Artículo de Revisión

 

Estrés oxidativo: ¿un estado celular defectuoso para la función espermática?

 

B. José Manuel Mayorga Torres¹, Mauricio Camargo², Ángela P Cadavid¹, Walter D. Cardona Maya¹.

¹ Grupo Reproducción, Facultad de Medicina, ² Grupo Genética, Regeneración y Cáncer -GRC-, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Antioquia. Medellín, Colombia.

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RESUMEN

En los organismos vivos, las cantidades de radicales libres y especies reactivas del oxígeno (ROS) son controladas por un complejo sistema de homeostasis, capaz de mantener niveles fisiológicos de ROS necesarios para el funcionamiento y regulación de algunas biomoléculas. Paralelamente, los organismos poseen sistemas bioquímicos de protección contra el estrés oxidativo, que consiste en el desbalance entre la producción de especies químicas altamente reactivas y las defensas antioxidantes de la célula. Dicho estrés contribuye de manera importante a la etiología tanto de la senescencia celular como de algunas enfermedades. En el contexto reproductivo, las células espermáticas pasan por una serie de cambios fisiológicos durante los procesos de maduración, capacitación y fecundados, entre los que se incluyen las modificaciones de las proteínas existentes, reguladas por señales procedentes del entorno espermático, donde las ROS modulan importantes vías bioquímicas, involucradas en procesos fundamentales de la función del espermatozoide y que se pueden alterar en estados de estrés oxidativo. El objetivo de esta revisión de literatura es describir algunos de los procesos que contribuyen al estrés oxidativo y sus implicaciones sobre la funcionalidad espermática.

PALABRAS CLAVE: Espermatozoide, fertilidad, especies reactivas del oxígeno, antioxidantes

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SUMMARY

Living organisms regulate the load of free radicals and reactive oxygen species (ROS) by a complex homeostatic system, capable of maintaining physiological levels of ROS, necessary for the action and regulation of some biomolecules. In parallel, organisms harbor biochemical protection systems against oxidative stress, consisting of an unbalance state between oxygen reactive chemical species and antioxidant defense production; this kind of biochemical stress has been shown to contribute to cellular senescence and the development of different diseases. In the reproductive field, the spermatic cells undergo a serial of physiological changes during the maturation, capacitation and fertilization process. Such changes include the modification of proteins regulated by signals from the sperm environment, where ROS modulate important biochemical pathways involved in fundamental processes of sperm function, and that could be altered under oxidative stress conditions. The objective of this review is to describe some of the processes that contribute to oxidative stress and its implications on sperm functionality.

KEY WORDS: Sperm, fertility, reactive oxygen species, antioxidants

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INTRODUCCIÓN

El oxígeno es un compuesto vital para los procesos de la vida aeróbica, que inevitablemente genera las especies reactivas del oxígeno (ROS), agentes de oxidación altamente reactivos, que actúan como intermediarios químicos de vida corta sobre lípidos, aminoácidos, carbohidratos y ácidos nucleicos e inducen mutaciones en la molécula del ADN (1). Cuando la cantidad de ROS sobrepasa el balance entre la producción y la captación, se genera un fenómeno conocido como estrés oxidativo, el cual tiene consecuencias negativas sobre múltiples procesos celulares (2).

Hasta hace pocos años, las ROS eran consideradas elementos tóxicos para los espermatozoides humanos, sin embargo, en la actualidad se acepta que pequeñas cantidades de ROS y sus metabolitos pueden mediar y regular funciones espermáticas como la capacitación espermática, la reacción acrosomal y la interacción intergametos (3,4). No obstante, las ROS deben inactivarse continuamente para mantener un balance celular funcional (5), y es durante este proceso, que los sistemas de detoxificación tienen relevancia.

Las mitocondrias son consideradas una de las principales fuentes celulares de ROS, regulando los diferentes procesos fisiológicos de óxido/reducción (redox) dentro de los que se incluyen: i) la transducción de señales intracelulares (6,7), ii) la respuesta al estrés oxidativo (8-10), iii) el desarrollo embrionario (11), iv) la proliferación y adhesión celular (12,13), v) la expresión genética, y vi) la apoptosis (14). En consecuencia, las mitocondrias, los leucocitos presentes en el eyaculado y los espermatozoides morfológicamente anormales, pueden generar un cambio sobre el estado basal de los agentes oxidantes e inducir cambios sobre la actividad espermática. El objetivo de esta revisión de literatura es describir algunos de los procesos que contribuyen al estrés oxidativo y sus implicaciones sobre la funcionalidad espermática.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se realizó una revisión de la literatura científica relacionada con el estrés oxidativo y la función espermática en la base de datos PUBMED. Se seleccionaron los artículos de revisión, de opinión, reportes de caso y artículos originales, con el fin de obtener la mayor y más actualizada información del tema de interés.

