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La Hipercolesterolemia Familiar (HF) es un transtorno genético frecuente, de transmisión autosómico dominante, que se caracteriza por niveles plasmáticos elevados de colesterol asociado a lipoproteinas de baja densidad (C-LDL) desde el nacimiento y un riesgo elevado de desarrollar enfermedad cardiovascular (ECV) ateroesclerótica prematura1–3. La HF es causada principalmente por variantes en tres genes codificantes para proteínas fundamentales en el metabolismo lipídico, tales como, el receptor de LDL (RLDL) (70-90% de los casos), el gen de apolipoproteina B (APOB) (~5%) y la proproteina convertasa de subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9)4–7. Muy raramente, mutaciones en otros genes involucrados en el metabolismo de las lipoproteínas como son el gen que codifica la apolipoproteina E (APOE) y el de la proteína adaptadora transductora de señal (STAP1) pueden causar un fenotipo similar a HF1.
La prevalencia estimada actual de la HF heterocigota es de 1 en 250 individuos de la población general, que aumenta considerablemente en sujetos con ECV prematura2,7–10. Por otra parte, la HF Homocigota en una entidad rara, con una prevalencia estimada en 1:450.000 individuos en población general3. Por tanto, en Chile se estiman en más de 70.000 los casos con HF heterocigota y en 40 los casos con HF homocigota.
En Chile no existen programas establecidos para la detección de la HF, si bien en la orientación técnica del Minsal 2018 se hace mención a la importancia del diagnóstico temprano y tratamiento oportuno para prevenir el desarrollo de la enfermedad CV. Se han descrito en los últimos años las características moleculares en sujetos heterocigotos y homocigotos en conjunto con otros países que conforman la Red Iberoamericana de Hipercolesterolemia Familiar11,12.
Con respecto a las variantes descritas, se ha señalado que Chile comparte con España alguna de las mutaciones más comunes en el gen del RLDL, las cuales corresponden a p.Asp221Gly, p.Gln92Glu y p.Gly592Glu, y con Brasil la mutación p.Ser326Cys11. En cuanto a las mutaciones en el gen de la ApoB, se ha identificado en Chile la mutación p.Arg3527Gln, descrita igualmente en España, Brasil, México y otros países de América Latina11.
El objetivo de este estudio fue identificar la presencia de variantes genéticas asociadas a HF para el apoyo del diagnóstico en una población de niños y adolescentes portadores de hipercolesterolemia y/o antecedentes familiares de ECV precoz demostrada.
Materiales y Métodos
Población de estudio y criterios de inclusión
Estudio descriptivo de corte transversal de una población de niños y adolescentes con edades comprendidas entre 1 y 18 años, todos ellos casos índices independientes de familias no consanguíneas con sospecha diagnóstica de HF de la región del Biobío. El reclutamiento comprendió un período de dos años y se realizó: 1) mediante pesquisa selectiva en hijos de padres con ECV precoz demostrada y atendidos en el Laboratorio de Hemodinamia del Hospital Guillermo Grant Benavente. La ECV precoz demostrada se define como infarto agudo al miocardio y/o revascularización coronaria percutánea o quirúrgica en hombres menores de 55 años y mujeres menores de 60 años; y, 2) en niños y adolescentes referidos al Policlínico de Endocrinología por presentar dislipidemia.
El diagnóstico de sospecha de HF se basó en los siguientes criterios: la presencia de C-LDL ≥ 190 mg/dL o ≥ 150 mg/dL con antecedentes familiares de hipercolesterolemia y/o ECV precoz demostrada en un familiar de primer grado y/o presencia de xantomas tendinosos y cutáneos, xantelasma o arco corneal2.
Los padres o tutores de niños y adolescentes que aceptaron participar de este estudio firmaron un consentimiento informado y los mayores de 10 años firmaron el asentimiento. Este estudio respetó las normas éticas establecidas en la Declaración de Helsinki y cuenta con la aprobación del Comité Ético-Científico del Servicio de Salud Concepción (Proyecto VRID-UDEC N° 218.088.028-1.0; N° 219.072.041-M)
Análisis antropométricos
Los escolares participantes fueron medidos en posición vertical con estadiómetro de precisión 0,1 cm y pesados en balanza TANITA. Se calculó el índice de masa corporal (IMC) (kg/m2), su percentil de acuerdo con tablas del CDC13.
