引用本文： 赵亚红, 牛长梅, 龚佳欢, 王鸿博, 杨宇民. 静电纺丝石墨烯/丝素蛋白纳米膜的构建及体外生物相容性研究. 中国修复重建外科杂志, 2017, 31(9): 1119-1126. doi: 10.7507/1002-1892.201703046 复制
周围神经损伤是临床常见问题，在创伤患者中发病率约 2.8%[1-2]。周围神经一定程度上能够再生[3]，但较长周围神经缺损的修复仍存在许多障碍[4-5]。组织工程神经有望解决这一难题，目前已进行了大量研究[6-7]。但组织工程神经通常不具备活性，修复较长神经缺损的效果仍远不及自体神经。因此，制备理想的支架材料是一个具有挑战性的任务。考虑到神经组织本身的结构和电生理特性，合适的支架材料不仅需具有独特表面形貌，以改善神经细胞和支架之间的相互作用、调控细胞生长，同时也需要与在体神经形成良好的电生理整合[8-9]。
伴随着生物材料研究的快速发展，新型导电纳米材料已应用于组织工程神经研究领域，其中碳基材料，如石墨、富勒烯、纳米管和纳米带等，因具有良好的机械性能和导电性，受到了研究人员的关注[10]。石墨烯（graphene，Gr）是碳基材料的重要成员，是具有蜂窝晶格结构的 sp2杂化碳原子的二维单层片材，其特殊的分子构型使其具有优越的物化性质，如高电导率和热导率、高机械强度以及强光电性[11-12]；但因存在高疏水性、难以均匀分散、化学稳定难以与化学试剂反应以及缺乏生物相容性等缺点，应用大大受限[13]。为克服这些缺点，有研究将天然生物大分子结合至 Gr 表面[14]。丝素蛋白（silk fibroin，SF）具有优越的理化性能，越来越多应用于组织工程支架的制备[15-16]。静电纺丝技术环节少、设备简单、操作方便，是制备纳米/微米纤维膜的简便方法，采用静电纺丝制备的纳米纤维支架材料已广泛应用于骨、血管、神经、软骨、皮肤等组织工程研究领域[17-19]。
本研究利用静电纺丝技术制备 Gr-SF 纳米膜并检测其理化性能，探讨不同浓度 Gr 对 Gr-SF 纳米膜理化性能的影响；同时通过 L929 细胞毒性和雪旺细胞共培养实验，探讨细胞相容性好、促进神经细胞生长的 Gr 最佳浓度，为神经组织工程研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
DMEM 培养基、FBS、青链霉素、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美国）；多聚赖氨酸（Sigma 公司，美国）；天然蚕丝（南通海安鑫缘蚕丝有限公司）；Gr 纳米片层粉末[型号 G0441；梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]；EdU 剂盒（广州锐博生物科技有限公司）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；Dojindo 公司，日本）。DSA20 测角器（Gmbh Hambur 公司，德国）；激光扫描共聚焦显微镜（Leica 公司，德国）；酶标仪（Bio-Tek 公司，美国）。
1.2 Gr-SF 静电纺丝溶液的配制及检测
1.2.1 不同质量分数Gr-SF静电纺丝溶液的配制 取天然蚕丝，经 0.5% Na2CO3 水溶液 100℃ 煮沸 30 min，重复 3 次，获得 SF 纤维。根据 Yang 等[20]方法制备 SF 溶液：将 SF 纤维溶于 CaCl2/H2O/EtOH（1∶8∶2）三元体系中，80℃、1 h；随后于透析袋（截留分子量 12 000～14 000）中室温透析 3 d。然后将 SF 溶液置于不锈钢皿中风干成膜，再溶解至 98% 甲酸中获得 SF 质量分数为 13% 的静电纺丝溶液。将 Gr 纳米片层粉末溶于 13% 静电纺丝溶液中，分别制备 Gr 质量分数为 0、5%、10%、15%、20% 的 Gr-SF 静电纺丝溶液，磁力搅拌器室温搅拌，然后用超声波发生器进行超声处理 60 min，720 W 进行声波降解，频率 20 kHz。
1.2.2 静态接触角测定 用 DSA20 测角器，采用滴液法[21]测量不同质量分数（0、5%、10%、15%、20%）Gr-SF 静电纺丝溶液的静态接触角，测量前 1 h 制备溶液。各 Gr-SF 静电纺丝溶液设 3 个平行样，每个样品测量 3 次，取均值。
1.3 Gr-SF 纳米膜制备及化学处理
自制静电纺丝接收装置，由一高电压供应装置组成，包括用 1 个毛细管针（内径 0.9 mm，针尖内装有静电纺丝溶液的液滴）制成的阳极发生器和 1 个绝缘收集板制成的阴极收集器；发生器针尖和收集器间距离为 7～13 cm，通过注射泵维持恒定体积流速为 0.3 mL/h，使静电纺丝溶液维持于针管内。使用针尖对阳极发生器施加 20 kV 高压，最终在绝缘不锈钢负载的载玻片上形成静电纺丝膜。取静电纺丝膜置于无水乙醇中 10 min 以诱导构象转变，随后用蒸馏水 37℃ 洗涤 72 h，去除残余甲酸。采用上述方法制备 0、5%、10%、15%、20%Gr-SF 纳米膜（分别设为 A、B、C、D、E 组）。
