剥离尺骨，70% 乙醇固定；梯度乙醇真空脱水、透明、脱脂、包埋，然后固定于 EXAKT00CP 型切片机切成 200 μm 厚硬组织切片，EXAKT00CS 磨片机依次以 800、1 200、2 500 目水砂纸打磨抛光获得 50 μm 厚骨磨片；常规 Van Gieson 染色后，4 倍光镜下观察缺损部位新生骨组织形态。
1.4.6 组织病理学观察
术后 12 周处死各组动物后收集脑、肝、肾和脾组织，常规行 HE 染色，20 倍光镜下观察组织结构。
1.5 统计学方法
采用 SPSS18.0 统计软件进行分析。数据以均值±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；两组间比较采用独立样本t检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
所有实验动物均耐受手术，术后麻醉苏醒后即可自由活动；术后 2 d 食欲较差，考虑麻醉或术后疼痛所致；2 d 后一般状态可，患肢活动良好、体质量无明显减轻，切口无炎性反应；术后 1 周左右切口愈合，10 d 后拆线。
局部穿刺收集皮下积气显示，A、B 组皮下积气量均随植入时间延长而增加，于 8 周达高峰后迅速减少。术后 2、4、8 周 B 组皮下积气量少于 A 组，2、4 周时两组间比较差异有统计学意义（t=2.651，P=0.023；t=2.544，P=0.013），8周时差异无统计学意义（t=1.687，P=0.120）；但术后 12 周时 B 组积气量多于 A 组，差异亦有统计学意义（t=2.343，P=0.039）。见图 2。
2.2 X 线片观察
X 线片观察示，术后 2 周时各组均未见明显骨痂生成。2 周后 C 组骨缺损修复效果良好，仅 12 周时在局部存在一定程度的骨吸收。与 C 组比较，A、B 组术后 4 周植入物周围仅可见少量骨痂生成，但随后显著增多，8 周时骨缺损部分修复，支架外可观察到新生骨桥形成，12 周时缺损完全修复，同时可观察到 B 组新生骨组织塑形明显优于 A 组。见图 3。
术后 4、8 周 C 组 X 线片评分显著高于 A、B 组，差异有统计学意义（P<0.05）；术后 8 周时 B 组显著高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）。术后 12 周 B、C 组显著高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）；但 B、C 组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 4。
2.3 Micro-CT 扫描
Micro-CT 扫描观察示，术后 12 周，可见 A、B 组骨缺损部位由大量新生骨填充，但 A 组骨痂不规则，可见大量积气，支架消失；而 B 组仍可观察到少量残余支架结构，骨缺损部位新生骨痂较 A 组致密，周围积气明显较 A 组减少。见图 5。
术后 4、8 周，B 组 CR 及ΔV 均显著低于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）；术后 12 周，A 组支架已完全降解消失。见表 1。
表1
术后各时间点 A、B 组ΔV 及 CR 比较（n=6，
）
Table1.
Comparison of ΔV and CR between groups A and B at different time points (n=6,
)
2.4 血清学指标检测
术后各时间点 3 组血清 Mg2+、Ca2+ 浓度比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 6。
2.5 Van Gieson 染色观察
由于术后 2 周无明显骨痂生成，因此收集术后 4、8、12 周骨缺损周围新骨进行组织学检测。术后 4 周，各组缺损部位周围均可观察到排列不规则、形态不成熟的骨细胞及大量软骨细胞；A 组支架与新骨之间形成厚纤维结缔组织膜，而 B 组支架周围纤维结缔组织膜明显较薄。术后 8 周，各组缺损部位周围均可观察更多成熟骨细胞，且排列明显较 4 周时规则，C 组软骨细胞明显少与其他两组；A 组支架周围纤维膜仍明显厚于 B 组。术后 12 周，A、B 组支架周围新生骨内成熟骨细胞进一步增多且排列更规整，周围的纤维膜消失；B 组支架周围观察到少量软骨细胞分布。见图 7。
2.6 组织病理学观察
术后 12 周，3 组实验动物的肝、脑、肾及脾组织 HE 染色均未见明显病理改变。见图 8。
图1
MAO 涂层 Mg-Zn-Ca 合金支架及动物模型制备过程示意图
a. 支架外观；b. 兔尺骨 CSD 模型；c. 支架植入骨缺损后
Figure1. Appearance of MAO coated Mg-Zn-Ca alloy scaffold and the schematic diagram of the operation processa. Appearance of the scaffold; b. Ulna CSD model of rabbit; c. After implanting the scaffold into defect
图2
术后各时间点 A、B 组动物局部皮下积气量比较
Figure2.
