국내 유래 집먼지진드기 알레르겐을 이용한 알레르겐 만성노출 실험동물모델 구축

이, 성희; 장, 우성; 정, 규태; 이, 점규

doi:10.4168/aard.2022.10.1.22

Allergy Asthma Respir Dis. 2022 Jan;10(1):22-32. Korean.
Published online Jan 27, 2022.
https://doi.org/10.4168/aard.2022.10.1.22

Original Article

국내 유래 집먼지진드기 알레르겐을 이용한 알레르겐 만성노출 실험동물모델 구축

이성희,^* 장우성,^* 정규태 이점규

Establishment of a murine model based on chronic exposure to domestic house dust mites in Korea

Sung-Hee Lee,^* Woo-Sung Chang,^* Kyu-Tae Jeong and Jeom Kyu Lee

Author information

Author notes

Copyright and License

- 질병관리청 국립보건연구원 만성질환융복합연구부 호흡기·알레르기질환연구과
- Division of Allergy and Respiratory Disease Research, Department of Chronic Disease Convergence Research, Korea National Institute of Health, Korea Disease Control and Prevention Agency, Cheongju, Korea.
Correspondence to: Jeom Kyu Lee. Division of Allergy and Respiratory Disease Research, Department of Chronic Disease Convergence Research, Korea National Institute of Health, Korea Disease Control and Prevention Agency, 187 Osongsaengmyeong 2-ro, Osong-eup, Heungdeok-gu, Cheongju 28159, Korea. Tel: +82-43-719-8453, Fax: +82-43-719-8909, Email: nihdot@korea.kr

^*These authors contributed equally to this study as co-first authors.

Received April 19, 2021; Revised June 16, 2021; Accepted June 16, 2021.

This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/).

Abstract

Purpose

Asthma is a chronic disorder characterized by bronchial hyperresponsiveness and reversible airflow obstruction. Repeated exposure to allergens of the respiratory tract causes chronic inflammation, followed by structural changes in the lung called airway remodeling. House dust mites (HDM) are known as the predominant inhalant allergens, and several studies have reported that the allergenic property of HDM extracts varied with the geographic regions where they were produced. This study aimed to establish a murine experimental model by long-term intranasal exposure to HDM allergen indigenous to Korea.

Methods

HDM extracts from cultured Dermatophagoides pteronissunus in Korea were used in our model. We administered the extracts intranasally to BALB/c mice 3 times a week for 8 or 10 consecutive weeks, followed by measuring airway allergic inflammation and airway remodeling.

Results

The number of neutrophils in the lungs was higher in the group with long-term exposure to HDM than in the normal control group. The levels of total IgE and a wide range of cytokines, including Th1/Th2/Th17 and proinflammatory cytokines, were significantly higher in the long-term HDM-exposed group than in the normal control group. The development of airway remodeling by chronic exposure to HDM was observed by measuring diverse factors, including collagens and transforming growth factor (TGF)-β. These significant results were more clearly shown in the group exposed to HDM for 8 weeks than 10 weeks.

Conclusion

A murine model of chronic exposure to domestic HDM in Korea was successfully established. We suggest that our model may be helpful in the research into asthma with airway remodeling.

Keywords

Chronic exposure; House dust mites; Murine model; Airway remodeling

서론

천식은 전세계적으로 모든 연령에서 3억 명 이상이 앓고 있는 주요 만성질환 중 하나이며,1 국내에서도 천식 및 중증천식의 유병률 및 사망률이 꾸준히 증가하고 있을 뿐만 아니라 질병부담 또한 가중되고 있다.2 천식의 발병과 악화에는 유전적 소인에 따른 영향과 함께 알레르겐, 미생물, 대기오염물질 등과 같은 다양한 위험 요소가 영향을 미치며3 이러한 다양한 요소들이 복합적으로 작용하여 기도 수축 및 폐색, 천명 및 호흡곤란 등의 증상이 반복적으로 발생하게 된다. 천식의 기본적인 병리학적 기전으로서 알레르겐의 반복적 노출 및 유입에 따른 제2형 T 도움세포(type 2 T helper cell, Th2) 면역반응 유발로 인하여 IgE 증가, Th2 및 염증 사이토카인 분비, 호산구의 기도유입 등이 발생한다는 것이 잘 알려져 있으며, 만성화될수록 제1형(Th1) 및 제17형 T 도움세포(Th17) 유래 염증반응 또한 중요한 역할을 한다.4, 5, 6 만성 염증반응이 지속될 때 호흡기에 발생하는 또 다른 증상으로 기도개형(airway remodeling)이 있는데, 폐상피세포 손상, 점액분비선 과다형성(mucus gland hyperplasia), 콜라겐(collagen) 및 프로테오글리칸(proteoglycans)의 침착, 기도 평활근세포 증가 등이 발생되어 결과적으로 호흡기 과민반응 및 기도 폐색 등 천식 증상으로 이어진다.7, 8