1.4 Gr-SF 纳米膜观测指标
1.4.1 Gr-SF纳米膜表面性状观察 大体观察各组 Gr-SF 纳米膜颜色，光镜及扫描电镜下观察 Gr-SF 纳米膜表面、纤维排列以及 Gr 颗粒分散情况。
1.4.2 电导率检测 采用电化学工作站循环伏安法，于室温下检测各组 Gr-SF 纳米膜电导率。实验采用典型的三电极系统[包括铂网电极、Ag/AgCl 电极（饱和 KCl）参考电极和玻碳工作电极]，在含 5.0 mmol/L Fe（CN）64–/3–的 0.1 mol/L KCl 中测量膜表面电化学性能（100～600 mV），扫描速率 100 mV/s，探针间距 10 mm。各组取 3 个样品，每个样品测 3 次，取均值。
1.4.3 孔隙率检测 采用溶液置换法[22]检测各组 Gr-SF 纳米膜孔隙率。以正己烷溶液作为置换液，将 Gr-SF 纳米膜浸于已知体积（V1）的正己烷溶液中 5 min，记录总体积（V2）；将膜取出，记录剩余体积（V3）。按以下公式计算 Gr-SF 纳米膜孔隙率：（V1–V3）/（V2–V3）×100%。
1.4.4 体外细胞毒性检测 ① Gr-SF 纳米膜浸提液的制备：将灭菌后的各组 Gr-SF 纳米膜分别置于离心管中，按 GB/T16886-ISO10993 标准以表面积 6 cm2Gr-SF 纳米膜加 1 mL 培养基的比例加入含 10%FBS 的 DMEM 培养基，（37.0±0.5）℃ 浸泡（72.0±0.5）h，制备的浸提液必须在 12 h 内使用。② 体外细胞毒性检测：根据 ISO-10993 标准采用 MTT 法检测 Gr-SF 纳米膜体外细胞毒性。取 L929 细胞（中国科学院上海生命科学研究院），然后按照 5 000 个/孔密度接种于 96 孔板中，分别与 100 μL 各组 Gr-SF 纳米膜浸提液于 37℃ 下孵育 1、4、7 d，每组设 6 个复孔，完全培养基为对照组，无细胞孔为调零孔，实验重复 3 次。孵育后各时间点去除培养基，PBS 洗涤细胞 3 次；每孔加入 5 mg/mL MTT 溶液 20 μL，继续培养 4 h；弃上清液，每孔加入 100 μL DMSO；用 EIX-800 Microelisa 读数器，在 570 nm 波长下测量吸光度（A）值，以每孔与调零孔 A 值的差值作为最终 A 值，取均值。
1.5 Gr-SF 纳米膜对雪旺细胞形态及增殖的影响
1.5.1 雪旺细胞分离培养 参照文献[23]方法分离培养雪旺细胞：新生 1～3 d SD 大鼠 6 只，雌雄不限，由南通大学实验动物中心提供。无菌条件下取出大鼠两侧坐骨神经，剥膜后置于 1 mg/mL 胶原酶和 0.125% 胰蛋白酶消化 30 min，以 1×106个/mL 密度接种于多聚赖氨酸包被的培养皿中；置于 37℃、5%CO2 培养箱中，24 h 后更换为含 10 μmol/L β-阿糖胞苷的 DMEM 培养基，培养 24 h 后更换为含 2 mmol/L Forskolin、10 ng/mL Heregulin 及 10%FBS 的 DMEM 培养基，每 3 天换液 1 次；3～5 d 待细胞生长至融合后，消化收集细胞悬液，加成纤维细胞特异性抗体 Thy 1.1（按照 1∶1 000 比例稀释于含 10%FBS 的 DMEM 培养基）；冰上孵育 2 h，离心半径15 cm，1 000 r/min 离心 5 min，弃上清，加补体（按照 1∶3 比例稀释于 DMEM 培养基）重悬，37℃ 孵育 1 h；DMEM 培养基清洗 2 次，接种于多聚赖氨酸包被的培养皿中。将纯化后的雪旺细胞培养 1～2 d，0.125% 胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液后计数，备用。
1.5.2 甲苯胺蓝染色观察 取各组 Gr-SF 纳米膜用 75% 乙醇处理 30 min，PBS 洗涤 2 次，转移至 24 孔板中；每孔按 5×104 个/mL 密度接种 1 mL 雪旺细胞悬液。培养 3 d，PBS 洗涤细胞 2 次，4% 多聚甲醛固定，甲苯胺蓝染色观察雪旺细胞形态及分布。
1.5.3 CCK-8 法检测细胞活力 取各组 Gr-SF 纳米膜置于 24 孔板中，每孔按 1×104个/mL 密度接种 1 mL 雪旺细胞悬液。培养 3 d 后弃培养基，PBS 洗涤 1 次，加入 500 μL CCK-8 试剂（按 1∶10 比例与 PBS 配置），37℃ 孵育 4 h，取 150 μL 上清加入 96 孔板中，用酶标仪在 450 nm 处测定各孔 A 值，设无细胞孔为调零孔。以各孔与调零孔 A 值差值作为最终 A 值，取均值。
