We are reporting a 37 year old male with severe oligozoospermia and a history of infertility for thirteen years and surgery for severe unilateral varicocele. The hormonal levels for FSH, LH and T, and karyotype were within the normal range. Multiplex PCR revealed the presence of a de novo microdeletion in the azoospermia factor (AZF) c region involving the deleted in azoospermia (DAZ) and basic protein Y-2 (BPY2) genes. These results suggest that severe oligozoospermia should be considered for the screening of microdeletions of Yq involving the AZFc region even in the presence of a varicocele (Rev Méd Chile 2000; 128: 778-82).
(key words: Chromosome deletion; Chromosomes, human; infertility, male; oligozoospermia).

Recibido el 29 de febrero, 2000. Aceptado en versión corregida el 23 de mayo, 2000.
Instituto de Investigaciones Materno Infantil, Facultad de Medicina, Universidad de
Chile. Hospital Clínico San Borja Arriarán. Santiago de Chile.
¹ Magister en Biología Molecular y Celular
² Tecnólogo Médico
³ Bioquímico
⁴Matrona

En los últimos años, se ha discutido ampliamente el posible riesgo genético transmitido a hijos producto de los procedimientos de reproducción asistida (PRA), y particularmente los riesgos biológicos asociados al procedimiento de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)¹. El ICSI constituye un procedimiento terapéutico orientado a individuos portadores de un factor masculino severo, tal como azoospermia (azo) u oligozoospermia (olz), los cuales presentan una tasa aumentada de anormalidades cromosómicas². Estas anomalías incluyen aberraciones constitucionales, así como también, deleciones moleculares o microdeleciones^1-4. En relación a las microdeleciones del cromosoma Y (MDY) se ha demostrado una alta prevalencia (15-55%) en pacientes que padecen de testiculopatías primarias severas idiopáticas, tales como: síndrome de sólo células de Sertoli, hipoespermatogénesis, arresto meiótico o de la espermiogénesis^3,4. Debido a que las MDY se pueden transmitir a la descendencia, existe consenso mundial que sugiere su detección, y posterior consejo genético, en pacientes que consultan por infertilidad y especialmente a pacientes interesados en PRA. Por lo tanto, la búsqueda de MDY se realiza en diversos centros de Reproducción Asistida en todo el mundo. Con el objeto de implementar la detección de MDY, iniciamos su búsqueda en pacientes con características compatibles de testiculopatías severas. En este trabajo se reporta el primer caso clínico de MDY en Chile. El paciente presenta una MDY que comprende a la región cromosómica AZFc e incluye a los genes DAZ y BPY2. Pensamos que este caso clínico puede ser instructivo a la comunidad científica en relación a los criterios médicos que deben ser considerados al indicar el estudio de MDY.

CASO CLÍNICO

Paciente de 37 años de edad, operario de empresa avícola. Inicia consulta en Policlínico de Infertilidad del Hospital Clínico San Borja Arriarán en octubre de 1994. Su cónyuge no presentaba antecedentes mórbidos relevantes. Este paciente era el menor de 15 hermanos de los cuales 4 fallecieron a temprana edad. De los 10 hermanos vivos (6 varones) todos eran fértiles y no existía historia de infertilidad en generaciones previas. El paciente presentaba en su historia clínica una tuberculosis pulmonar tratada y una cirugía por varicocele izquierdo en el año 1987. En el año 1999 el paciente fue seleccionado en nuestro centro para el presente estudio, el cual fue aprobado por el Comité Institucional de ética de nuestro Hospital. En examen físico se encuentra un individuo de 70 kg, talla 1,70 m, virilización normal, examen genital normal con tamaño testicular bilateral reducido (15 cc). En la muestra seminal se encontraba una concentración = 200.000 espermatozoides/ml con 70% de motilidad (56% grado III y IV). La morfología espermática (criterio de Kruger) fue 100% anormal con una preponderancia de células germinales inmaduras (50%), seguido de espermatozoides amorfos de cabeza (40%) y amorfos de cola (10%). La concentración plasmática, determinada por radioinmunoanáisis (RIA), de las hormonas FSH, LH y T se encontraron dentro del rango normal (2,6 mU/ml, 3,7 mUI/ml, y 5,2 ng/ml, respectivamente). El cariotipo del paciente se realizó en sangre periférica y no mostró evidencia ni signos de alteración cromosómica.

Determinación de microdeleciones del cromosoma Y: la extracción de DNA se realizó a partir de dos muestras de sangre periférica obtenidas en ocasiones distintas (Wizard Genomic Purification kit). Para realizar el estudio por PCR (Polymerase Chain Reaction) un total de 15 secuencias sitio marcadoras (Sequenced Tagged Sites, STS) (Figura 1) fueron seleccionadas desde un mapa STS⁵ (http//www.gdb.org). Los diferentes STS hibridizan a las tres regiones cromosómicas (AZFa, AZFb y AZFc), uno a la región centromérica y otro a la porción heterocromática del cromosoma Y. La amplificación múltiple de los STS consistió en la mezcla de dos a tres diferentes pares de partidores en un total de 6 reacciones independientes (Tabla 1). Como control negativo de amplificación se utilizó DNA femenino, y como control positivo el DNA de un individuo con fertilidad probada. Los resultados de PCR del paciente revelaron una ausencia de amplificación para los 7 pares de partidores presentes en AZFc, incluyendo a los genes DAZ y BPY2 (Figura 2). El padre de 81 años de edad presentó un cariotipo normal y no presentó ninguna alteración en su cromosoma Y.

