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Introducción
Las infecciones gastrointestinales son un problema de salud pública mundial. En el año 2015, se estimó una incidencia de 688 millones de casos en el mundo con 499.000 muertes en niños bajo los 5 años. Si bien la implementación de medidas de higiene, prevención y tratamiento de la deshidratación han disminuido considerablemente la mortalidad de las diarreas infecciosas en países en desarrollo, la morbilidad y los costos asociados continúan siendo un problema de salud pública1.
La vigilancia epidemiológica y los estudios longitudinales permiten conocer y caracterizar los episodios de diarrea aguda en una población, además de entregar una base para la implementación de estrategias de control contra estas infecciones2. Uno de los grandes obstáculos para los estudios de vigilancia en diarrea es la elección de las herramientas diagnósticas para determinar su etiología. Si bien el cultivo es la técnica diagnóstica de referencia para la mayoría de los patógenos gastrointestinales, su bajo rendimiento y la dificultad para identificar algunos agentes (virus y parásitos, principalmente), han disminuido su uso, tanto en el diagnóstico rutinario como en estudios epidemiológicos3. El desarrollo de herramientas de biología molecular, no sólo ha permitido una mayor sensibilidad en la detección de patógenos, sino que sus plataformas de detección de múltiples agentes en una sola reacción ha facilitado la identificación de patógenos entéricos clásicos (Shigella, Salmonella y rotavirus), agentes de difícil cultivo (Campylobacter, Clostridium, virus y parásitos en general) y patógenos cuya identificación se basa en la detección de factores de patogenicidad específicos (Escherichia coli diarreogénicas)4,5. En este sentido, las técnicas de diagnóstico molecular múltiple han abierto un nuevo horizonte para conocer la etiología de las diarreas y comprender la epidemiología de los agentes responsables de estas infecciones6,7. Sin embargo, su uso como herramienta diagnóstica y epidemiológica ha generado una gran discusión en la interpretación de los resultados, considerando el aumento de patógenos detectados y la etiología de la diarrea8.
Considerando la escasa información epidemiológica que existe sobre las diarreas infecciosas en Chile, en este trabajo se utilizó una técnica de diagnóstico molecular para 22 patógenos gastrointestinales con el objetivo de determinar la etiología de la diarrea aguda en niños bajo los cinco años en uno de los centros centinelas que forman parte de la red de vigilancia de rotavirus de nuestro país.
Método
Diseño global del estudio
Se realizó un estudio retrospectivo, observacional, en niños bajo los cinco años que se internaron por diarrea aguda en el Hospital Dr. Luis Calvo Mackenna (HLCM) durante los meses de diciembre del año 2015 a diciembre del 2019. El HLCM, desde el año 2007 es un centro de vigilancia centinela de infecciones gastrointestinales por rotavirus del Ministerio de Salud de Chile (MINSAL), realizándose detección de rotavirus en los niños bajo cinco años consultantes por diarrea y que requieren hospitalización, al menos transitoria, para hidratación.
De forma rutinaria, las muestras se analizaron en HLCM mediante test rápido para rotavirus y un test de ELISA en el Laboratorio de Virología del Instituto de Salud Pública (ISP). A partir del año 2015, se incorporó el panel FilmArray GI® para el análisis de las muestras incluidas en esta vigilancia para ampliar el estudio etiológico de estas diarreas. Como fuente de datos se utilizaron los registros de esta vigilancia que incorporaba el resultado del panel FilmArray GI® y contaba con las siguientes variables: sexo, edad y resultados del laboratorio local y de referencia nacional.
Definición de caso de diarrea
Se definió como diarrea a tres o más evacuaciones líquidas o semilíquidas en las últimas 24 h, de hasta 14 días de duración. Un caso de diarrea correspondió a un niño menor de cinco años ingresado a una sala de rehidratación, que recibió rehidratación oral o endovenosa o que estuvo en una sala de hospitalización por diarrea. Se excluyeron los niños cuya causa de hospitalización era distinta a la diarrea, una toma de muestra después de 48 h del ingreso o haber sido referido desde otro establecimiento donde permaneció más de 24 h.