이러한 천식의 발병기전 규명 및 연관 바이오마커 발굴 등을 위해 다양한 실험동물 모델이 보고되어 왔으며, 그 중 실제 알레르기성 천식 발병 상황과 유사한 조건을 구현하기 위한 연구모델로서 알레르겐을 반복적으로 국소 노출시켜 호흡기 내에 만성적인 알레르기성 염증반응을 유발시키는 방법이 활용되고 있다.9, 10, 11 그러나 국가별, 지역별로 알레르겐 감작 정도 및 항원성이 다르게 나타나고 동일한 알레르겐이라 하더라도 생산환경 등에 따라 주성분(major allergen content)이 다르기 때문에12, 13, 14 알레르기질환 연구에 있어서 적절한 알레르겐을 선정하는 것이 중요하다. 뿐만 아니라 알레르겐 노출 기간에 따라 알레르기질환이 오히려 억제되는 연구 결과도 있으므로,15 적절한 알레르겐 노출 기간을 결정하는 것도 중요한 고려 대상이다. 또한 우리나라의 경우 국내에서 사용되는 알레르기질환 진단 및 면역치료 관련 알레르겐을 모두 해외에서 수입하고 있어 국내 유래 알레르겐의 활용도를 높이기 위한 알레르기질환 연구가 필요한 상황이다.

이 연구에서는 국내 유래 집먼지진드기로부터 추출된 알레르겐을 실험동물에 8주 혹은 10주 동안 만성적으로 국소 노출시키고 그에 따른 만성알레르기반응 및 기도개형 발생 정도를 측정함으로써, 국내 알레르겐에 기반하여 실제 알레르겐 감작 상황과 유사한 만성적 국소노출 방식으로 알레르기 반응을 유발시키는 알레르겐 만성노출 연구모델을 구축하고자 하였다.

대상 및 방법

1. 실험 디자인

청정동물 실험실(specific pathogen-free area)에서 사육한 5주령 암컷 BABL/c 마우스(Koatech, Pyeongtaek, Korea)를 pentobaribital sodium (Hanlim Pharm., Yongin, Korea) 40 mg/kg으로 마취시킨 후 국내 유래 집먼지진드기(Dermatophagoides pteronyssinus)로부터 추출한 알레르겐(Lot No. ABPF-03; Prolagen, Seoul, Korea) 25 µg (in 50 µL phosphate buffered saline [PBS])를 일주일에 3회씩 8주 혹은 10주간 비강 투여하였다(Fig. 1A). 실험에 사용한 알레르겐은 총단백질 함량이 355.59 µg/mg이며 Der p 1 함량이 2.90 µg/mg이었다. 비교군은 난황알부민(ovalbumin, OVA) 25 µg (in 50 µL PBS)을, 음성대조군은 생리식염수(PBS) 50 µL를 집먼지진드기 알레르겐과 동일한 일정 및 방법으로 투여하였다. 각 실험군의 대상 수는 5마리로 하였으며, 최종 비강 투여 24시간 후 폐조직, 기관지폐포세척액(bronchoalveolar lavage fluid, BALF), 혈액을 채취하였으며 비강 투여 기간에 따른 비교를 위해 5주차에도 혈액을 채취하였다. 이 실험은 질병관리본부 동물 윤리위원회의 승인을 받았으며(KCDC-035-17-2A, KCDC-125-17-2A, KCDC-004-19-2A) 관련 규정에 의거하여 진행되었다.