1.5.4 EdU/Hoechst33342 染色观测细胞增殖情况 取各组 Gr-SF 纳米膜置于 24 孔板中，每孔按 1×104 个/mL 密度接种 1 mL 雪旺细胞悬液。培养 3 d 后弃去培养基，50 mmol/L EdU 标记试剂（按 1∶1 000 比例与培养基配置）孵育 12 h。之后细胞用 4% 多聚甲醛处理 30 min，甘氨酸孵育 5 min，PBS 洗涤，抗-EdU 工作液室温处理 30 min，含 0.5%Triton X-100 的 PBS 溶液洗涤，5 mg/mL Hoechst33342 染液室温孵育 30 min。激光扫描共聚焦显微镜下观察，各组取 3 孔，随机取 10 个区域计算 EdU 阳性细胞染色百分比。
1.6 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 Gr-SF 静电纺丝溶液静态接触角测定
0、5%、10%、15%、20% Gr-SF 静电纺丝溶液的静态接触角分别为（64.78±4.06）、（78.84±2.70）、（82.90±0.57）、（98.7±1.41）、（117.51±7.49）°，其中 15%、20%Gr-SF 静电纺丝溶液的静态接触角显著大于纯 SF（0）静电纺丝溶液，差异有统计学意义（P<0.05）。其余 Gr-SF 静电纺丝溶液间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.2 Gr-SF 纳米膜相关检测
2.2.1 表面性状观察 光镜观察示：A 组纤维具有圆形横截面和光滑表面，由大量随机取向的纤维组成；B 组可见纳米膜颜色加深，纤维结构中均匀分布少量 Gr 颗粒；C 组纳米膜颜色进一步加深，纤维中镶嵌大量 Gr 颗粒；D 组 Gr 颗粒呈小团块状聚集；E 组团块状聚集更明显。见图 1。
图1
Gr-SF 纳米膜光镜观察（×100）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure1. Light microscope observation of Gr-SF nanofilms (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
扫描电镜观察示：A 组纳米膜表面呈纳米纤维结构，纤维连续、均一；B 组纤维连续，表面规则，并可见少量 Gr 颗粒均匀镶嵌其中；C 组纤维交错规则，Gr 颗粒镶嵌其中；D 组纳米膜中可见大量 Gr 颗粒镶嵌其中，部分 Gr 颗粒成簇分布；E 组纳米膜中大量 Gr 颗粒聚集成簇。见图 2。
图2
Gr-SF 纳米膜扫描电镜观察
a. A 组（×5 000）；b. B 组（×2 000）；c. C 组（×500）；d. D 组（×2 000）；e. E 组（×5 000）
Figure2. Scanning electron microscope observation of Gr-SF nanofilmsa. Group A（×5 000）; b. Group B（×2 000）; c. Group C（×500）; d. Group D（×2 000）; e. Group E（×5 000）
2.2.2 电导率检测 A、B、C、D、E 组 Gr-SF 纳米膜的电导率分别为（1.02±0.14）、（2.25±0.09）、（2.82±0.35）、（3.23±0.19）、（3.65±0.12）×10–4/Ω，B、C、D、E 组电导率显著高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C、D、E 组电导率逐渐上升，但差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.2.3 孔隙率检测 A、B、C、D、E 组 Gr-SF 纳米膜的孔隙率分别为 70.24%±2.17%、72.46%±1.39%、75.89%±1.44%、82.33%±2.06、85.76%±1.92%，各纳米膜孔隙率均>65%。B、C、D、E 组孔隙率显著高于 A 组，除 B 组外，其余各组与 A 组比较差异有统计学意义（P<0.05）；C、D、E 组间比较差异无统计学差异（P>0.05）。
2.2.4 体外细胞毒性检测 培养 1、4、7 d，各组 A 值均呈逐渐增加趋势。1、4 d 时各组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）；7 d 时 D、E 组 A 值低于其余各组，但各组间 A 值比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 3。
图3
MTT法检测各组细胞生长曲线
Figure3.