Comparison of local subcutaneous pneumatosis between groups A and B at different time points
图3
术后各时间点各组 X 线片观察
从左至右依次为术后 2、4、8、12 周 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure3. X-ray films of 3 groups at different time pointsFrom left to right for postoperative at 2, 4, 8, and 12 weeks, respectivelya. Group A; b. Group B; c. Group C
图4
术后各时间点各组 X 线片评分比较
Figure4.
Comparison of X-ray scores between groups at different time points
图5
术后 12 周 A、B 组 Micro-CT 扫描观察（×20）
1：不规则的新生骨组织 2：剩余支架及降解产物 3：组织间积气 a. A 组；b. B 组
Figure5. Micro-CT images of groups A and B at 12 weeks after surgery (×20)1: Irregular renew bone 2: Scaffold or degradable products 3: Pneumatosis a. Group A; b. Group B
图6
术后各时间点各组血清 Mg2+、Ca2+ 浓度比较
a. Mg2+；b. Ca2+
Figure6. Comparison of Mg2+ and Ca2+ concentrations between groups at different time pointsa. Mg2+; b. Ca2+
图7
术后各时间点各组 Van Gieson 染色观察（×4）
白箭头示支架，黑箭头示纤维结缔组织膜 从左至右依次为 A 组、B 组、C 组a. 术后 4 周；b. 术后 8 周；c. 术后 12 周
Figure7. Van Gieson staining observation of 3 groups at different time points (×4)White arrow indicated the scaffold, black arrow indicated fibrous connective tissue membrane From left to right for groups A, B, and C, respectively a. Postoperative at 4 weeks; b. Postoperative at 8 weeks; c. Postoperative at 12 weeks
图8
术后 12 周各组各器官组织病理学观察（HE×20）
从左至右依次为肝、脑、肾及脾组织 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure8. Histopathological observation of organs in each group at 12 weeks after surgery (HE×20)From left to right for liver, brain, kidney, and spleen, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
3 讨论