Fig. 1
Murine model for long-term exposure of Dermatophagoides pteronyssinus (Der. p) indigenous to Korea. (A) Experimental design of this study. 25 µg Der. p in 50-µL saline was intranasally (i.n.) administrated 3 times a week for 8 consecutive weeks. (B) Cells obtained from bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were stained with Diff-Quik solution and observed by microscope to determine differential cells. Scale bars indicate 50 µm. (C) The number of total cells, macrophages, eosinophils, neutrophils, and lymphocytes were counted in BALF. Neutrophils were significantly increased in the Der. p-exposed group compared to the control group. (D) The concentration of plasma total IgE was measured by enzyme-linked immunosorbent assay, as described in Materials and Methods. The level of total IgE in the Der. p-exposed group was higher than that in the control group. Data represents the mean±standard error of the mean (n=5 for each group). OVA, ovalbumin; PBS, phosphate buffered saline. ^*P<0.05. ^***P<0.001.

2. 기관지폐포세척액 내 유입 세포 분석

기관지폐포세척액은 기도 삽관 후 1회당 0.3 mL씩 PBS를 3회 주입하여 수거한 후 5,000 rpm, 4℃ 조건으로 원심분리하여 세포 침전물을 수득하였다. Hemocytometer (NucleoCounter, Chemometec, Allerod, Denmark)를 이용하여 세포 침전물 내 총 세포 수를 측정하고, 1×10⁵/100 µL 상태로 1,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 유리 슬라이드에 고정시킨 후 Diff-Quik solution (Sysmax, Hyogo, Japan)을 이용하여 염색하였다. 각 슬라이드별로 총 300개의 세포 중 대식세포, 호산구, 림프구, 호중구의 수를 감별하여 계산하였다.

3. 혈장 내 면역글로불린 및 콜라겐 측정

항응고제가 처리된 모세관(capillary)를 이용하여 안와채혈을 진행한 후 채혈된 혈액을 8,000 rpm에서 8분간 원심분리하여 혈장(plasma)을 분리하였다. 면역글로불린 및 기도개형 연관 인자인 콜라겐의 종류별로 샌드위치 타입 효소결합면역흡착측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 키트를 사용하여 혈장 내 농도를 측정하였다. 측정방법은 각 키트의 제조사에서 제공한 매뉴얼에 따라 진행하였으며, 측정한 면역글로불린 및 콜라겐의 종류는 다음과 같다: Total immunoglobulin (Ig) E (Biolegend, San Diego, CA, USA), total IgG, IgG1, IgG2a (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA), TGF-β (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA), fibronectin, laminin (Abcam, Cambridge, UK), collagenI, collagenIII (Mybiosource, San Diego, CA, USA).

4. 조직염색 분석

좌측 폐엽(lung lobes)을 적출하여 10% formaldehyde에 1일간 고정시킨 후 자동조직처리기(Tissue-Tek VIP5Jr; Sakura Finetek, Tokyo, Japan) 및 ethyl alcohol (Merck, Darmstadt, Germany), xylene (Daejung, Siheung, Korea) 등의 용매를 이용하여 탈회, 수세, 탈수 등의 과정을 거쳐 파라핀으로 포매하였다. 세부적인 방법은 제조사에서 제공하는 매뉴얼에 따라 진행하였다. 포매 후 4 µm 두께로 절편을 만들어 xylene으로 파라핀을 제거하고 ethyl alcohol로 함수시켰다. 면역세포의 침윤 정도 확인 및 조직학적 분석을 위하여 hematoxylin & eosin (H&E Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), periodic acid-Schiff (PAS; Sigma-Aldrich) 염색을 각각의 염색 키트를 활용하여 진행한 후 이미지를 관찰하였다. 각 키트별 염색 방법은 제공된 매뉴얼을 참조하였다. 모든 이미지는 이미지 분석장치(Image analysis system, Olympus, Tokyo, Japan)를 이용하여 판독 후 포착(capture)하였다.