Análisis bioquímicos
En la población en estudio se colectó una muestra de sangre periférica después de 12 horas de ayuno, La concentración de colesterol total (CT), colesterol-HDL (C-HDL) y triglicéridos (TG) se determinaron en un analizador clínico automatizado (SIEMENS). Los niveles de C-LDL se calcularon mediante la fórmula de Friedewald si los triglicéridos eran inferiores a 350 mg/dL14.
Análisis molecular
El ADN genómico se obtuvo de la capa leucocitaria con columnas de purificación (QIAGEN) según las instrucciones del fabricante, el cual fue secuenciado para 5 genes relacionados a HF autosómica dominante (LDLR, APOB, PCSK9, APOE y STAP1) y 1 gen a HF autosómica recesiva (LDLR adaptor protein 1 (LDLRAP1)). Además, con el objetivo de realizar el diagnóstico diferencial de dos patologías que cursan con un fenotipo similar a HF, sitosterolemia y la enfermedad por depósitos de ésteres de colesterol, se secuenciaron los genes ATP-binding casette subfamily G member 5 y 8 (ABCG5, ABCG8) y lipasa ácida lisosomal (LIPA). Los templados se prepararon en el Sistema One Touch y secuenciados en la plataforma Ion Torrent PGM® (Thermofisher) en un 316v2 Ion Chip. Los análisis bioinformáticos se realizaron en CLC Genomics Workbench 9,5 (QIAGEN). Después de filtrar con poblaciones de control (NHLBI-ESP6500, AbraOM, ExAC y gnomAD), fueron consultadas todas las mutaciones potenciales para su descripción previa en ClinVar, Base de Datos de Mutaciones del Genoma Humano (HGMD), British Heart Foundation y bases de datos de Jojo Genetics.
Todas las muestras se analizaron mediante MLPA (Multiple Ligation-depend Probe Amplification) (MRC-Holland) para determinar la variación del número de copias15. La interpretación y clasificación de las variantes se estudiaron siguiendo las recomendaciones del consenso de la Asociación de Patología Molecular y del Colegio Médico Americano de Genética y Genoma (ACMG).
Análisis estadístico
Se utilizó el software SPSS versión 24. Las variables numéricas fueron representadas por la media, la desviación estándar y sus cuartiles. Las variables cualitativas fueron representadas por su frecuencia y porcentaje. Se utilizó la prueba t de Student para la comparación de medias de grupos independientes y la prueba U de Mann-Whitney para la comparación de medianas. Se verificó la normalidad de las variables mediante la prueba de Shapiro-Wilk. En todos los casos, se utilizó un nivel de significancia de 0,05.
Resultados
La población en estudio incluyó 55 casos índices de niños y adolescentes, 32 de sexo femenino y 23 de sexo masculino, de edad promedio de 9,5 ± 3,6 años, de los cuales 77% consultó por dislipidemia y 23% fue reclutado por contar con el antecedente de ECV precoz demostrada.
Se identificaron 17 portadores de mutaciones asociadas a HF (30,9%) y en 38 de ellos (69,1%) no se identificó ninguna mutación. Los promedios de edad, IMC y concentraciones plasmáticas de lípidos se presentan en la Tabla 1. La media de CT y C-LDL fueron significativamente superiores en el grupo portador de mutaciones asociadas a HF comparado con el grupo sin mutación (CT, 308 ± 73 mg/dL vs. 213 ± 34 mg/dL respectivamente; p = 0,0001; y C-LDL 238 ± 75 mg/dL vs. 137 ± 33 mg/dL, respectivamente; p < 0,0001). Ambos grupos no presentaron diferencias significativas en las medias de la edad ni en las medianas del IMC. Además, no se encontró diferencias estadísticamente significativas entre las medias de C-HDL (p = 0,5271) y entre las medianas de TG (p = 0,0718) de ambos grupos.