Fuentes de las especies reactivas del oxígeno. Las ROS son generadas como productos secundarios de procesos metabólicos entre los que se encuentran la producción de energía, la detoxificación de compuestos nocivos y la defensa frente a agentes patógenos. Generalmente son producidas en las células por oxidasas y peroxidasas como la xantina oxidasa o como un producto alternativo de enzimas como la óxido-nítrico sintasa o el citocromo p450 (15). En el eyaculado, las principales fuentes de ROS son los leucocitos y las células espermáticas anormales.

Los leucocitos son un componente esencial del sistema inmune innato, son reclutados hacia los sitios de infección por factores quimiotácticos y son capaces de eliminar los microorganismos a través de la fagocitosis. El reconocimiento de un agente patógeno promueve la iniciación de diversas vías de transducción de señales intracelulares, incluyendo el complejo NADPH-oxidasa (16) lo cual induce la producción de varios tipos de ROS como superóxido, peróxido de hidrógeno y ácido hipocloroso (17). Después de la fagocitosis, los microorganismos son eliminados por la exposición a altas concentraciones de ROS y otros productos microbicidas contenidos en los gránulos celulares. Los leucocitos pueden estar presentes en la muestra seminal y son considerados como normales en cantidades inferiores a 1 x 10⁶/mL (18), un aumento podría ser un indicador de un proceso infeccioso.

Los leucocitos y en especial los activados, son capaces de producir por lo menos 100 veces más cantidad de ROS que las células germinales, generando un efecto negativo sobre las espermatogonias (19). Sin embargo, aún no es claro si la presencia de leucocitos en una muestra seminal es necesariamente negativa, debido a que un cierto número de éstos podría llegar atener un efecto beneficioso sobre la concentración, la movilidad y la reacción acrosomal espermática (20). Inclusive, los leucocitos podrían estar promoviendo la eliminación de los espermatozoides defectuosos e influyendo en la estimulación de las funciones espermáticas a través de la liberación de ROS. Así, la presencia de estas células puede tener una función dual en el eyaculado, aún más cuando el impacto negativo de las ROS producidas por los leucocitos depende de los sistemas antioxidantes que regulan la capacidad detoxificante.

Otra de las fuentes de ROS en el semen son los espermatozoides, cuyas mitocondrias son su principal fuente energética y contribuyentes importantes de ROS intracelulares (21). Se estima que el oocito humano contiene más de 100.000 mitocondrias, mientras que los espermatozoides poseen un número menor debido a su reducción durante la espermiogénesis. Durante los cambios morfológicos asociados con la diferenciación a espermátide después de la finalización de la meiosis, y en particular durante la formación del axonema, todas las mitocondrias se agregan hacia el núcleo haploide formando una serie de capas concéntricas, en donde las mitocondrias se encuentran a lo largo de esta estructura, favoreciendo la transferencia óptima de ATP a los motores de dineína del axonema, para dirigir el movimiento flagelar (22).

Las implicaciones sobre cómo las mitocondrias producen ROS, son de vital importancia para entender una serie de temas biomédicos como la diabetes, el envejecimiento, la enfermedad de Alzheimer, la insuficiencia cardíaca, entre otras condiciones médicas asociadas (23-25). Los niveles basales de ROS y el papel de las mitocondrias en el mantenimiento de éstos aún se desconocen en las células germinales masculinas. Las mutaciones mitocondriales tienen un efecto directo sobre su metabolismo, llegando a producir crisis energética en los espermatozoides, lo que aumenta su deterioro funcional (26). Adicionalmente, existe una relación entre una baja calidad espermática y la generación de ROS, debida a defectos sobre los mecanismos de extrusión citoplasmática. Se ha observado una correlación positiva entre la retención residual de citoplasma por los espermatozoides y la generación de ROS intracelular y se especula que un aumento de estos agentes está mediado por la acción de la enzima citosólica glucosa 6-fosfato-deshidrogenasa (27,28). De otro lado, el incremento de espermatozoides inmaduros con citoplasma residual observado en parejas infértiles, sugiere que la calidad de la espermatogénesis es menor a la de parejas fértiles (29-31). Además, existen otras posibilidades sobre la generación de ROS intracelular en el espermatozoide: i) la fuga de electrones de la cadena de transporte mitocondrial, ii) la NA-DPH oxidasa como una posible fuente de ROS y, iii) la generación de ROS por medio del oxido nítrico (ON) en la regiones post-acrosomales y ecuatoriales (32).