Detección de enteropatógenos
La toma de muestras se realizó al ingreso al HCLM y se procesó en el laboratorio de Biología Molecular de este recinto para la detección de 22 patógenos entéricos mediante el panel FilmArray GI® (BioFire, Inc., Salt Lake City, UT), que permite la detección de los siguientes patógenos: i) virus: (adenovirus F40/41, astrovirus, norovirus GI/GII (NoV), rotavirus A (RV), sapovirus I, II, IV y V), ii) bacterias: Campylobacter spp., Clostridium difficile, Plesiomonas shigelloides, Salmonella spp., Yersinia enterocolitica, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio cholerae, Shigella spp., Escherichia coli enteroagregativa (EAEC), E. coli enteropatogénica (EPEC), E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli productora de toxina Shiga (STEC)y E. coli enteroinvasora (EIEC), y iii) parásitos: Cryptosporidium spp, Cyclospora cayetanensis, Entamoeba histolytica y Giardia lamblia. Se definió como co-detección la presencia de más de un patógeno en una muestra.
Análisis estadístico
Se utilizó Stata 12 (Stata Corp, College Station, Texas) y Microsoft Excel 2013.
Aspectos éticos. Con respecto a la Ley N° 20.584 que “Regula los derechos y deberes que tienen las personas en relación con acciones vinculadas a su atención en salud”, este estudio no vulnera la mencionada ley, debido a que utiliza fuentes de datos secundarios del MINSAL, los cuales se recogen dando cumplimiento a su rol según las siguientes leyes previas: DFL Nº 1/2005 del MINSAL y Ley Nº 19.628 sobre datos sensibles. El Comité de Ética Científico Pediátrico del Servicio de Salud Metropolitano Oriente aprobó la realización de este artículo el 26 de diciembre de 2019.
Resultados
Durante los cuatro años del periodo de estudio, un total de 611 casos cumplieron la definición de caso de diarrea para esta vigilancia. En 115 de ellos (19%) no se obtuvo muestra fecal o la muestra fue insuficiente para el ensayo de laboratorio. Tres muestras resultaron invalidadas en el panel FilmArray GI®. En resumen, se analizaron 493 muestras correspondientes a igual número de casos.
La mediana de edad de los casos estudiados fue de 13 meses (rango de nueve días a cuatro años, diez meses), 228 (46%) casos tenían menos de un año de edad, y 265 (54%) entre uno y cinco años. El 55% (270/493) de los casos eran hombres; y 45% (223/493) mujeres.
En 427 muestras (87%) se detectó al menos un enteropatógeno; siendo 66 muestras (13%) negativas para los agentes virales, bacterianos y parasitarios analizados. De las 427 muestras positivas, en 174 de ellas (41%) se detectó sólo un agente; 253 muestras positivas (59%) presentaron co-detección de patógenos. En este último grupo. en 154 muestras (36%) se detectaron dos patógenos; en 71 (17%) tres patógenos; y en 28 (6%) cuatro o más agentes. La detección virus-bacteria se observó en 186 muestras positivas (38%); bacteria-bacteria en 29 muestras (6%); virus-virus en 20 muestras (4%); virus-bacteria-parásito en 11 muestras (2%). La co-detección de bacteria-parásito y virus-parásito fue infrecuente (1% en ambos grupos). En la Tabla 1 se resume la frecuencia de detección de cepas bacterianas, parasitarias y virales en los 427 casos positivos, según los grupos de edad analizados.