Tabla 1 Características clínicas y perfil lipídico de niños y adolescentes con y sin mutaciones asociadas a Hipercolesterolemia Familiar
| Con mutaciones (n = 17) | Sin mutaciones (n = 38) | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Variable | Media | DE | Mediana | Q1 | Q3 | Media | DE | Mediana | Q1 | Q3 | Valor p |
| TEdad (años) | 8,9 | 4,2 | 9,0 | 6,0 | 10,0 | 9,7 | 3,3 | 10,0 | 8,0 | 11,0 | 0,4197 |
| MWIMC (kg/m2) | 19,3 | 5,3 | 17,0 | 15,1 | 21,6 | 20,8 | 4,1 | 20,3 | 17,2 | 22,9 | 0,0778 |
| TCT (mg/dL) | 308 | 73 | 325 | 243 | 348 | 213 | 34 | 215 | 191 | 234 | 0,0001 |
| TLDL-C (mg/dL) | 238 | 75 | 260 | 174 | 279 | 137 | 33 | 135 | 120 | 158 | < 0,0001 |
| THDL-C (mg/dL) | 54 | 11 | 52 | 44 | 63 | 56 | 11 | 55 | 50 | 64 | 0,5271 |
| MWTG (mg/dL) | 80 | 35 | 74 | 55 | 99 | 104 | 48 | 90 | 66 | 122 | 0,0718 |
Tt-Student,
MWMann-Whitney,
DE: desviación estándar, Q1 cuartil 1 y Q3 cuartil 3.
Al considerar los análisis genéticos de los casos índices de niños y adolescentes con mutaciones asociadas a HF, se observó que 13 casos presentaron sólo una mutación en el gen del RLDL y 1 caso tenía una mutación en el gen de la APOE. Además, 2 casos son heterocigotos compuestos con las mutaciones p.Asp47Asn y duplicación de exones 13-15 del gen de RLDL (Exon13_15dup), y uno es heterocigoto doble, portador de una duplicación de exones 13-15 en el gen RLDL y la p.Ile268Met en el gen de la APOE (Figura 1A). Las variantes encontradas en el RLDL correspondieron a: 3 heterocigotos para la variante p.Ser326Cys, 3 heterocigotos y un homocigoto para la mutación p.Asp47Asn y 6 heterocigotos con duplicación de exones 13-15 (Figura 1B). Además, se identificó sólo un niño homocigoto para la mutación p.Glu204* en el gen de la APOE (Tabla 2).
Figura 1 Distribución porcentual de las mutaciones asociadas a Hipercolesterolemia Familiar identificadas en la población de niños y adolescentes. (A) Porcentaje de los genes con variantes genéticas y de los genotipos compuestos y dobles. (B) Mutaciones en el R-LDL.
Tabla 2 Identificación de mutaciones asociadas a Hipercolesterolemia Familiar, concentraciones plasmáticas de lípidos, presencia de xantomas y clasificación de su patogenicidad
| Mutaciones | n | Perfil lipídico (mg/dL) | Xan-tomas | Clasificación según base de datos | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CT | LDL-C | HDL-C | TG | Clin Var | gnomAD | ||||
| R-LDL | |||||||||
| p.Ser326Cys | 3 | 281 ± | 55 216 ± 44 | 56 ± 13 | 46 ± 8 | Patogénica | Patogénica | ||
| p.Asp47Asn | 4 | 252 ± | 54 174 ± 70 | 59 ± 11 | 95 ± 32 | Probablemente patogénica;VUS | Probablemente deletérea | ||
| Exon13 15dup | 6 | 304 ± | 70 240 ± 67 | 49 ± 8 | 80 ± 32 | Sí | Patogénica; VUS | Ausente | |
| Exon13_15dup + p.Asp47Asn | 2 | 422 ± | 6 353 ± 17 | 47 ± 11 | 109 ± 64 | Sí | |||
| ApoE | |||||||||
| p.Glu204* | 1 | 348 | 259 | 70 | 95 | Ausente | Ausente | ||
| Exon13 15dup (R-LDL) + | 1 | 370 | 307 | 52 | 55 | I268M: | I268M: | ||
| p.Ile268Met (apoE) | ausente | ausente | |||||||
VUS: variant uncertain significance.