5. 폐조직 균질현탁액 내 사이토카인 및 기도개형 연관 인자 분석

우측 폐엽을 일부 적출한 후 1 mL PBS에 넣어 균질화기기(Vibra-cell ultrasonic liquid processors; Sonics & Materials Inc., Newtown, CT, USA)로 균질화시키고 14,000 rpm, 4℃로 5분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 수득한 폐조직 균질현탁액(lung homogenate) 내 단백질을 BCA assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 통해 정량하여 80 mg proteins/mL로 표본화(sampling)한 후, 상층액 내의 사이토카인 및 기도개형 연관 인자의 농도를 ELISA 기법을 통해 측정하였다. 측정방법은 각 ELISA kit별로 제조사에서 제공하는 매뉴얼을 참조하였으며, 측정한 사이토카인 및 기도개형 연관인자는 다음과 같다: interleukin (IL)-4, IL-5, IL-17, tumor necrosis factor (TNF)-α, IL-1β, TGF-β IL-13, IL-33, thymic stromal lymphopoietin (TSLP), eotaxin 1, interferon (IFN)-γ, IL-6 (R&D System Inc.), fibronectin, laminin (Abcam), collagenI, collagenIII (Mybiosource).

6. 면역형광염색

기도개형의 발생 및 변화를 조사하기 위하여 면역형광염색(Immunofluorescence staining)을 실시하였다. Citrate buffer (Sigma-Aldrich)를 이용하여 10분 동안 폐조직 절편의 antigen retrieval 과정을 거친 후 endogenous peroxidase 제거를 위해 3% hydroxylase (Sigma-Aldrich)를 5분간 처리하였다. Blocking serum인 10% normal goat serum (Thermo Fisher Scientific)을 처리하고 상온에서 30분 반응시킨 후, 1차 항체인 anti-alpha smooth muscle actin (α-SMA; Abcam), anti-collagen I (Abcam), anti-Chloride channel, calcium activated, family member 3 (CLCA3; Abcam) antibody를 넣고 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나고 0.05% Tween-20이 처리된 생리식염수(PBST)로 30분간 씻어준 후 1차 항체의 isotype별로 적합한 2차 항체(Alexa Fluor 633-conjugated goat anti-mouse or Alexa Fluor 488-conjugated goat-anti rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody; Thermo Fisher Scientific)를 30분 동안 반응시키고 DAB substrate buffer (DAKO, Glostrup, Denmark)를 이용하여 발색을 유도하였다. Cover-slip 위에 DAPI가 포함된 봉입제(ProLong, Thermo Fisher Scientific)를 한 방울 떨어뜨린 뒤 조직 부위에 덮은 후 공초점 현미경(FV1000-ASW, Olympus)을 이용하여 관찰하였다.

7. 통계

각 군 간의 평균값 차이는 GraphPad Prism 5 프로그램(GraphPad, San Diego, CA, USA)을 사용하여 산출하였으며 일원분산분석(one-way analysis of variance) 기법을 이용하여 유의성을 검증하였다. P-value가 0.05 미만인 경우에 통계적으로 유의한 것으로 판단하였다.

결과

1. 국내 유래 집먼지진드기 알레르겐의 만성노출에 따른 알레르기 반응 및 염증 유발 확인

국내 유래 집먼지진드기 알레르겐을 주 3회, 8주 동안 비강 투여하는 방법으로 알레르겐 만성노출 연구모델을 진행하고 그에 따른 호흡기 내 염증 및 알레르기반응 발생 여부를 분석하였다. 최종 시점에서 수득한 기관지폐포세척액 내 세포유입 정도를 관찰한 결과, 음성대조군에 비하여 집먼지진드기 알레르겐 만성노출군에서 총 세포 수가 유의하게 증가했을 뿐만 아니라 호중구 수 또한 크게 증가한 것으로 확인되어 집먼지진드기 알레르겐 만성노출로 인해 기도 내 염증(airway inflammation)이 발생하였음을 알 수 있었다(Fig. 1B, C). 알레르기성반응 유발을 확인할 수 있는 혈장 내 IgE의 변화를 ELISA 기법을 통하여 측정한 결과, 음성대조군 및 OVA 만성노출군에 비해 집먼지진드기 알레르겐 만성노출군에서 유의하게 혈장 내 total IgE 농도가 증가 되어 있는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 1D).