目前已有大量报道显示，Mg-Zn-Ca 合金具有良好生物相容性、骨诱导性及抗腐蚀性。Fazel 等[19]通过体外细胞毒性实验证实，采用 Mg-Zn-Ca 合金提取液培养的脂肪干细胞具有良好活性；Zhao 等[20]研究显示，Mg-Zn-Ca 合金能够诱导内植物周围形成大量新骨组织，具有促进新骨形成的作用；Jang 等[21]的研究表明，经过等离子电解氧化处理的 Mg-Zn-Ca 合金在体内具有良好抗腐蚀性；Smith 等[15]将 AZ31 Mg 合金板卷成圆筒状结构，并将其植入至兔尺骨 CSD 中，结果显示植入 12 周后尺骨缺损能够得到有效修复，力学检测结果显示经修复后的尺骨力学特征能够达到正常尺骨标准；葛野等[16]利用 Mg-锶（Sr）合金制备成多孔骨移植替代品修复 1.0 cm 桡骨缺损，结果也显示 Mg-Sr 合金能够有效修复骨缺损。本研究将 Mg-Zn-Ca 合金制备成金属支架并填充自体颗粒骨来修复兔尺骨 CSD，该支架在早期能提供足够支撑，降解释放 Mg2+、Ca2+ 促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞活性；同时，对移植的自体颗粒骨可起到稳定保护作用，避免其被机体二次吸收，有利于成骨因子的释放及微血管长入，共同促进局部新骨生成。
本研究结果显示，随着植入时间延长，支架周围均形成新骨并逐渐包裹支架，术后 12 周 X 线片示骨缺损部位由大量新生骨填充，尺骨连续性和完整性得到良好恢复，而同期 C 组则出现一定程度骨吸收。术后 12 周 Micro-CT 扫描也显示，A、B 组在骨缺损部位均存在大量骨小梁不规则排列的新生骨组织，并完全填充缺损部位，未观察到类似骨吸收现象。与 A 组术后 X 线片评分比较，B 组在实验过程中均表现出更好的愈合效果，且术后 12 周 X 线片评分显示 B 组骨愈合效果与 C 组并无显著差异。我们认为这可能是 MAO 涂层所致，这种涂层含有 1 个致密内层和 1 个多孔外层，致密内层在植入初期能阻止体液对 Mg 基质的腐蚀及金属离子向机体的游离，在某种程度上减少氢气释放，从而减小了对新骨再生的影响；多孔外层具有疏松孔径，有利于成骨细胞附着及骨组织生长，也有利于植入材料与骨的机械嵌合。而 A 组支架没有 MAO 涂层保护，导致体内降解速度过快，局部氢气大量堆积以及力学性能快速丢失，都会影响到局部新骨再生。
为了验证 MAO 涂层对支架耐腐蚀性的影响，我们利用 Micro-CT 对各组术后各时间点样本进行扫描并计算ΔV 和 CR。结果显示，A 组支架在术后 4 周即丢失了近一半体积，8 周时已几乎降解消失；而 B 组支架术后 4、8 周时体积损失及降解速度均明显小于 A 组，至术后 12 周时才基本降解消失；说明 10 μm MAO 涂层能有效提高 Mg-Zn-Ca 合金支架的耐腐蚀性，使其在体内较长时间保持一定的结构完整。皮下积气量测量结果也间接证明了这个结果。Mg 合金在体内降解并释放氢气，当 Mg 金属腐蚀速度过快和/或气体吸收不充分，会导致局部气体残留形成皮下积气。两支架组皮下积气量结果显示，术后 2、4、8 周 B 组积气量均明显少于 A 组，但 12 周时 B 组积气量却多于 A 组，这可能是由于 A 组支架此时已基本降解消失，而 B 组支架依然持续产气所致。值得注意的是，术后 8 周 A、B 组积气量比较差异无统计学意义，提示 MAO 涂层可能在 8 周左右已基本被腐蚀吸收失去其保护功能。因此，B 组支架 CR 逐渐增加，说明 MAO 涂层在植入 8 周前能够有效增加 Mg-Zn-Ca 合金在体内的抗腐蚀性。
Mg 合金的生物相容性已被大量体内及体外实验所证实[19-21]。而 MAO 涂层被认为是一种仿生涂层，能够有效增加 Mg 合金基质的生物相容性，减少机体排斥反应，使成骨细胞更容易增殖并黏附于支架表面[22-23]。也有研究报道 Mg 合金与新生物之间会形成一层纤维结缔组织膜，这种纤维结缔组织膜本质上是机体的一种异物排斥反应，它能够诱导淋巴细胞和炎性因子渗出，从而限制骨细胞的形成[24]。本研究组织学结果显示，实验过程中在 A、B 组支架与新生骨之间存在一层纤维结缔组织膜，而在 C 组并未发现类似纤维结缔组织膜，但 B 组支架周围的纤维结缔组织膜明显变薄且不连续，该结果说明 MAO 涂层能够有效增加 Mg-Zn-Ca 合金的生物相容性。同时由于我们植入的 Mg-Zn-Ca 合金支架体积相对较大，单位时间降解后会释放更多 Mg2+ 进入循环系统，可能会提高血清 Mg2+、Ca2+ 浓度，对肝、脑、肾及脾等器官造成不良影响。为了验证这种 Mg-Zn-Ca 合金支架的生物安全性，我们进一步监测了实验动物的各种生化指标及主要脏器的病理改变。结果显示，与 C 组比较，A、B 组血清 Mg2+和 Ca2+ 均未出现明显变化；病理学结果也显示 A、B 组支架在降解过程中未对机体重要器官产生不良影响。进一步证明了这种新型 Mg-Zn-Ca 合金支架具有良好的生物相容性。