Cell growth curve of different groups by MTT assay
2.3 Gr-SF 纳米膜对雪旺细胞形态及增殖的影响
2.3.1 甲苯胺蓝染色观察 培养 3 d，A、B、C 组雪旺细胞呈长梭形，胞体形状正常、表面透亮光洁，贴附于纳米纤维生长态势良好，且能穿过纤维之间的孔隙增殖生长；D、E 组细胞成团生长，细胞胞体逐渐减小，折光性降低，细胞数量少于 A、B、C 组。见图 4。
图4
培养 3 d 各组甲苯胺蓝染色观察（×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure4. Toluidine blue staining observation of each group at 3 days after culture (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.3.2 CCK-8 法检测细胞活力 培养 3 d，A、B、C、D、E 组 A 值分别为 1.12±0.17、1.24±0.39、1.33±0.15、1.09±0.06、0.86±0.12，E 组与 A、B、C 组比较差异有统计学意义（P<0.05）。其余各组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.3.3 EdU/Hoechst33342 染色检测细胞增殖 培养 3 d，EdU/Hoechst33342 染色示，A、B、C 组细胞致密且 EdU 阳性细胞逐渐增多；D、E 组细胞减少，且 EdU 阳性细胞亦减少。见图 5。定量检测示，A、B、C、D、E 组 EdU 阳性细胞染色百分比分别为 25.52%±1.23%、25.38%±1.81%、29.50%±1.87%、17.65%±2.35%、14.28%±1.09%。A、B、C 组 EdU 阳性细胞染色百分比逐渐增大，D、E 组低于其余各组，其中 E 组与 A、B、C 组比较，D 组与 C 组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。其余组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
图5
培养 3 d 各组 EdU/Hoechst33342 染色观察（激光扫描共聚焦显微镜×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure5. EdU/Hoechst33342 staining observation of each group at 3 days after culture (Confocal laser scanning microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
3 讨论
神经再生研究的关键是寻找理想的组织工程神经支架材料，伴随着生物材料研究的快速发展，新型导电材料已逐渐应用到组织工程研究领域。Gr 具有优异的电化学性能、力学性能，但存在生物相容性差、不可降解、缺少活性基团等缺点[24-25]。通过引入生物相容性优良及降解可控的分子等方式对 Gr 进行修饰可以弥补上述不足。SF 是一种源于蚕丝的天然高分子纤维蛋白质，有良好的生物相容性和力学性能，已被广泛应用于生物医学领域[26]。理想的组织工程支架材料需兼顾材料与结构两方面[27]。Gr-SF 纳米膜能否作为周围神经再生支架材料，促进神经再生，需要进一步研究其对周围神经细胞相容性的影响。
材料表面亲疏水性可通过接触角进行评价。一般情况下，亲水性表面更利于细胞黏附，亲水性越强、接触角越小，反之接触角越大。本实验通过静电纺丝技术制备 Gr-SF 纳米膜，由于 Gr 的疏水性[28]，其加入后会降低 Gr-SF 纳米膜表面的亲水性。当 Gr 质量分数达 15%、20% 时其静态接触角>90°，亲水性下降。因此，为了保证 Gr-SF 纳米膜的细胞亲和性，建议 Gr 质量分数不超过 10%。
对于神经组织再生，高密度细胞接种需要高孔隙度基质，也需要足够的氧气和营养供给细胞[29]。相比低孔隙率支架材料，高孔隙率支架材料可为细胞和组织提供更多的空间和营养。我们采用静电纺丝技术构建的 Gr-SF 纳米膜具有大量无规则纵横纤维，类似细胞外基质中的大分子胶原纤维和弹性蛋白，有良好贯通的孔隙，具有较高的孔隙率（均达 65% 以上），使该支架比表面积高，符合组织工程支架对高孔隙率的要求。但是支架孔隙率过高也会削弱机械强度[30]，因此构建支架时也需要权衡孔隙率和机械强度。
根据 ISO-10993 标准，小鼠成纤维细胞 L929 细胞是一种常用的细胞毒性评价细胞系。本研究也采用 L929 细胞评价 Gr-SF 纳米膜细胞毒性。体外培养 1、4、7 d 结果显示，各时间点各纳米膜组和对照组间差异无统计学意义，但培养 7 d 时，D、E 组 A 值较其他组有所下降，说明其细胞毒性有所增加。研究表明 Gr 的浓度和分散效果差异对细胞活性有影响[31]，团聚的 Gr 可能使细胞不能进行代谢活动，进而导致其活性受损，而分散较好的 Gr 则对细胞活性无影响。因此，为了保证细胞活性，Gr 质量分数不宜超过 10%。