2. 알레르겐 만성노출로 인한 면역학적 변화 관찰

알레르겐 만성노출로 인해 발생되는 체내 면역학적 변화 및 만성염증 유발 여부를 살펴보기 위해 폐조직 균질현탁액에서 여러 사이토카인의 변화를 측정한 결과, 음성대조군 대비 알레르겐 만성노출군에서 Th2 (IL-4, IL-13, IL-33), Th1 (IFN-γ), Th17 (IL-17), 염증(TNF-α, IL-1β, IL-6) 관련 사이토카인과 호산구 관련 케모카인(eotaxin 1)이 유의하게 증가되어 있는 것을 관찰하였으며, OVA 만성노출군과 비교했을 때에도 IL-33, eotaxin, IL-1β를 제외한 모든 사이토카인 농도가 유의하게 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 알레르겐의 만성적인 노출로 인한 폐조직 내 변화를 조직학적 염색방법을 통해 분석한 결과에서도 마찬가지로 음성대조군과 비교하여 집먼지진드기 알레르겐 만성노출군에서 기도 주변에 많은 세포가 침윤되어 있는 것이 H&E 염색을 통해 관찰되었으며 술잔세포(goblet cell)의 과다형성 또한 PAS 염색을 통해 확인할 수 있었다(data not shown).

Fig. 2
Cytokine profile in our model with long-term exposure of Dermatophagoides pteronyssinus (Der. p). Lung homogenates were obtained from each experimental group after the last intranasally administration. The levels of diverse cytokines were measured as described in Materials and Methods. The concentrations of all cytokines were significantly higher in the Der. p-exposed group than in the normal control group. Data represents the mean±standard error of the mean (n=5 for each group). OVA, ovalbumin; IL, interleukin; IFN, interferon. ^*P<0.05. ^**P<0.01. ^***P<0.001.

3. 알레르겐 만성노출 기간에 따른 비교 분석

8주간의 알레르겐 만성노출 시 알레르기반응 및 증상, 면역학적 변화가 확인됨에 따라, 알레르겐의 노출 기간을 연장하였을 때에도 유사한 결과가 나타나는지 확인하고자 하였다. 국내 유래 집먼지진드기 알레르겐을 주 3회, 8주 혹은 10주 동안 비강 투여한 후(Fig. 3A) 기관지폐포세척액 내 유입 세포를 분석한 결과, 음성대조군에 비해서는 8주 및 10주 알레르겐 만성노출군에서 모두 총 세포 수 및 호중구 수가 유의하게 증가된 것으로 나타났지만 노출 기간에 따라 유의한 차이를 보이지는 않는 것으로 확인되었다(Fig. 3B). 알레르겐의 노출 기간에 따른 알레르기반응 발생 정도를 비교한 경우에도 마찬가지로, 집먼지진드기 알레르겐 노출 중간시점인 5주에 비해 8주 및 10주차에서 측정한 모든 면역글로불린(totaI IgE, total IgG, IgG1, IgG2a)의 혈장 내 농도가 증가한 것을 확인하였으나 8주와 10주간의 유의한 차이는 관찰되지 않았다(Fig. 3C). 조직학적 염색방법을 통해 기도주변 세포침윤 및 술잔세포의 과다형성 정도를 관찰한 결과 역시 음성대조군 대비 염증 발생은 확인되었으나 8주 및 10주 알레르겐 만성노출군 간의 차이는 나타나지 않았다(Fig. 3D).

Fig. 3
Comparative evaluation between Dermatophagoides pteronyssinus (Der. p) allergen exposure for 8 weeks and 10 weeks. (A) Experimental design for this comparative analysis. 25 µg Der. p was intranasally (i.n.) administrated 3 times a week for 8 or 10 consecutive weeks. (B) The cells obtained from the bronchoalveolar lavage fluid were stained by Diff-Quik solution. The number of total cells, macrophages, eosinophils, neutrophils, and lymphocytes were counted (scale bars: 50 µm). Neutrophils were significantly increased both in the Der. p-exposed groups compared to the control group. (C) The concentrations of plasma total IgE, total IgG, IgG1, and IgG2a were measured by commercial enzyme-linked immunosorbent assay kit, as described in Materials and Methods. The levels of all immunoglobulins were higher both in the Der. p-exposed groups than that in the control group. (D) Assessment of lung histology in each group. Lung tissue sections from each experimental group were stained with hematoxylin & eosin (H&E) or periodic acid-schiff (PAS) (scale bar: 50 µm). Increased cell infiltration and goblet cell hyperplasia in the lung were shown in the Der. p-exposed groups compared to those in the control group. Data represents the mean±standard error of the mean (n=5 for each group). PBS, phosphate buffered saline. ^*P<0.05. ^**P<0.01. ^***P<0.001.