综上述，本研究结果表明该新型 MAO 涂层 Mg-Zn-Ca 合金支架联合自体颗粒骨能有效修复 CSD，降解产物对机体无不良影响；同时 10 μm MAO 涂层能够有效改善 Mg-Zn-Ca 合金支架的生物相容性、抗腐蚀性能以及促成骨性。但本研究还存在一些不足，首先，这种 Mg-Zn-Ca 合金支架在降解过程中形成局部皮下积气，这种皮下积气量可能会对新骨形成产生不良影响，还需进一步研究来控制其在体内降解速度，使其与自然骨愈合过程匹配。其次，本研究未进行相关生物力学检测，不能有效反映支架在体内机械性能的变化情况，也需要进一步研究完善。
临界性骨缺损（critical size bone defect，CSD）是指由严重的创伤、感染、骨肿瘤切除、人工关节置换术后翻修、先天畸形等原因引起的，达到一定长度或范围后不能自然愈合，又不能通过单纯固定解决的骨缺损[1]，一直是临床骨科治疗的难点。目前常用带血管蒂骨移植修复大段骨缺损，但存在骨瓣营养血管位置不确定、手术创伤大、受局部血运影响大、学习曲线高、一旦失败后果严重等问题[2-3]。自体颗粒骨移植虽然一直被认为是治疗骨缺损的“金标准”[4]，但也存在供骨量有限、供区并发症、结构松散、易被机体吸收等缺陷，在修复长骨缺损时常需同时植入金属钛网给予支撑稳定。但金属钛网无诱导成骨能力，植入后易引起局部塌陷、慢性炎症、异物反应等并发症；同时，因其不可降解会在体内永久存留，进而对机体造成不良影响[5]。近年来，由于镁（Mg）及其合金机械性能与人骨接近[6-7]，Mg2+ 在维持细胞结构和功能方面具有重要作用[8-9]，人体内约一半含量的 Mg 存在于骨组织中[10-11]，而且 Mg 及其合金能够促进局部钙沉积，具有良好的骨传导性和骨诱导性[12-14]。因此，Mg 合金作为一种潜在骨科内植物材料受到广泛关注。
Mg 合金作为唯一具有可降解性的金属生物材料，近年来虽然有研究将其作为骨替代物来尝试修复骨缺损，并获得良好效果[15-16]，但是将 Mg 合金制备成支架修复大段长骨缺损依然鲜有报道。本研究采用 Mg-锌（Zn）-钙（Ca）合金为材料，首次设计制造了一种新型中空圆柱形支架，这种结构在降低支架质量（约 50%）同时，还能维持足够机械强度，内部类似皮质骨的空间允许填充自体颗粒骨，表面均匀分布的网孔有助于骨痂长入。我们假设结合自体颗粒骨诱导成骨的特性，发挥 Mg 合金良好的骨诱导性、可降解性和力学性能，尝试利用这种新型支架修复 CSD。同时为了增加这种支架在体内的抗腐蚀性和生物相容性，我们采用微弧氧化（micro-arc oxidation，MAO）技术在其表面添加一层 10 μm 厚生物陶瓷涂层，并通过动物实验来评估这种支架修复 CSD 的效果，同时进一步评估 MAO 涂层对支架体内抗腐蚀性和生物相容性的影响。
1 材料与方法
1.1 Mg-Zn-Ca 合金支架材料
本研究采用的 Mg-Zn-Ca 合金支架由哈尔滨工业大学材料学院提供，以 Mg-Zn-Ca 合金为主要基质材料［2.5 wt%～3.0 wt% Ca，0.7 wt%～1.3 wt% Zn，0.2 wt%锰（Mn）和纯 Mg］，采用压铸工艺制备成圆柱形管状支架（长 15 mm、内径 3 mm、外径 5 mm），表面均匀分布 12 个直径 1 mm 的圆孔；并通过 MAO 技术对其表面改型，制备一层约 10 μm 厚的生物陶瓷涂层[17]，主要成分为 MgO，此外还含有 Mg 和 Ca 的磷酸盐。见图 1a。所有支架在植入前均采用环氧乙烷气体消毒。
1.2 实验动物及主要试剂、仪器
成年新西兰白兔 72 只，雌雄各半，体质量（2.71±0.32）kg，由齐齐哈尔医学院动物实验中心提供。