Tabla 1 Distribución por grupo etario de cepas bacterianas, parasitarias y virales detectadas en muestras fecales positivas de niños con diarrea (n = 427), analizados mediante el panel FilmArray GI®, Hospital Dr. Luis Calvo Mackenna, diciembre 2015-diciembre 2019
| Patógeno | Número de muestras positivas (% sobre el total de muestras) |
||
|---|---|---|---|
| < 5 | < 1 año | 1-4 años | |
| (n = 493) | (n = 288) | (n = 265) | |
| Bacterias | 51 (10%) | 22 (8%) | 29 (11%) |
| Bacterias - Bacterias | 29 (6%) | 7 (2%) | 22 (8%) |
| Bacterias - Parásitos | 4 (1%) | 0 (0%) | 4 (2%) |
| Bacterias - Virus | 186 (38%) | 81 (28%) | 105 (40%) |
| Bacterias - Virus - Parásitos | 11 (2%) | 0 (0%) | 11 (4%) |
| Virus | 123 (25%) | 50 (20%) | 64 (24%) |
| Virus - Virus | 20 (4%) | 8 (3%) | 12 (5%) |
| Virus - Parásitos | 3 (1%) | 0 (0%) | 3 (1%) |
| Total de muestras | 427 | 177 | 250 |
En la Figura 1 se presenta la frecuencia de detección de enteropatógenos en las muestras analizadas. De los 17 diferentes patógenos encontrados, todos se detectaron junto a algún otro agente. Los agentes con mayor porcentaje de co-detección, sobre el 90%, fueron EPEC y EAEC, ambas con un 93%. Por otra parte, los agentes que presentaron las más bajas frecuencias de co-detección fueron rotavirus (63%), Salmonella (67%) y EIEC (67%).
Figura 1 Frecuencia de detección de agentes enteropatógenos en niños con diarrea, desagregada por detección única y co-detección, Hospital Dr. Luis Calvo Mackenna, diciembre 2015 - diciembre 2019.
Según el tipo de patógeno, los virus gastroentéricos se detectaron en 70% de las muestras (343/493); en 17% de los casos positivos a virus (59/343) se encontraron dos o más virus gastroentéricos. Los enteropatógenos bacterianos se detectaron en 57% (281/493); en 32% de estos casos positivos (90/281) se detectaron dos o más patógenos bacterianos. Los protozoos parasitarios se detectaron en 4% de las muestras analizadas (18/493) y sólo en un caso se detectaron dos protozoos simultáneos.
No se observaron diferencias significativas en la frecuencia de detección para virus, bacterias y parásitos entre ambos sexos.
Con respecto a la edad, no se encontraron diferencias significativas para virus y bacterias entre los dos grupos etarios establecidos. En el caso de los parásitos, si bien se encontró diferencias entre los dos grupos etarios, es importante mencionar que en el grupo de lactantes bajo un año no se detectaron parásitos.
Utilizando el panel FilmArray GI®, se detectaron 409 virus, 386 bacterias y 19 parásitos. En la Tabla 2 se detallan los agentes detectados en las 427 muestras positivas para uno o más patógenos. De los agentes virales, rotavirus fue el virus más detectado y uno de los patógenos prevalentes en ambos grupos de edad, 38% (110/288) en el grupo de lactantes bajo un año y 42% (111/265) en los niños de uno a cuatro años. En el grupo etario de uno a cuatro años se observó mayor frecuencia de norovirus (26%; 69/265), comparado con los niños menores de un año (12%; 35/288).
Tabla 2 Número de detecciones y porcentaje sobre el total de muestras de niños con diarrea analizadas por el panel FilmArray GI®, según patógeno entérico y grupo etario, Hospital Dr. Luis Calvo Mackenna, año diciembre 2015-diciembre 2019
| Patógeno | Número de detecciones positivas (% sobre el total de muestras) | |||
|---|---|---|---|---|
| < 5 (n = 493) | < 1 año (n = 288) | 1-4 años (n = 265) | ||
| Bacterias | ||||
| Campylobacter | 44 (9%) | 7 (2%) | 37 (14%) | |
| Clostridium difficile | 89 (18%) | 54 (19%) | 35 (1 3%) | |
| Plesiomonas shigelloides | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | |
| Salmonella spp. | 15 (3%) | 5 (2%) | 10 (4%) | |
| Yersinia enterocolítica | 5 (1%) | 3 (1%) | 2 (1%) | |
| Vibrio spp. | 1 (0%) | 0 (0%) | 1 (0%) | |
| Vibrio cholerae | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | |
| E. coli enteroagregativa (EAEC) | 65 (13%) | 22 (8%) | 43 (16%) | |
| E. coli enteropatogénica (EPEC) | 134 (27%) | 46 (16%) | 88 (33%) | |
| E. coli enterotoxigénica (ETEC) | 10 (2%) | 2 (1%) | 8 (3%) | |
| E. coli productora de toxina Shiga (STEC) | 14 (3%) | 4 (1%) | 10 (4%) | |
| Shigella/E. coli enteroinvasiva (EIEC) | 9 (2%) | 2 (1 %) | 7 (3%) | |
| Parásitos | ||||
| Cryptosporidium | 6 (1%) | 0 (0%) | 6 (2%) | |
| Cyc/ ospora cayet anensis | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | |
| Entamoeba histolytica | 0 (0%) | 0 (0%) | 0 (0%) | |
| Giardia lamblia | 13 (3%) | 0 (0%) | 13 (5%) | |
| Virus | ||||
| Adenovirus F40/41 | 33 (7%) | 12 (4%) | 21 (8%) | |
| Astrovirus | 15 (3%) | 7 (2%) | 8 (3%) | |
| Norovirus Gl/Gll | 104 (21%) | 35 (12%) | 69 (26%) | |
| Rotavirus A | 221 (45%) | 110 (38%) | 111 (42%) | |
| Sapovirus | 36 (7%) | 9 (3%) | 27 (10%) | |
| Total de detecciones | 814 | 318 | 496 | |
* En cada celda está el número de muestras positivas para el respectivo agente (% sobre el total de muestras analizadas). Debido a que se detectaron múltiples agentes en 60% de los casos, la sumatoria supera al total de casos.
De las 493 muestras incluidas en este trabajo, se analizaron 325 mediante el test inmunoquímico de ELISA. Al comparar el diagnóstico de rotavirus se observó que, en todas las muestras positivas para rotavirus por ELISA se detectó este virus por FilmArray GI®, con excepción de dos muestras. Para el caso de las muestras negativas por ELISA, 10,5% (21/199) resultaron ser positivas para rotavirus por el panel molecular.
Los agentes bacterianos más frecuentes fueron EPEC (27%; 134/493), C. difficile (18%; 89/493), EAEC (13%; 65/493) y Campylo bacter (9%; 44/493). En los lactantes bajo un año, C. difficile se detectó en 19% (54/288) y EPEC en 16% (46/288). En el grupo etario de uno a cuatro años de edad, se observó un aumento de EPEC (33%; 88/265) y una disminución de C. difficile (13%; 35/265). Campylobacter spp fue detectado en 2% (7/288) de los lactantes bajo un año y en 14% (37/265) de los mayores a un año.
Dentro de los parásitos, sólo se identificó Giardia lamblia y Cryptosporidium spp, en 3 y 1% del total de las muestras de niños bajo y sobre un año, respectivamente.
Según la estacionalidad, 35% (137/386) de los agentes bacterianos se detectaron entre enero y marzo (meses de verano), principalmente las cepas de E. coli diarreogénicas y C. difficile. Por su parte, los casos con muestras positivas a Campylobacter spp, no presentaron un perfil estacional, detectándose en todos los meses del año. Con respecto a los agentes virales, se observó un aumento en la detección de norovirus en primavera y verano con respecto a otoño e invierno (80 versus 24 detecciones). En tanto que las detecciones de rotavirus aumentaron en otoño e invierno con respecto a primavera verano (126 versus 95 detecciones). En el caso de los parásitos, no fue posible establecer un patrón estacional (Figura 2).
Discusión
La utilización de un panel molecular dentro de un sistema de vigilancia de diarreas en niños bajo los cinco años que ingresan al hospital, permitió identificar los patógenos entéricos asociados a diarreas adquiridas en la comunidad. Utilizando esta técnica, se identificaron uno o varios agentes patógenos en 86% de las muestras, siendo éste el primer estudio en el país que incorpora una técnica de diagnóstico molecular múltiple para la vigilancia centinela en hospitales.