Varias aproximaciones metodológicas permiten la cuantificación de ROS espermáticas: quimioluminiscencia, espectroscopía y citometría de flujo (18,33). El ensayo de quimioluminiscencia evalúa el estado redox de los espermatozoides con alta sensibilidad, sin embargo, la fuente de éstas en el semen no está claramente identificada, convirtiéndose en un factor de confusión en este análisis.

La espectroscopía de resonancia de espín electrónico es otra técnica que consiste en la evaluación de la reactividad por medio de la detección de las especies químicas que tienen electrones desapareados. Debido a la poca cantidad de muestra y la corta vida de las ROS, su cuantificación mediante citometría de flujo (33), emplea moléculas señal que permiten determinar la cantidad de estos oxidantes intracelulares generadas por las células presentes en el eyaculado, tales como células espermatogénicas maduras e inmaduras, leucocitos, bacterias y algunas células epiteliales.

Función espermática: influencia de las especies reactivas del oxígeno. En general, la incubación artificial de los espermatozoides con bajas concentraciones de ROS estimula la hiperactivación y la capacidad del espermatozoide para realizar la reacción acrosomal, lo que promueve la fusión al oocito (34,35). La primera evidencia experimental de la participación de ROS en la fisiología del espermatozoide humano proviene de la observación de espermatozoides expuestos a oxígeno, los cuales mostraron características de espermatozoides capacitados (36).

Durante las primeras etapas iniciales de la capacitación, las concentraciones de calcio intracelular y el AMP comienzan a elevarse, se inicia la generación de ROS y los espermatozoides adquieren una movilidad vigorosa conocida como hiperactivación. Durante este proceso se genera un aumento global de la fosforilación de la tirosina, como consecuencia del estado redox (37) y del aumento en la generación de AMPc celular (38), proceso indispensable, debido a que si no se genera la fosforilación adecuada, la capacitación espermática se vería afectada (39).

La reducción de peróxido de hidrogeno disminuye considerablemente el proceso de hiperactivación y capacitación espermática (4,37,40), restringiendo incluso la respuesta a otros inductores de la actividad espermática como ionóforo de calcio A23187, lisofosfatidilcolina, ZP3 y progesterona (37,41), sin llegar a afectar la viabilidad y la movilidad espermática.

Dado que no existen datos sobre las concentraciones fisiológicas de ROS en las que se están desarrollando estos procesos, los tratamientos in vitro intentan recrear algunas condiciones celulares específicas. Sin embargo, la observación de que las células del cúmulo de oocitos bovinos mejora la tasa de fecundación de manera dependiente de oxígeno indica que el oocito estimula a los espermatozoides mediante una serie de moléculas mensajeras para completar el proceso de capacitación, promoviendo la habilidad para fecundar (42).

En 2010, reportaron que gran parte del daño del ADN en los espermatozoides es generado por el estrés oxidativo (43); generalmente más del 96% de los espermatozoides de una muestra seminal poseen características anormales (18), que al parecer serían un remanente de células morfológicamente anormales que no alcanzaron a completar el proceso. Elevadas concentraciones de ROS median las rupturas en el ADN, fenómeno comúnmente observado en los espermatozoides de hombres infértiles (34,44,45). De hecho, en estudios en los cuales los espermatozoides fueron expuestos a altas concentraciones de ROS producidas artificialmente, se observó un incremento significativo en el daño del ADN, una disminución de la movilidad progresiva y la inducción de procesos apoptóticos (46,47).