戊巴比妥钠（北京普博斯生物科技有限公司）；钙黄绿素（Sigma-Aldrich 公司，美国）；Van Gieson 染色液（上海博谷生物科技有限公司）。CR-IR 357 Capsula X 线机（富士公司，日本）；Siemens Inveon Micro-CT、Inveon 软件（Siemens 公司，德国）；EXAKT00CP 型切片机、EXAKT00CS 磨片机、DM4000B 荧光显微镜（Leica 公司，德国）；Hitachi 7600 自动生化分析仪（Hitachi 公司，日本）；X71 光学显微镜及成像系统（Olympus 公司，日本）。
1.3 实验分组及造模方法
将新西兰白兔随机分为 3 组，每组 24 只。A 组：无涂层 Mg-Zn-Ca 合金支架组；B 组：MAO 涂层 Mg-Zn-Ca 合金支架组；C 组：单纯自体颗粒骨植骨对照组。所有动物以 3% 戊巴比妥钠溶液（30 mg/kg）耳缘静脉注射麻醉，四肢固定于手术台上，双侧前肢剃毛备皮常规消毒。于前肢中段背侧作 4 cm 弧形切口，切开皮肤分离组织显露尺骨中段，用摆锯截骨制备 15 mm 长 CSD 模型（图 1b）。A、B 组将截取的尺骨咬碎制成颗粒骨（1～3 mm）填充于支架内，压实后植入尺骨缺损处（图 1c），生理盐水反复冲洗后通过缝合肌肉及筋膜固定支架；C 组将自体颗粒骨原位植入至骨缺损部位。关闭切口后无菌包扎。造模后动物分笼饲养，可在无外固定情况下立即自由活动并充分饮食、水；预防性肌肉注射青霉素 80 万 U 3 d，每天 2 次。术后 2、4、8、12 周每组各取 6 只动物进行研究。
1.4 观测指标
1.4.1 大体观察
观察动物一般状态、活动、摄入食水、体质量、切口愈合及炎性并发症发生情况等；同时监测 A、B 组动物局部皮下积气情况，利用无菌注射器局部穿刺收集局部皮下积气，记录积气量。
1.4.2 X 线片观察
利用 CR-IR 357 Capsula X 线机行侧位 X 线扫描，投射条件：70 V，0.69 mA，1.5 s。扫描后由 3 位放射科医师采用双盲法对骨缺损愈合情况进行评分，采用 Lane-Sandhu 评分标准[18]，范围从 0 分（未治疗）到 12 分（恢复正常骨结构），7 分以上认为骨缺损初步愈合。
1.4.3 Micro-CT 扫描
利用 Siemens Inveon Micro-CT 在电压 80 kV、电流 500 μA 下扫描，利用 Inveon 软件对数据进行处理。鉴于 C 组无支架，因此仅观察 A、B 组术后支架降解情况及术后 12 周缺损部位新骨形态。按以下公式计算术后 4、8、12 周支架降解丢失体积百分比（ΔV）和降解速度（corrosion rate，CR），ΔV=（V0–Vx）/V0×100%，其中 V0 为支架初始体积，Vx 为不同时间点支架剩余体积；CR=（V0–Vx）/（A×t），其中 A 是支架初始面积，t 是术后时间（单位为年）。
1.4.4 血清学指标检测
术后各时间点处死实验动物前，清晨空腹耳缘静脉采血，抗凝，将血样置于室温下静止 1 h，以离心半径 20 cm、3 500 r/min 离心 10 min，分离上清液，采用 Hitachi 7600 自动生化分析仪测量血清中 Mg2+ 和 Ca2+ 浓度。
1.4.5 Van Gieson 染色观察
术后各时间点采用驱血法处死动物后收集前肢，去除皮肤软组织剥离尺骨，70% 乙醇固定；梯度乙醇真空脱水、透明、脱脂、包埋，然后固定于 EXAKT00CP 型切片机切成 200 μm 厚硬组织切片，EXAKT00CS 磨片机依次以 800、1 200、2 500 目水砂纸打磨抛光获得 50 μm 厚骨磨片；常规 Van Gieson 染色后，4 倍光镜下观察缺损部位新生骨组织形态。
1.4.6 组织病理学观察
术后 12 周处死各组动物后收集脑、肝、肾和脾组织，常规行 HE 染色，20 倍光镜下观察组织结构。
1.5 统计学方法
采用 SPSS18.0 统计软件进行分析。数据以均值±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；两组间比较采用独立样本t检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 大体观察
所有实验动物均耐受手术，术后麻醉苏醒后即可自由活动；术后 2 d 食欲较差，考虑麻醉或术后疼痛所致；2 d 后一般状态可，患肢活动良好、体质量无明显减轻，切口无炎性反应；术后 1 周左右切口愈合，10 d 后拆线。