De los agentes incluidos en el panel molecular, rotavirus fue el agente más frecuente, identificado en 45% de los casos de diarrea estudiados. Esta cifra supera lo descrito para nuestro país en la literatura científica y lo pesquisado a través de la vigilancia epidemiológica de rotavirus, en que se describe una positividad para Chile en 33% de los casos9,10. Por otra parte, al comparar las técnicas de ELISA y FilmArray GI®, en 10,5% de los casos negativos para ELISA para rotavirus se detectó este virus con el panel molecular. Esta mayor proporción de casos positivos a rotavirus, probablemente se debe a los parámetros analíticos de la técnica utilizada en este estudio, en que destaca una elevada sensibilidad. La mayor parte de los casos de rotavirus se presentaron en los niños bajo un año, siendo este grupo, el más susceptible y que potencialmente podría verse beneficiado con la vacunación durante los primeros seis meses de vida7,11. La vacuna contra rotavirus no está incorporada en el Programa Nacional de Inmunizaciones (PNI) del niño sano de Chile, y sólo se administra en centros privados de atención con una cobertura no determinada o como parte de la vacunación de pacientes con necesidades especiales por patologías o situaciones de riesgos12. Actualmente, en 92 países se ha introducido la vacuna anti-rotavirus en los programas nacionales o subnacionales con impacto en la reducción de la enfermedad13. En Chile, la mortalidad por diarreas es poco frecuente, sin embargo, son significativas las consultas, hospitalizaciones y gastos médicos por esta causa14.
Se ha demostrado que la diarrea por rotavirus afecta a casi todos los niños bajo cinco años, sin importar su nivel socio-económico ni las condiciones ambientales en las que vivan15. Al comparar nuestros resultados con un estudio de Chile en un establecimiento de salud privado, donde se determinó la prevalencia de enteropatógenos empleando la misma herramienta diagnóstica utilizada en este trabajo16, se encontró rotavirus en 24% en los lactantes bajo un año, a diferencia de nuestro estudio, donde se encontró un 38% en este grupo etario. Esto podría deberse a que el grupo que acude al centro privado podría tener un estado inmunitario distinto a los casos estudiados en este estudio, por tener un mayor acceso a la vacuna. En ninguno de estos estudios, se contó con el estado vacunal de los casos.
Las especies bacterianas con mayor frecuencia fueron Campylobacter spp, C. difficile y las cepas de EAEC y EPEC. Sin embargo, estas bacterias se detectaron por sobre el 80% en co-infecciones, lo que dificulta la interpretación de su rol como agente etiológico de la diarrea. En el caso de las cepas de E. coli diarreogénicas, numerosos estudios han encontrado la presencia de algunos de sus patotipos, principalmente EAEC y EPEC, en niños sin diarrea2,16. Una situación similar se ha observado con C. difficile y Campylobacter spp, donde mediante el uso de técnicas de diagnóstico molecular múltiple se ha detectado la presencia de este microorganismo en niños bajo 5 años de edad sin síntomas de infección gastrointestinal7,18. En este sentido, es importante mencionar que la técnica utilizada en esta vigilancia es del tipo cualitativa, y dada su alta sensibilidad no permite discriminar entre enteropatógenos presentes de un episodio de diarrea anterior ó como parte de la microbiota intestinal de estos niños. El desarrollo de plataformas diagnósticas cuantitativas para enteropatógenos podría facilitar la interpretación de los resultados de co-infección y el desarrollo de algoritmos para apoyar el diagnóstico de las diarreas.
Nuestro estudio tiene limitaciones. Debido al diseño del mismo, no se realizó cultivo microbiológico de los enteropatógenos. Sin embargo, la plataforma diagnóstica utilizada, presenta valores de sensibilidad y especificidad altos en sus etapas de validación7. Por otra parte, el cultivo de la mayoría de los patógenos incluidos en el panel no se realiza de forma convencional. Sin embargo, la escasez de estudios con técnicas moleculares múltiples, que determinen la prevalencia de estos agentes en niños sanos, dificulta la atribución de causalidad a la detección de algunos de estos microorganismos en los niños con diarrea.
La vigilancia epidemiológica con técnicas moleculares mejora el rendimiento etiológico de las diarreas en niños bajo los cinco años, permitiendo la identificación de una gran variedad de patógenos intestinales. Al implementar esta técnica en todos los establecimientos centinela de rotavirus, se podría responder en forma oportuna a eventos inusitados como brotes, lo que permitiría mantener la vigilancia de rotavirus si se implementa la vacuna y además responder a cambios epidemiológicos hoy no vislumbrados, que pudieran requerir a futuro de modificaciones de las acciones de salud pública.