El análisis del perfil lipídico de los niños y adolescentes portadores de mutaciones asociadas a HF, mostró que los heterocigotos compuestos y los dobles presentaron niveles de CT y C-LDL mayores a 300 mg/dL y los portadores de la duplicación de exones 13-15 presentaron concentraciones promedio de CT y C-LDL de 304 ± 70 mg/dL y 240 ± 67 mg/dL, respectivamente, valores que son superiores a los encontrados en las otras dos mutaciones del RLDL. Se observó la presencia de xantomas en un niño de genotipo heterocigoto para la duplicación de exones 13-15 con niveles de C-LDL de 240 mg/dL y en un heterocigoto compuesto que presentó concentración de C-LDL de 353 mg/dL. Respecto a la mutación p.Glu204* del gen de la ApoE de genotipo homocigoto, se destaca las altas concentraciones de CT y C-LDL, niveles que son superiores a 250 mg/dL (Tabla 2). Las bases de datos consultadas para las variantes genéticas del R-LDL, establecen alelos patogénicos y de patogenicidad incierta para las distintas mutaciones identificadas en este estudio. Para las variantes derivadas de la ApoE, aunque no se encuentran definidas en las bases de datos, son consideradas como variantes de patogenicidad incierta (Tabla 2).
En la Figura 2, se presenta la localización de las mutaciones en el RLDL, observándose que la p.Asp47Asn se encuentra en el dominio de unión a ligando, la p.Ser326Cys en el dominio tipo EGF-1 (Epidermal Growth Factor-1) y la duplicación de exones 13-15 afecta tanto a la región de EGF-1 como al dominio de O-glicosilación de la proteína. Con respecto a la APOE, la mutación p.Glu204* se encuentra en una región denominada intrínsecamente desordenada (IDR) del dominio bisagra y la variante p.Ile268Met en el extremo C-terminal de la proteína16.
Discusión
La HF es una enfermedad autosómica dominante que se relaciona con el desarrollo de aterosclerosis temprana desde la infancia. En Chile, la información acerca de variantes genéticas asociadas a HF es escasa11 y no existe un programa sistemático de pesquisa de esta enfermedad. En este estudio se identificó las variantes genéticas: duplicación exones 13-15, p.Ser326Cys y p.Asp47Asn en el gen del RLDL; p.Glu204* y p.Ile268Met en el gen de APOE, en población pediátrica con sospecha diagnóstica de HF, aportando a la caracterización genética de esta patología en nuestro país.
En la población estudiada de niños y adolescentes se identificó a 17 portadores de mutaciones asociadas a HF, los que mostraban niveles significativamente más altos de CT y C-LDL en comparación a aquellos que no presentaban mutación. La determinación de las concentraciones de CT y C-LDL están en corcordancia con estudios enfocados a detectar la HF en edad infanto-juvenil, los cuales señalan que estos parámetros lipídicos contribuyen a la detección de posibles portadores de HF17,18. Aunque el diagnóstico clínico actual se basa fundamentalmente en los niveles de C-LDL, el fenotipo de HF en población pediátrica diagnosticada genéticamente es diverso, con valores de C-LDL que fluctúan en un amplio rango17. Ante la sospecha de HF, se recomienda la pesquisa selectiva a partir de los 2 años de edad.
En relación a la frecuencia de las mutaciones descritas, se observó que el mayor porcentaje de ellas afectan al gen del RLDL, lo cual está en concordancia a lo publicado por diversos autores que señalan que más del 70% de los casos de HF se asocian a mutaciones en este gen4–6,19. En el presente estudio la duplicación de exones 13-15 resultó ser la alteración genética más frecuente identificada en la población. Si bien, esta mutación produce un reordenamiento génico mayor, existe poca información sobre el efecto de esta duplicación en la estructura y función del receptor. Sin embargo, se ha sugerido que esta variante genética produciría un codón de término anticipado de la transcripción, llevando a la expresión de un receptor carente del dominio de unión a membrana y citoplasmático y, por ende, no presente en la superficie celular20.