神经损伤发生时，雪旺细胞发生一系列形态及行为改变，同时发生增殖和表型变化，为轴突再生提供了理想的微环境。因而 Gr-SF 纳米膜能否作为支架材料运用到外周神经修复的实验中，需观察其对雪旺细胞生长、增殖的影响。本研究发现共培养后，0、5%、10%Gr-SF 纳米膜中的雪旺细胞不仅形态未发生改变，细胞生长活力和增殖能力也未受影响。
综上述，Gr 质量分数为 10% 的 Gr-SF 纳米膜具有较好的亲水性，有较高的孔隙率和电活性，Gr 颗粒可均匀分散在纳米膜中；同时也具有良好生物相容性，可促进雪旺细胞存活和增殖。下一步我们将优化 Gr-SF 纳米膜的设计并应用于周围神经再生研究。
周围神经损伤是临床常见问题，在创伤患者中发病率约 2.8%[1-2]。周围神经一定程度上能够再生[3]，但较长周围神经缺损的修复仍存在许多障碍[4-5]。组织工程神经有望解决这一难题，目前已进行了大量研究[6-7]。但组织工程神经通常不具备活性，修复较长神经缺损的效果仍远不及自体神经。因此，制备理想的支架材料是一个具有挑战性的任务。考虑到神经组织本身的结构和电生理特性，合适的支架材料不仅需具有独特表面形貌，以改善神经细胞和支架之间的相互作用、调控细胞生长，同时也需要与在体神经形成良好的电生理整合[8-9]。
伴随着生物材料研究的快速发展，新型导电纳米材料已应用于组织工程神经研究领域，其中碳基材料，如石墨、富勒烯、纳米管和纳米带等，因具有良好的机械性能和导电性，受到了研究人员的关注[10]。石墨烯（graphene，Gr）是碳基材料的重要成员，是具有蜂窝晶格结构的 sp2杂化碳原子的二维单层片材，其特殊的分子构型使其具有优越的物化性质，如高电导率和热导率、高机械强度以及强光电性[11-12]；但因存在高疏水性、难以均匀分散、化学稳定难以与化学试剂反应以及缺乏生物相容性等缺点，应用大大受限[13]。为克服这些缺点，有研究将天然生物大分子结合至 Gr 表面[14]。丝素蛋白（silk fibroin，SF）具有优越的理化性能，越来越多应用于组织工程支架的制备[15-16]。静电纺丝技术环节少、设备简单、操作方便，是制备纳米/微米纤维膜的简便方法，采用静电纺丝制备的纳米纤维支架材料已广泛应用于骨、血管、神经、软骨、皮肤等组织工程研究领域[17-19]。
本研究利用静电纺丝技术制备 Gr-SF 纳米膜并检测其理化性能，探讨不同浓度 Gr 对 Gr-SF 纳米膜理化性能的影响；同时通过 L929 细胞毒性和雪旺细胞共培养实验，探讨细胞相容性好、促进神经细胞生长的 Gr 最佳浓度，为神经组织工程研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
DMEM 培养基、FBS、青链霉素、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美国）；多聚赖氨酸（Sigma 公司，美国）；天然蚕丝（南通海安鑫缘蚕丝有限公司）；Gr 纳米片层粉末[型号 G0441；梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]；EdU 剂盒（广州锐博生物科技有限公司）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；Dojindo 公司，日本）。DSA20 测角器（Gmbh Hambur 公司，德国）；激光扫描共聚焦显微镜（Leica 公司，德国）；酶标仪（Bio-Tek 公司，美国）。
1.2 Gr-SF 静电纺丝溶液的配制及检测
1.2.1 不同质量分数Gr-SF静电纺丝溶液的配制 取天然蚕丝，经 0.5% Na2CO3 水溶液 100℃ 煮沸 30 min，重复 3 次，获得 SF 纤维。根据 Yang 等[20]方法制备 SF 溶液：将 SF 纤维溶于 CaCl2/H2O/EtOH（1∶8∶2）三元体系中，80℃、1 h；随后于透析袋（截留分子量 12 000～14 000）中室温透析 3 d。然后将 SF 溶液置于不锈钢皿中风干成膜，再溶解至 98% 甲酸中获得 SF 质量分数为 13% 的静电纺丝溶液。将 Gr 纳米片层粉末溶于 13% 静电纺丝溶液中，分别制备 Gr 质量分数为 0、5%、10%、15%、20% 的 Gr-SF 静电纺丝溶液，磁力搅拌器室温搅拌，然后用超声波发生器进行超声处理 60 min，720 W 进行声波降解，频率 20 kHz。
1.2.2 静态接触角测定 用 DSA20 测角器，采用滴液法[21]测量不同质量分数（0、5%、10%、15%、20%）Gr-SF 静电纺丝溶液的静态接触角，测量前 1 h 制备溶液。各 Gr-SF 静电纺丝溶液设 3 个平行样，每个样品测量 3 次，取均值。
1.3 Gr-SF 纳米膜制备及化学处理