局部穿刺收集皮下积气显示，A、B 组皮下积气量均随植入时间延长而增加，于 8 周达高峰后迅速减少。术后 2、4、8 周 B 组皮下积气量少于 A 组，2、4 周时两组间比较差异有统计学意义（t=2.651，P=0.023；t=2.544，P=0.013），8周时差异无统计学意义（t=1.687，P=0.120）；但术后 12 周时 B 组积气量多于 A 组，差异亦有统计学意义（t=2.343，P=0.039）。见图 2。
2.2 X 线片观察
X 线片观察示，术后 2 周时各组均未见明显骨痂生成。2 周后 C 组骨缺损修复效果良好，仅 12 周时在局部存在一定程度的骨吸收。与 C 组比较，A、B 组术后 4 周植入物周围仅可见少量骨痂生成，但随后显著增多，8 周时骨缺损部分修复，支架外可观察到新生骨桥形成，12 周时缺损完全修复，同时可观察到 B 组新生骨组织塑形明显优于 A 组。见图 3。
术后 4、8 周 C 组 X 线片评分显著高于 A、B 组，差异有统计学意义（P<0.05）；术后 8 周时 B 组显著高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）。术后 12 周 B、C 组显著高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）；但 B、C 组间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 4。
2.3 Micro-CT 扫描
Micro-CT 扫描观察示，术后 12 周，可见 A、B 组骨缺损部位由大量新生骨填充，但 A 组骨痂不规则，可见大量积气，支架消失；而 B 组仍可观察到少量残余支架结构，骨缺损部位新生骨痂较 A 组致密，周围积气明显较 A 组减少。见图 5。
术后 4、8 周，B 组 CR 及ΔV 均显著低于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）；术后 12 周，A 组支架已完全降解消失。见表 1。
表1
术后各时间点 A、B 组ΔV 及 CR 比较（n=6，
）
Table1.
Comparison of ΔV and CR between groups A and B at different time points (n=6,
)
2.4 血清学指标检测
术后各时间点 3 组血清 Mg2+、Ca2+ 浓度比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 6。
2.5 Van Gieson 染色观察
由于术后 2 周无明显骨痂生成，因此收集术后 4、8、12 周骨缺损周围新骨进行组织学检测。术后 4 周，各组缺损部位周围均可观察到排列不规则、形态不成熟的骨细胞及大量软骨细胞；A 组支架与新骨之间形成厚纤维结缔组织膜，而 B 组支架周围纤维结缔组织膜明显较薄。术后 8 周，各组缺损部位周围均可观察更多成熟骨细胞，且排列明显较 4 周时规则，C 组软骨细胞明显少与其他两组；A 组支架周围纤维膜仍明显厚于 B 组。术后 12 周，A、B 组支架周围新生骨内成熟骨细胞进一步增多且排列更规整，周围的纤维膜消失；B 组支架周围观察到少量软骨细胞分布。见图 7。
2.6 组织病理学观察
术后 12 周，3 组实验动物的肝、脑、肾及脾组织 HE 染色均未见明显病理改变。见图 8。
图1
MAO 涂层 Mg-Zn-Ca 合金支架及动物模型制备过程示意图
a. 支架外观；b. 兔尺骨 CSD 模型；c. 支架植入骨缺损后
Figure1. Appearance of MAO coated Mg-Zn-Ca alloy scaffold and the schematic diagram of the operation processa. Appearance of the scaffold; b. Ulna CSD model of rabbit; c. After implanting the scaffold into defect
图2
术后各时间点 A、B 组动物局部皮下积气量比较
Figure2.