La segunda mutación más frecuente en este estudio fue la p.Asp47Asn (30,8%), variante descrita principalmente en población japonesa21 y que no ha sido reportada previamente en Latinoamérica11. Esta mutación se localiza en la primera región abundante en cisteína (LA1) en el dominio N-terminal involucrado en la unión al ligando del R-LDL (Figura 2a). Esta variante genética ha sido clasificada de patogenicidad incierta o probable-mente patogénica por distintas bases de datos. En este contexto, nuestro grupo de investigación analizó 3 casos índices pediátricos portadores de esta mutación, los cuales presentaron valores CT y C-LDL significativamente más altos que los niños y adolescentes sin mutación, sugiriendo que la variante p.Asp47Asn podría tener un efecto deletéreo sobre el metabolismo del colesterol (datos no publicados).
Respecto a la mutación patogénica p.Ser-326Cys, se encontró en un 23,1% de los casos estudiados, lo cual coincide con lo señalado en la literatura que posiciona a esta variante como una de las más prevalentes en Chile y en otros países latinoamericanos como Brasil11. Esta mutación se encuentra en el dominio altamente conservado EGF-1, el cual está implicado en el reciclaje del receptor hacia la membrana y en la liberación de receptor dentro del endosoma, por lo que defectos en este dominio tienen como consecuencia una mayor degradación del receptor y menor expresión del receptor en la superficie celular22,23.
Existe poca evidencia en la literatura que relacione mutaciones en el gen de APOE con la HF. En este estudio se identificaron 2 mutaciones en este gen: p.Glu204* y p.Ile268Met. En el homoci-goto para p.Glu 204* se encontró que los niveles de CT y C-LDL fueron considerablemente superiores a los valores de referencia. Si bien la ApoE es estructuralmente compleja, se ha demostrado que cambios en un solo aminoácido producen un efecto global que compromete toda la estructura de la proteína24. Para llevar a cabo su función, la ApoE debe ser estructuralmente flexible para que ocurran los cambios conformacionales requeridos para la unión de lípidos a sus dominios N y C-terminal16,24; por lo tanto, la mutación p.Glu204* y la variante p.Ile268Met podrían alterar la interacción de ApoE con lípidos.
La información de los fenotipos de los portadores heterocigotos compuestos (dos mutaciones asociadas a HF en el mismo gen) y heterocigotos dobles (dos variantes asociadas a HF en genes distintos) es escasa25. En este contexto, el Panel de Consenso de la Sociedad Europea de Aterosclerosis declaró que se encuentran menores niveles de C-LDL en los heterocigotos dobles en comparación con los portadores homocigotos de mutaciones en APOB, PCSK9 o RLDL26. Más aún, se ha reportado que los valores promedio de C-LDL en los heterocigotos dobles se encuentran entre los niveles observados en los portadores heterocigotos y heterocigotos compuestos, pudiéndose asociar con una forma grave de HF heterocigota25–27. Así, los heterocigotos dobles y compuestos descritos en este estudio tuvieron niveles de C-LDL muy superiores a los presentados por los portadores heterocigotos para la duplicación de exones 13-1525–27.
Este estudio constituye un aporte a la caracterización de los genes asociados a HF en una población de niños y adolescentes chilenos. Sin embargo, contempló un número acotado de participantes de la comuna de Concepción y representa la etapa inicial de la pesquisa de esta patología, cuya continuidad permitirá avanzar en el conocimiento de la realidad de la HF en nuestra población.
En conclusión, se logró identificar portadores de mutaciones asociadas a HF, describir las variantes genéticas y sus fenotipos a través de la pesquisa selectiva de niños y adolescentes con hipercolesterolemia y/o antecedentes familiares de ECV precoz demostrada en una población chilena.