自制静电纺丝接收装置，由一高电压供应装置组成，包括用 1 个毛细管针（内径 0.9 mm，针尖内装有静电纺丝溶液的液滴）制成的阳极发生器和 1 个绝缘收集板制成的阴极收集器；发生器针尖和收集器间距离为 7～13 cm，通过注射泵维持恒定体积流速为 0.3 mL/h，使静电纺丝溶液维持于针管内。使用针尖对阳极发生器施加 20 kV 高压，最终在绝缘不锈钢负载的载玻片上形成静电纺丝膜。取静电纺丝膜置于无水乙醇中 10 min 以诱导构象转变，随后用蒸馏水 37℃ 洗涤 72 h，去除残余甲酸。采用上述方法制备 0、5%、10%、15%、20%Gr-SF 纳米膜（分别设为 A、B、C、D、E 组）。
1.4 Gr-SF 纳米膜观测指标
1.4.1 Gr-SF纳米膜表面性状观察 大体观察各组 Gr-SF 纳米膜颜色，光镜及扫描电镜下观察 Gr-SF 纳米膜表面、纤维排列以及 Gr 颗粒分散情况。
1.4.2 电导率检测 采用电化学工作站循环伏安法，于室温下检测各组 Gr-SF 纳米膜电导率。实验采用典型的三电极系统[包括铂网电极、Ag/AgCl 电极（饱和 KCl）参考电极和玻碳工作电极]，在含 5.0 mmol/L Fe（CN）64–/3–的 0.1 mol/L KCl 中测量膜表面电化学性能（100～600 mV），扫描速率 100 mV/s，探针间距 10 mm。各组取 3 个样品，每个样品测 3 次，取均值。
1.4.3 孔隙率检测 采用溶液置换法[22]检测各组 Gr-SF 纳米膜孔隙率。以正己烷溶液作为置换液，将 Gr-SF 纳米膜浸于已知体积（V1）的正己烷溶液中 5 min，记录总体积（V2）；将膜取出，记录剩余体积（V3）。按以下公式计算 Gr-SF 纳米膜孔隙率：（V1–V3）/（V2–V3）×100%。
1.4.4 体外细胞毒性检测 ① Gr-SF 纳米膜浸提液的制备：将灭菌后的各组 Gr-SF 纳米膜分别置于离心管中，按 GB/T16886-ISO10993 标准以表面积 6 cm2Gr-SF 纳米膜加 1 mL 培养基的比例加入含 10%FBS 的 DMEM 培养基，（37.0±0.5）℃ 浸泡（72.0±0.5）h，制备的浸提液必须在 12 h 内使用。② 体外细胞毒性检测：根据 ISO-10993 标准采用 MTT 法检测 Gr-SF 纳米膜体外细胞毒性。取 L929 细胞（中国科学院上海生命科学研究院），然后按照 5 000 个/孔密度接种于 96 孔板中，分别与 100 μL 各组 Gr-SF 纳米膜浸提液于 37℃ 下孵育 1、4、7 d，每组设 6 个复孔，完全培养基为对照组，无细胞孔为调零孔，实验重复 3 次。孵育后各时间点去除培养基，PBS 洗涤细胞 3 次；每孔加入 5 mg/mL MTT 溶液 20 μL，继续培养 4 h；弃上清液，每孔加入 100 μL DMSO；用 EIX-800 Microelisa 读数器，在 570 nm 波长下测量吸光度（A）值，以每孔与调零孔 A 值的差值作为最终 A 值，取均值。
1.5 Gr-SF 纳米膜对雪旺细胞形态及增殖的影响
1.5.1 雪旺细胞分离培养 参照文献[23]方法分离培养雪旺细胞：新生 1～3 d SD 大鼠 6 只，雌雄不限，由南通大学实验动物中心提供。无菌条件下取出大鼠两侧坐骨神经，剥膜后置于 1 mg/mL 胶原酶和 0.125% 胰蛋白酶消化 30 min，以 1×106个/mL 密度接种于多聚赖氨酸包被的培养皿中；置于 37℃、5%CO2 培养箱中，24 h 后更换为含 10 μmol/L β-阿糖胞苷的 DMEM 培养基，培养 24 h 后更换为含 2 mmol/L Forskolin、10 ng/mL Heregulin 及 10%FBS 的 DMEM 培养基，每 3 天换液 1 次；3～5 d 待细胞生长至融合后，消化收集细胞悬液，加成纤维细胞特异性抗体 Thy 1.1（按照 1∶1 000 比例稀释于含 10%FBS 的 DMEM 培养基）；冰上孵育 2 h，离心半径15 cm，1 000 r/min 离心 5 min，弃上清，加补体（按照 1∶3 比例稀释于 DMEM 培养基）重悬，37℃ 孵育 1 h；DMEM 培养基清洗 2 次，接种于多聚赖氨酸包被的培养皿中。将纯化后的雪旺细胞培养 1～2 d，0.125% 胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液后计数，备用。
1.5.2 甲苯胺蓝染色观察 取各组 Gr-SF 纳米膜用 75% 乙醇处理 30 min，PBS 洗涤 2 次，转移至 24 孔板中；每孔按 5×104 个/mL 密度接种 1 mL 雪旺细胞悬液。培养 3 d，PBS 洗涤细胞 2 次，4% 多聚甲醛固定，甲苯胺蓝染色观察雪旺细胞形态及分布。