4. 알레르겐 만성노출 기간에 따른 사이토카인 변화 차이

8주 및 10주 알레르겐 만성노출군에서의 폐조직 균질현탁액 내 사이토카인의 변화를 분석한 결과, 음성대조군 대비 두 군 모두에서 Th2 (IL-4, IL-5, IL-13, IL-33, TSLP), Th1 (IFN-γ), Th17 (IL-17), 염증(IL-6, IL-1β, TNF-α) 관련 사이토카인과 호산구 관련 케모카인(eotaxin 1)이 증가된 것이 확인되었다. 두 만성노출군 간의 변화 차이를 비교했을 때 4개의 사이토카인(IL-5, IL-13, IFN-γ, TNF-α)이 8주 만성노출군에 비해 10주 만성노출군에서 유의하게 낮은 것으로 나타났으며, 특히 10주 만성노출군에서 측정한 대부분의 사이토카인 농도가 8주 만성노출군에 비해 전반적으로 낮은 양상이 관찰되었다(Fig. 4).

Fig. 4
Profile of cytokines compared between in the group with Dermatophagoides pteronyssinus (Der. p) exposure for 8 weeks and 10 weeks. A wide range of cytokines was measured in lung homogenates obtained from each group. All cytokines except for interleukin (IL)-1β in the group exposed Der. p for 8 weeks were higher than those in the control group. Although the profile of cytokine levels in the group exposed Der. p for 10 weeks was observed similarly with the 8 weeks group, the level of 4 cytokines (IL-5, IL-13, interferon [IFN]-γ, and tumor necrosis factor [TNF]-α) in the 10 weeks group was significantly lower than that in the 8 weeks group. Data represents the mean±standard error of the mean (n=5 for each group). ^*P<0.05. ^**P<0.01. ^***P<0.001.

5. 알레르겐 만성노출 기간에 따른 기도개형 변화 비교

알레르겐의 노출 기간에 따라 사이토카인 농도의 차이를 확인한 후, 기도개형 발생에 있어서도 두 군 간의 차이가 나타나는지 확인하기 위하여 기도개형 연관 인자들로 알려진 collagen, laminin, TGF-β의 혈장 및 폐조직 균질현탁액 내 농도를 분석하였다. 혈장 내 collagen I 및 laminin의 경우 음성대조군과 비교했을 때 8주 만성노출군에서는 유의한 증가를 확인하였으나 10주 만성노출군에서는 통계적 유의성이 관찰되지 않았다(Fig. 5A). 폐조직 균질현탁액 내 collagen I, collagen III, TGF-β 역시 8주 만성노출군에서는 음성대조군 대비 유의한 증가양상이 확인된 반면 10주 만성노출군에서는 유의한 차이가 확인되지 않았다(Fig. 5B). 기도개형 연관 인자들의 실제 조직 내 분포 정도를 확인하기 위하여 면역형광염색법으로 폐조직 내 기도개형 연관 인자인 α-smooth muscle actin (α-SMA), collagen I, CLCA3을 염색하여 형광현미경을 통해 관찰한 결과, collagen I과 CLCA3의 경우 8주 및 10주 만성노출군에서 모두 음성대조군에 비해 발현이 증가된 양상을 확인하였으나 α-SMA은 8주 만성노출군에서만 발현이 유의미하게 증가된 것으로 관찰되었다(Fig. 5C, D).

Fig. 5
The development of airway remodeling in our study. (A, B) The levels of collagen I/III, laminin, and transforming growth factor (TGF)-β in plasma and lung homogenates were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Their levels were higher in the group exposed Dermatophagoides pteronyssinus (Der. p) for 8 weeks than those in the control group, whereas there is no significant difference between the group exposed Der. p for 10 weeks and the control group. (C) Immunostaining of lung sections from each group was performed with α-smooth muscle actin (α-SMA; green, upper), collagen I (red), and CLCA3 (green, lower) antibodies. The observation of their expressions by confocal microscopy (original magnification, ×400) showed increased α-SMA expression only in the 8 weeks group. (D) The area of α-SMA⁺ staining was measured using confocal microscopy. The graph represents the immunostained area per unit of basement membrane length in the bronchioles. Data represents the mean±standard error of the mean (n=5 for each group). ^*P<0.05. ^**P<0.01. ^***P<0.001.