Se ha reportado que los daños en el ADN de los espermatozoides pueden ocurrir en el testículo, el epidídimo o después de la eyaculación (48) y las causas pueden estar relacionadas con fallas en el empaquetamiento, la madurez nuclear, la fragmentación de la cromatina, aneuploidías o por defectos en la integridad del ADN (49). Diferentes autores proponen la importancia de la compactación del ADN en la protección de la información genética masculina frente a diferentes factores tanto internos como externos (33,49-53).

La membrana plasmática de los espermatozoides posee una composición específica con un contenido alto de ácidos grasos polinsaturados, plasmalógenos y esfingomielinas haciéndola un blanco fácil de los agentes oxidantes. Aunque esta estructura facilita su flexibilidad y funcionalidad, constituye el principal sustrato para la lipoperoxidación, lo que daría lugar a severos desórdenes funcionales afectando mecanismos tan importantes como la adhesión y la fusión con el oocito (1). La oxidación de lípidos causada por condiciones de estrés oxi-dativo durante el transporte de los espermatozoides a través del epidídimo, afecta a la membrana plasmática además de procesos como la reacción del acrosoma sin generar ningún efecto aparente sobre la movilidad (54).

Como es bien conocido, la apoptosis es un principio biológico de muerte celular programada presente en todos los tipos celulares (55). Este proceso altamente regulado, asociado a una cascada de eventos secuenciales, es inducido por dos posibles vías que llevan a muerte celular: la vía extrínseca es dirigida por ligandos de muerte extracelulares como CD95L/FasL, y la vía intrínseca es inducida por alteraciones mitocondriales, una alteración de la homeostasis celular como consecuencia del estrés inducido por una amplia variedad de factores que incluyen ataque por ROS, el desprendimiento de la matriz extracelular, el calor, la hipoxia, la irradiación con rayos gamma, daños en el ADN, o simplemente la falta de factores de supervivencia.

Existen dos grandes propuestas sobre el mecanismo de apoptosis en espermatozoides maduros: i) La eliminación las células germinales alteradas y ii) la regulación de la senescencia de una célula espermática del aparato reproductor masculino y femenino después de la pérdida de la viabilidad. Se sugiere que la contribución de ROS mitocondrial puede ser un mecanismo apoptótico activado, y por tal razón la mayor parte del daño observado sobre el material genético en los espermatozoides humanos tiene un origen oxidativo (56).

Daños en el ADN espermático son una sólida señal de baja calidad seminal (33,48-51), no obstante, el desarrollo de tecnologías en la reproducción asistida, han permitido el desarrollo de embriones in vitro, a partir de espermatozoides que habrían sido rechazados in vivo, lo cual puede tener serías implicaciones a largo plazo en la salud y el bienestar de los niños concebidos mediante técnicas de reproducción asistida, siendo un objetivo claro, la selección de gametos con las mejores características.

Capacidad antioxidante en el eyaculado. La generación intracelular de ROS per se, es una consecuencia inevitable y fisiológicamente importante; para contrarrestarlo, las mitocondrias y la célula en general, poseen numerosos sistemas de defensa, por lo cual la verdadera fuente de estrés oxidativo es el producto del desequilibrio espacio-temporal de la producción de ROS y los sistemas de desintoxicación (57).

Si bien todos los organismos aeróbicos están continuamente expuestos a ROS, un sistema antioxidante es necesario para secuestrar estos agentes oxidativos y mantener condiciones homeostáticas, sistemas que posiblemente han evolucionado conjuntamente para mantener las concentraciones basales de ROS y antioxidantes evadiendo los efectos patológicos generados por el estrés oxidativo. Estudios en modelos animales en los que se induce la reducción de la defensa antioxidante, confirman las importantes funciones de enzimas como la manganeso superóxidodismutasa, la glutatión peroxidasa y la superóxidodismutasa (3,58-60).

La cantidad de enzimas antioxidantes en el espermatozoide es limitada debido a la reducción del citoplasma celular durante la gametogénesis, lo que hace a los espermatozoides susceptibles al daño oxidativo, y paradójicamente, la membrana espermática en mamíferos presenta una composición lipídica altamente susceptible al ataque oxidativo.