Comparison of local subcutaneous pneumatosis between groups A and B at different time points
图3
术后各时间点各组 X 线片观察
从左至右依次为术后 2、4、8、12 周 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure3. X-ray films of 3 groups at different time pointsFrom left to right for postoperative at 2, 4, 8, and 12 weeks, respectivelya. Group A; b. Group B; c. Group C
图4
术后各时间点各组 X 线片评分比较
Figure4.
Comparison of X-ray scores between groups at different time points
图5
术后 12 周 A、B 组 Micro-CT 扫描观察（×20）
1：不规则的新生骨组织 2：剩余支架及降解产物 3：组织间积气 a. A 组；b. B 组
Figure5. Micro-CT images of groups A and B at 12 weeks after surgery (×20)1: Irregular renew bone 2: Scaffold or degradable products 3: Pneumatosis a. Group A; b. Group B
图6
术后各时间点各组血清 Mg2+、Ca2+ 浓度比较
a. Mg2+；b. Ca2+
Figure6. Comparison of Mg2+ and Ca2+ concentrations between groups at different time pointsa. Mg2+; b. Ca2+
图7
术后各时间点各组 Van Gieson 染色观察（×4）
白箭头示支架，黑箭头示纤维结缔组织膜 从左至右依次为 A 组、B 组、C 组a. 术后 4 周；b. 术后 8 周；c. 术后 12 周
Figure7. Van Gieson staining observation of 3 groups at different time points (×4)White arrow indicated the scaffold, black arrow indicated fibrous connective tissue membrane From left to right for groups A, B, and C, respectively a. Postoperative at 4 weeks; b. Postoperative at 8 weeks; c. Postoperative at 12 weeks
图8
术后 12 周各组各器官组织病理学观察（HE×20）
从左至右依次为肝、脑、肾及脾组织 a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure8. Histopathological observation of organs in each group at 12 weeks after surgery (HE×20)From left to right for liver, brain, kidney, and spleen, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
3 讨论
目前已有大量报道显示，Mg-Zn-Ca 合金具有良好生物相容性、骨诱导性及抗腐蚀性。Fazel 等[19]通过体外细胞毒性实验证实，采用 Mg-Zn-Ca 合金提取液培养的脂肪干细胞具有良好活性；Zhao 等[20]研究显示，Mg-Zn-Ca 合金能够诱导内植物周围形成大量新骨组织，具有促进新骨形成的作用；Jang 等[21]的研究表明，经过等离子电解氧化处理的 Mg-Zn-Ca 合金在体内具有良好抗腐蚀性；Smith 等[15]将 AZ31 Mg 合金板卷成圆筒状结构，并将其植入至兔尺骨 CSD 中，结果显示植入 12 周后尺骨缺损能够得到有效修复，力学检测结果显示经修复后的尺骨力学特征能够达到正常尺骨标准；葛野等[16]利用 Mg-锶（Sr）合金制备成多孔骨移植替代品修复 1.0 cm 桡骨缺损，结果也显示 Mg-Sr 合金能够有效修复骨缺损。本研究将 Mg-Zn-Ca 合金制备成金属支架并填充自体颗粒骨来修复兔尺骨 CSD，该支架在早期能提供足够支撑，降解释放 Mg2+、Ca2+ 促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞活性；同时，对移植的自体颗粒骨可起到稳定保护作用，避免其被机体二次吸收，有利于成骨因子的释放及微血管长入，共同促进局部新骨生成。