고찰

이 연구에서는 국내 유래 집먼지진드기 알레르겐을 사용하여 실험동물에 만성적인 국소 노출을 통해 알레르기 증상 및 염증반응 등을 유발시키는 알레르겐 만성노출 연구모델을 구축하고자 하였다. 국내 유래 알레르겐을 8주 동안 반복적으로 비강 투여하여 만성노출을 시켰을 때 기도 내 세포 유입 및 침윤 등 염증 증상뿐만 아니라 total IgE와 다양한 Th2 및 염증 관련 사이토카인 등이 전반적으로 증가하는 것을 확인하여 만성 알레르기반응이 호흡기 내에 유발된 것을 확인하였다. 기도개형 연관 인자 또한 8주 만성노출 시에 유의한 증가가 확인되어 기도개형이 유발되었다는 것을 확인할 수 있었다. 반면에 만성노출 기간을 10주로 연장할 경우 오히려 전반적으로 유발 정도가 감소되는 양상을 보이는 것이 관찰되었고 기도개형 연관 인자도 일부에서만 변화가 확인되었다.

집먼지진드기 알레르겐을 이용한 만성노출 연구모델은 실제 환경에서의 대기 중 알레르겐(aeroallergens)의 일반적인 노출방식과 유사하고 인위적으로 면역반응을 높이기 위한 보조제(adjuvant)를 사용하지 않는 등의 장점이 있어서 천식 연구에 중요한 연구모델로서 활용되고 있다.9, 16 또한 만성적인 알레르겐 노출에 따라 발생되는 기도손상 및 기도개형은 중증 천식 환자에서 나타나는 증상의 하나17로서 이에 대한 연구를 위한 모델로도 활용이 가능하다. 집먼지진드기 알레르겐을 마우스에 주 3회씩 5주 동안 비강 투여한 알레르겐 만성노출 모델에서 호산구성 염증(eosinophilic inflammation) 및 기도개형 발생이 확인된 바 있으며,18 항산화 및 항염증성 물질의 알레르기성 천식에 대한 효과를 확인하기 위해 주 5회씩 7주 동안 알레르겐을 비강 투여하는 동물모델이 활용된 연구도 보고된 바 있다.19 이처럼 다양한 관점에서 수행되었던 기존의 알레르겐 만성노출 연구모델에서는 거의 대부분의 경우 미국(Greer, Lenoir, NC, USA)에서 생산된 집먼지진드기 알레르겐을 사용하였고 각 연구마다 알레르겐 노출 기간 및 방법에 차이가 있었다. 최근 미국 생산 알레르겐과 국내 생산 알레르겐 간의 주성분(Der p 1 및 Der p 2) 분포 및 항원력(allergenic potency)에 차이가 있다는 것이 보고되었으므로,20 이 연구는 국내에서 생산된 집먼지진드기 알레르겐 추출물을 사용하여 만성 알레르기반응 및 기도개형 증상이 유발되는 적절한 노출 기간 및 방법을 제시함으로써 결과적으로 국내 유래 집먼지진드기 알레르겐의 연구 활용성을 높일 수 있는 근거를 제공하였다고 할 수 있다.

알레르기반응 및 증상발현은 기본적으로 Th2 세포를 중심으로 하는 면역학적인 기전을 통해 발생된다는 것이 잘 알려져 있으나 이러한 알레르기반응이 만성적으로 지속되게 되면 Th2 세포뿐만 아니라 Th1, Th17 세포 등 다양한 T세포 및 관련 사이토카인들이 만성적인 염증 및 병리학적인 증상 발현에 관여하게 된다.21 특히 Th17 세포는 호중구 유도를 통해 기도 내 염증 발생 기전에 중요한 역할을 하고 Th2 세포와의 분율(Th17/Th2)이 만성 중증 천식 환자에서 높아지는 경향도 보고되었을 뿐만 아니라22 Th17 세포에서 분비하는 IL-17A, IL-17F, IL-22 등의 사이토카인이 만성 알레르기 노출의 주요 증상인 기도개형을 심화시키는 기능을 가지는 것으로 확인되는 등 천식 및 만성 알레르기 염증에서의 중요성이 제시된 바 있다.23 이 연구의 알레르겐 만성노출 연구모델에서도 Th2 사이토카인인 IL-4, IL-13과 함께 IL-17이 비교군 대비 유의하게 증가된 것이 확인되었으며 Th1 사이토카인인 IFN-γ, 염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-α 또한 유사한 양상을 보였으므로 다양한 면역세포 및 사이토카인이 모두 관여된 만성 알레르기 염증이 잘 유도되었음을 확인할 수 있었다.