El plasma seminal está formado por la contribución de fluidos que provienen del epidídimo y las glándulas sexuales accesorias: cerca del 5% deriva de las glándulas de Cowper y las glándulas de Littré, siendo la primera parte del eyaculado; la segunda porción es otorgada por la próstata (1530%), mientras que la última porción es aportada por el epidídimo y las vesículas seminales, en los que sus componentes no están completamente mezclados durante la eyaculación (61). El eyaculado contiene muchas proteínas de importancia para la fecundación, por lo que algunos estudios se han encargado de comparar su composición entre individuos fértiles e infértiles con el objetivo de caracterizarlo (62,63) y asociarlo con la movilidad y la calidad del ADN espermático (64). En el plasma seminal se encuentra una cantidad de antioxidantes, principalmente extracelulares, tanto enzimáticos como no enzimáticos (1), entre los que se incluyen la catalasa, la superóxido dismutasa y el glutatión.

La manipulación, criopreservación y descongelación o centrifugación de las muestras seminales durante los procedimientos de rutina en los laboratorios de reproducción asistida, promueven la producción de ROS y la eliminación de gran parte de los antioxidantes extracelulares, lo cual genera efectos no deseados sobre las células germinales (65, 66).

Beneficios y riesgos de la terapia antioxidante en el manejo de la infertilidad. Debido a los efectos nocivos generados por las ROS, el uso de antioxidantes aparece como una herramienta para proteger a las células del daño oxidativo. La terapia antioxidante ha obtenidos buenos resultados en diferentes investigaciones (67-69); no obstante, son pocos los estudios de intervención que muestren un efecto protector sobre las células espermáticas (51).

Los antioxidantes naturales están adquiriendo gran importancia para la protección de las células frente al daño oxidativo. La melatonina, reduce los niveles de calcio y de la caspasa 9, bloqueando el proceso apoptótico, lo que indica que el mecanismo de acción de la melatonina genera su efecto sobre las mitocondrias espermáticas (70). Del mismo modo, el mio-inositol, la forma más importante del inositol en la naturaleza y un componente de la vitamina B, ha demostrado mejorar la función mitocondrial de los pacientes oligoastenoteratozooespérmicos, lo que sugiere que esta molécula puede ser usada para el tratamiento de la infertilidad masculina (71).

Dado que el estrés oxidativo no es un fenómeno localizado y es causado por diferentes agentes oxidantes, es razonable suponer que el tratamiento con una combinación de antioxidantes de biodispobilidad oral y dirigidos hacia el tracto reproductivo masculino, podrían ser una mejor protección frente esta condición (50). No obstante, algunas "recetas" pueden combinar un gran número de antioxidantes con un mecanismo de acción agresivo, aumentando la posibilidad de generar un fenómeno denominado "estrés reductivo" (72), debido a la disminución de las concentración fisiológica de ROS, lo cual es crítico para la función normal de la espermatozoide. Es importante señalar que cerca de un 40% de los hombres que consultan a una clínica de fertilidad, son fértiles y carentes de daño oxidativo (73) y por tanto no requieren tratamiento antioxidante dado que de hecho, este tipo de terapias podría reducir su potencial de fertilidad, por lo que el consumo de antioxidantes para mejorar la calidad espermática debe tener una base diagnóstica.

CONCLUSIONES

El estrés oxidativo juega un papel importante en la etiología de la infertilidad masculina (33), aunque los orígenes de las ROS responsables de esta condición han sido objeto de una considerable incertidumbre y de cierta controversia. Si bien existen otras fuentes celulares, la contribución por parte de la mitocondria espermática ha sido estudiada como un factor regulador de la actividad y funcionalidad espermática, dadas las características únicas de estas células al estar en contacto con el ambiente externo. Una área de gran relevancia sería la elucidación del factor asociado a la susceptibilidad frente al daño oxidativo, ya que se ha observado una variación inter individuo y por tanto cobrará un valor predictivo para el desarrollo posterior de las enfermedades asociadas. Adicionalmente, se ha observado un efecto beneficioso en los espermatozoides humanos con la administración de suplementos in vitro de diferentes compuestos antioxidantes naturales o sintetizados químicamente. Sin embargo, se ha demostrado que su efecto podría disminuir las concentraciones de las ROS a valores inadecuados y llegar a comportarse como un agente prooxidante. Por tal motivo, el mecanismo de acción, las combinaciones y las dosis de los tratamientos antioxidantes deben ser estudiadas en detalle para evitar efectos secundarios no deseados.

Agradecimientos: Este trabajo fue financiado por la Estrategia de Sostenibilidad del Grupo GRC y Grupo Reproducción de la Universidad de Antioquia.

 

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