本研究结果显示，随着植入时间延长，支架周围均形成新骨并逐渐包裹支架，术后 12 周 X 线片示骨缺损部位由大量新生骨填充，尺骨连续性和完整性得到良好恢复，而同期 C 组则出现一定程度骨吸收。术后 12 周 Micro-CT 扫描也显示，A、B 组在骨缺损部位均存在大量骨小梁不规则排列的新生骨组织，并完全填充缺损部位，未观察到类似骨吸收现象。与 A 组术后 X 线片评分比较，B 组在实验过程中均表现出更好的愈合效果，且术后 12 周 X 线片评分显示 B 组骨愈合效果与 C 组并无显著差异。我们认为这可能是 MAO 涂层所致，这种涂层含有 1 个致密内层和 1 个多孔外层，致密内层在植入初期能阻止体液对 Mg 基质的腐蚀及金属离子向机体的游离，在某种程度上减少氢气释放，从而减小了对新骨再生的影响；多孔外层具有疏松孔径，有利于成骨细胞附着及骨组织生长，也有利于植入材料与骨的机械嵌合。而 A 组支架没有 MAO 涂层保护，导致体内降解速度过快，局部氢气大量堆积以及力学性能快速丢失，都会影响到局部新骨再生。
为了验证 MAO 涂层对支架耐腐蚀性的影响，我们利用 Micro-CT 对各组术后各时间点样本进行扫描并计算ΔV 和 CR。结果显示，A 组支架在术后 4 周即丢失了近一半体积，8 周时已几乎降解消失；而 B 组支架术后 4、8 周时体积损失及降解速度均明显小于 A 组，至术后 12 周时才基本降解消失；说明 10 μm MAO 涂层能有效提高 Mg-Zn-Ca 合金支架的耐腐蚀性，使其在体内较长时间保持一定的结构完整。皮下积气量测量结果也间接证明了这个结果。Mg 合金在体内降解并释放氢气，当 Mg 金属腐蚀速度过快和/或气体吸收不充分，会导致局部气体残留形成皮下积气。两支架组皮下积气量结果显示，术后 2、4、8 周 B 组积气量均明显少于 A 组，但 12 周时 B 组积气量却多于 A 组，这可能是由于 A 组支架此时已基本降解消失，而 B 组支架依然持续产气所致。值得注意的是，术后 8 周 A、B 组积气量比较差异无统计学意义，提示 MAO 涂层可能在 8 周左右已基本被腐蚀吸收失去其保护功能。因此，B 组支架 CR 逐渐增加，说明 MAO 涂层在植入 8 周前能够有效增加 Mg-Zn-Ca 合金在体内的抗腐蚀性。
Mg 合金的生物相容性已被大量体内及体外实验所证实[19-21]。而 MAO 涂层被认为是一种仿生涂层，能够有效增加 Mg 合金基质的生物相容性，减少机体排斥反应，使成骨细胞更容易增殖并黏附于支架表面[22-23]。也有研究报道 Mg 合金与新生物之间会形成一层纤维结缔组织膜，这种纤维结缔组织膜本质上是机体的一种异物排斥反应，它能够诱导淋巴细胞和炎性因子渗出，从而限制骨细胞的形成[24]。本研究组织学结果显示，实验过程中在 A、B 组支架与新生骨之间存在一层纤维结缔组织膜，而在 C 组并未发现类似纤维结缔组织膜，但 B 组支架周围的纤维结缔组织膜明显变薄且不连续，该结果说明 MAO 涂层能够有效增加 Mg-Zn-Ca 合金的生物相容性。同时由于我们植入的 Mg-Zn-Ca 合金支架体积相对较大，单位时间降解后会释放更多 Mg2+ 进入循环系统，可能会提高血清 Mg2+、Ca2+ 浓度，对肝、脑、肾及脾等器官造成不良影响。为了验证这种 Mg-Zn-Ca 合金支架的生物安全性，我们进一步监测了实验动物的各种生化指标及主要脏器的病理改变。结果显示，与 C 组比较，A、B 组血清 Mg2+和 Ca2+ 均未出现明显变化；病理学结果也显示 A、B 组支架在降解过程中未对机体重要器官产生不良影响。进一步证明了这种新型 Mg-Zn-Ca 合金支架具有良好的生物相容性。
综上述，本研究结果表明该新型 MAO 涂层 Mg-Zn-Ca 合金支架联合自体颗粒骨能有效修复 CSD，降解产物对机体无不良影响；同时 10 μm MAO 涂层能够有效改善 Mg-Zn-Ca 合金支架的生物相容性、抗腐蚀性能以及促成骨性。但本研究还存在一些不足，首先，这种 Mg-Zn-Ca 合金支架在降解过程中形成局部皮下积气，这种皮下积气量可能会对新骨形成产生不良影响，还需进一步研究来控制其在体内降解速度，使其与自然骨愈合过程匹配。其次，本研究未进行相关生物力学检测，不能有效反映支架在体内机械性能的变化情况，也需要进一步研究完善。