만성 알레르기 염증으로 인해 발생되는 주요 특성인 기도개형은 알레르기 염증 유발에 작용하는 IL-4, IL-13과 같은 사이토카인과 호산구가 분비하는 다양한 매개체(mediators)로 인해 망상기저막(reticular basement membrane)의 비후(thickening), 섬유아세포(fibroblast)의 분화 및 콜라겐 분비, 기도 평활근세포 증가 등과 같은 현상이 유발되는 것으로 알려져 있다.17, 24, 25 기도개형을 확인할 수 있는 지표 중 이 연구에서는 체액 상에서 측정이 가능한 laminin과 조직형광염색을 통해 조직 내 분포 양상을 확인할 수 있는 α-SMA 및 CLCA3, 그리고 두 방법 모두 활용 가능한 콜라겐 등을 분석하여 음성대조군 대비 증가된 양상을 확인할 수 있었다. 이때 알레르겐의 만성노출 기간이 길어짐에 따라 오히려 기도개형 연관 지표들이 감소되는 양상이 확인되었는데, 이러한 현상은 다양한 사이토카인 측정 시에도 마찬가지로 관찰되었다. 이와 같은 결과는 11주 동안의 집먼지진드기 알레르겐 만성노출을 진행한 연구모델에서 조절 T세포(regulatory T cell) 및 IL-10 분비 대식세포(macrophage)로 인해 기도 내 알레르기반응이 감소되는 것이 관찰된 연구15나 만성적인 염증에 대한 생리학적 반작용으로서 면역관용(immune tolerance)이 유발된다는 연구문헌26 등을 통해 알레르겐의 장기적인 노출로 인해 오히려 면역 관용이 유발되었기 때문으로 추정된다.

이 연구에서는 알레르겐을 국소부위로만 반복적으로 투여하는 방식을 사용했기 때문에 전신적인 알레르겐 감작 및 adjuvant를 사용하는 일반적인 천식 연구모델과 비교했을 때 알레르기 및 염증 관련 지표들의 변화양상이 다소 다르게 나타나는 제한점이 있었다. 그리고 마우스 천식 모델에서 가장 널리 사용되는 OVA를 집먼지진드기 알레르겐과 동일한 방식으로 처리한 비교군에서 일부 지표에서만 유의적인 염증 유발이 확인되었는데, 이는 전신감작 없는 국소적인 OVA 노출은 염증 발생이 제한적이고 면역관용이 발생될 가능성이 있기 때문으로 추정된다.27 또한 최근에 보고된 바에 따르면 동일한 집먼지진드기 알레르겐이라 할지라도 추출 및 생산된 공정이 동일하지 않을 경우(lot number가 다를 경우) Der p 1, 내독소(endotoxin) 등 알레르겐 내부 구성비율의 차이로 인해 증상 유발 정도가 달라진다는 점28에서 연구모델의 효용성에 대한 추가적인 검증연구가 필요할 것으로 생각한다.

이 연구에서 구축한 국내 유래 집먼지진드기 알레르겐 만성노출 연구모델은 8주 동안의 알레르겐의 반복적 국소노출에 따라 IgE 및 기도 내 염증세포 침윤, Th2 및 염증 관련 사이토카인의 증가, 기도개형 발생 등과 같은 만성 알레르기 및 염증반응 유발을 확인하였다. 이를 통해 국내 유래 집먼지진드기 알레르겐의 연구 활용도를 높일 수 있는 근거를 마련하였으며, 실제 환경에서의 대기 중 알레르겐 노출과 유사한 방식의 연구모델로서 기도개형과 같은 만성적 증상에 대한 발생기전 및 연관 지표 개발 등 만성 호흡기∙알레르기질환 연구에 유용하게 활용 가능할 것으로 기대한다.

Notes

This work was supported by a research grant (2017-NG67002-00, 2017-NG67002-01, and 2017-NG67002-02) of the Korea Centers for Disease Control and Prevention.

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