1.5.3 CCK-8 法检测细胞活力 取各组 Gr-SF 纳米膜置于 24 孔板中，每孔按 1×104个/mL 密度接种 1 mL 雪旺细胞悬液。培养 3 d 后弃培养基，PBS 洗涤 1 次，加入 500 μL CCK-8 试剂（按 1∶10 比例与 PBS 配置），37℃ 孵育 4 h，取 150 μL 上清加入 96 孔板中，用酶标仪在 450 nm 处测定各孔 A 值，设无细胞孔为调零孔。以各孔与调零孔 A 值差值作为最终 A 值，取均值。
1.5.4 EdU/Hoechst33342 染色观测细胞增殖情况 取各组 Gr-SF 纳米膜置于 24 孔板中，每孔按 1×104 个/mL 密度接种 1 mL 雪旺细胞悬液。培养 3 d 后弃去培养基，50 mmol/L EdU 标记试剂（按 1∶1 000 比例与培养基配置）孵育 12 h。之后细胞用 4% 多聚甲醛处理 30 min，甘氨酸孵育 5 min，PBS 洗涤，抗-EdU 工作液室温处理 30 min，含 0.5%Triton X-100 的 PBS 溶液洗涤，5 mg/mL Hoechst33342 染液室温孵育 30 min。激光扫描共聚焦显微镜下观察，各组取 3 孔，随机取 10 个区域计算 EdU 阳性细胞染色百分比。
1.6 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 Gr-SF 静电纺丝溶液静态接触角测定
0、5%、10%、15%、20% Gr-SF 静电纺丝溶液的静态接触角分别为（64.78±4.06）、（78.84±2.70）、（82.90±0.57）、（98.7±1.41）、（117.51±7.49）°，其中 15%、20%Gr-SF 静电纺丝溶液的静态接触角显著大于纯 SF（0）静电纺丝溶液，差异有统计学意义（P<0.05）。其余 Gr-SF 静电纺丝溶液间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.2 Gr-SF 纳米膜相关检测
2.2.1 表面性状观察 光镜观察示：A 组纤维具有圆形横截面和光滑表面，由大量随机取向的纤维组成；B 组可见纳米膜颜色加深，纤维结构中均匀分布少量 Gr 颗粒；C 组纳米膜颜色进一步加深，纤维中镶嵌大量 Gr 颗粒；D 组 Gr 颗粒呈小团块状聚集；E 组团块状聚集更明显。见图 1。
图1
Gr-SF 纳米膜光镜观察（×100）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure1. Light microscope observation of Gr-SF nanofilms (×100)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
扫描电镜观察示：A 组纳米膜表面呈纳米纤维结构，纤维连续、均一；B 组纤维连续，表面规则，并可见少量 Gr 颗粒均匀镶嵌其中；C 组纤维交错规则，Gr 颗粒镶嵌其中；D 组纳米膜中可见大量 Gr 颗粒镶嵌其中，部分 Gr 颗粒成簇分布；E 组纳米膜中大量 Gr 颗粒聚集成簇。见图 2。
图2
Gr-SF 纳米膜扫描电镜观察
a. A 组（×5 000）；b. B 组（×2 000）；c. C 组（×500）；d. D 组（×2 000）；e. E 组（×5 000）
Figure2. Scanning electron microscope observation of Gr-SF nanofilmsa. Group A（×5 000）; b. Group B（×2 000）; c. Group C（×500）; d. Group D（×2 000）; e. Group E（×5 000）
2.2.2 电导率检测 A、B、C、D、E 组 Gr-SF 纳米膜的电导率分别为（1.02±0.14）、（2.25±0.09）、（2.82±0.35）、（3.23±0.19）、（3.65±0.12）×10–4/Ω，B、C、D、E 组电导率显著高于 A 组，差异有统计学意义（P<0.05）；B、C、D、E 组电导率逐渐上升，但差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.2.3 孔隙率检测 A、B、C、D、E 组 Gr-SF 纳米膜的孔隙率分别为 70.24%±2.17%、72.46%±1.39%、75.89%±1.44%、82.33%±2.06、85.76%±1.92%，各纳米膜孔隙率均>65%。B、C、D、E 组孔隙率显著高于 A 组，除 B 组外，其余各组与 A 组比较差异有统计学意义（P<0.05）；C、D、E 组间比较差异无统计学差异（P>0.05）。
2.2.4 体外细胞毒性检测 培养 1、4、7 d，各组 A 值均呈逐渐增加趋势。1、4 d 时各组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）；7 d 时 D、E 组 A 值低于其余各组，但各组间 A 值比较差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 3。
图3
MTT法检测各组细胞生长曲线
Figure3.
Cell growth curve of different groups by MTT assay
2.3 Gr-SF 纳米膜对雪旺细胞形态及增殖的影响
2.3.1 甲苯胺蓝染色观察 培养 3 d，A、B、C 组雪旺细胞呈长梭形，胞体形状正常、表面透亮光洁，贴附于纳米纤维生长态势良好，且能穿过纤维之间的孔隙增殖生长；D、E 组细胞成团生长，细胞胞体逐渐减小，折光性降低，细胞数量少于 A、B、C 组。见图 4。
图4
培养 3 d 各组甲苯胺蓝染色观察（×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure4. Toluidine blue staining observation of each group at 3 days after culture (×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.3.2 CCK-8 法检测细胞活力 培养 3 d，A、B、C、D、E 组 A 值分别为 1.12±0.17、1.24±0.39、1.33±0.15、1.09±0.06、0.86±0.12，E 组与 A、B、C 组比较差异有统计学意义（P<0.05）。其余各组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.3.3 EdU/Hoechst33342 染色检测细胞增殖 培养 3 d，EdU/Hoechst33342 染色示，A、B、C 组细胞致密且 EdU 阳性细胞逐渐增多；D、E 组细胞减少，且 EdU 阳性细胞亦减少。见图 5。定量检测示，A、B、C、D、E 组 EdU 阳性细胞染色百分比分别为 25.52%±1.23%、25.38%±1.81%、29.50%±1.87%、17.65%±2.35%、14.28%±1.09%。A、B、C 组 EdU 阳性细胞染色百分比逐渐增大，D、E 组低于其余各组，其中 E 组与 A、B、C 组比较，D 组与 C 组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。其余组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
图5
培养 3 d 各组 EdU/Hoechst33342 染色观察（激光扫描共聚焦显微镜×200）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure5. EdU/Hoechst33342 staining observation of each group at 3 days after culture (Confocal laser scanning microscope×200)a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
3 讨论
神经再生研究的关键是寻找理想的组织工程神经支架材料，伴随着生物材料研究的快速发展，新型导电材料已逐渐应用到组织工程研究领域。Gr 具有优异的电化学性能、力学性能，但存在生物相容性差、不可降解、缺少活性基团等缺点[24-25]。通过引入生物相容性优良及降解可控的分子等方式对 Gr 进行修饰可以弥补上述不足。SF 是一种源于蚕丝的天然高分子纤维蛋白质，有良好的生物相容性和力学性能，已被广泛应用于生物医学领域[26]。理想的组织工程支架材料需兼顾材料与结构两方面[27]。Gr-SF 纳米膜能否作为周围神经再生支架材料，促进神经再生，需要进一步研究其对周围神经细胞相容性的影响。
材料表面亲疏水性可通过接触角进行评价。一般情况下，亲水性表面更利于细胞黏附，亲水性越强、接触角越小，反之接触角越大。本实验通过静电纺丝技术制备 Gr-SF 纳米膜，由于 Gr 的疏水性[28]，其加入后会降低 Gr-SF 纳米膜表面的亲水性。当 Gr 质量分数达 15%、20% 时其静态接触角>90°，亲水性下降。因此，为了保证 Gr-SF 纳米膜的细胞亲和性，建议 Gr 质量分数不超过 10%。
对于神经组织再生，高密度细胞接种需要高孔隙度基质，也需要足够的氧气和营养供给细胞[29]。相比低孔隙率支架材料，高孔隙率支架材料可为细胞和组织提供更多的空间和营养。我们采用静电纺丝技术构建的 Gr-SF 纳米膜具有大量无规则纵横纤维，类似细胞外基质中的大分子胶原纤维和弹性蛋白，有良好贯通的孔隙，具有较高的孔隙率（均达 65% 以上），使该支架比表面积高，符合组织工程支架对高孔隙率的要求。但是支架孔隙率过高也会削弱机械强度[30]，因此构建支架时也需要权衡孔隙率和机械强度。
根据 ISO-10993 标准，小鼠成纤维细胞 L929 细胞是一种常用的细胞毒性评价细胞系。本研究也采用 L929 细胞评价 Gr-SF 纳米膜细胞毒性。体外培养 1、4、7 d 结果显示，各时间点各纳米膜组和对照组间差异无统计学意义，但培养 7 d 时，D、E 组 A 值较其他组有所下降，说明其细胞毒性有所增加。研究表明 Gr 的浓度和分散效果差异对细胞活性有影响[31]，团聚的 Gr 可能使细胞不能进行代谢活动，进而导致其活性受损，而分散较好的 Gr 则对细胞活性无影响。因此，为了保证细胞活性，Gr 质量分数不宜超过 10%。
神经损伤发生时，雪旺细胞发生一系列形态及行为改变，同时发生增殖和表型变化，为轴突再生提供了理想的微环境。因而 Gr-SF 纳米膜能否作为支架材料运用到外周神经修复的实验中，需观察其对雪旺细胞生长、增殖的影响。本研究发现共培养后，0、5%、10%Gr-SF 纳米膜中的雪旺细胞不仅形态未发生改变，细胞生长活力和增殖能力也未受影响。
综上述，Gr 质量分数为 10% 的 Gr-SF 纳米膜具有较好的亲水性，有较高的孔隙率和电活性，Gr 颗粒可均匀分散在纳米膜中；同时也具有良好生物相容性，可促进雪旺细胞存活和增殖。下一步我们将优化 Gr-SF 纳米膜的设计并应用于周围神经再生研究。