FIGURA 1. Localización de los STS a lo largo del cromosoma Y. Se muestran los diferentes STS utilizados en la amplificación por PCR y su localización en las diferentes regiones del cromosoma Y: centromérica, AZFa, AZFb, AZFc, y Heterocromática (HC).

Figura 2. Detección de MDY mediante amplificación por PCR. Fotografía de los productos de PCR separados en un gel de agarosa al 2%. Observe la correspondiente ausencia de bandas de amplificación en los carriles P comparado con los C (MIX 1-3 y Mix 5-6). M: estándar marcador cada 50 pb, C: control fértil, P: paciente.

DISCUSIÓN

Las primeras observaciones que indicaron la participación de factores genéticos presentes en el cromosoma Y, relacionaron la azo de varones con cariotipo 46 XY, del (Y), a deleciones microscópicamente visibles en Yq1¹⁶. El anáisis testicular en estos varones, indica que son diferentes las fases del proceso espermatogénico que pueden estar interrumpidas, sugiriendo a múltiples genes presentes en Yq11, esto es, el locus AZF^3,4,7.

En la actualidad, la amplificación por PCR ha permitido aumentar el número de marcadores del cromosoma Y, y formar un mapa ordenado de secuencias STS, el cual abarca gran parte del cromosoma Y, incluyendo a las tres regiones AZF^4,5,7 (Figura 1). En AZFa se han identificado cuatro genes (DFRY, DBY, UTY y TB4Y), con homólogos sobre el cromosoma X y de expresión ubicua. La región AZFb contiene tres familias de genes testículo específicos (RBM, PRY, y TTY) con copias en el brazo corto del cromosoma Y. La región AZFc o región DAZ (Deleted in Azoospermia)³ contiene a los genes DAZ, CDY, BPY2 y PRY.

El presente estudio describe un caso clínico que ejemplifica el tipo de paciente que se debe considerar en un programa de búsqueda de MDY. La historia familiar de 10 hermanos fértiles y la ausencia de detección de MDY en el padre, sugiere que la deleción surgió de novo durante el ciclo que generó el espermatozoide fecundante.

En la selección de partidores se consideró aquellos vinculados de manera más directa a la fertilidad y cuya deleción puede ser fácilmente detectada por PCR, dado que son de simple copia o de múltiples copias, altamente repetitivas y confinadas a una pequeña región del cromosoma Y, como son los marcadores o genes presentes en la región AZFc⁷. Por otro lado, si bien el gen RBM1 (RNA Recognition Motif 1) está presente en múltiples copias a lo largo del cromosoma Y, su deleción ha sido demostrada en pacientes infértiles y se expresa sólo en las células germinales, por lo tanto, debe ser incluido en un programa de MDY⁸. Sin embargo, en el presente estudio no detectamos ausencia de RBM1 sino que una MDY en la región AZFc, lo cual es más frecuente^9,10. La MDY de la región AZFc se ha encontrado en el 61% de los casos con olz no obstructiva e hipoespermatogénesis severa, y sólo en el 5% cuando sólo comprende a los genes DAZ, sugiriendo que otros genes presentes en AZFc estarían dando cuenta de la fertilidad⁹. Concordante con lo anterior, en el presente trabajo se detectó deleción del gen BPY2, el cual es único de la región AZFc. Por lo tanto, a pesar que ninguna mutación puntual ha sido identificada, existe evidencia suficiente que indica que la infertilidad es causada por la pérdida de uno o más genes presentes en AZF^7,9.

Puesto que, las MDY pueden transmitirse a través de PRA y rara vez de manera espontánea, la transmisión de la infertilidad a la descendencia es evaluada cuidadosamente por las parejas^9-11. Se ha reportado que el 21% de las parejas aplaza el PRA, esperando mayor información respecto del riesgo genético¹¹.

Por otra parte, si bien existe evidencia que el varicocele puede producir una alteración del proceso espermatogénico, el beneficio de la corrección quirúrgica es controversial¹². La historia clínica de nuestro paciente no indica mejoría en su anáisis seminal posterior a la varicocelectomía. Por lo tanto, el tratamiento quirúrgico del paciente con varicocele debería ser evaluado considerando la posibilidad de otras alteraciones, como son las MDY.

En conclusión, el presente caso clínico demuestra la ausencia de los genes DAZ y BPY2 en un individuo con falla espermatogénica primaria. La historia de varicocele no excluye su estudio, sino más bien, puede indicarlo en presencia de una alteración severa del recuento espermático. Debido a que las MDY se pueden transmitir a la descendencia, se requiere su detección en pacientes sometidos a PRA.

Correspondencia a: Andrea Castro, IDIMI, Universidad de Chile. Casilla 226-3, Santiago, Chile.
E mail: acastro@canela.med.uchile.cl

REFERENCIAS

1. CHANDLEY AC, HARGREAVE TB. Genetic anomaly and ICSI. Hum Rep 1996; 11: 930-2.

2. MESCHEDE D, HORST J. Sex chromosomal anomalies in pregnancies conceived through ICSI: a case for genetic counselling. Hum Rep 1997; 12: 1125-7.

3. REIJO R, LEE T, SALO P, ALAGAPPAN R, ET AL. Diverse spermatogenics defects in humans caused by Y chromosome deletions encompassing a novel RNA-binding protein gene. Nature Genet 1998; 10: 383-93.

4. VOGT PH, EDELMAN A, HABERMANN B, ET AL. Y chromosome and male fertility genes. In: Kempers RD, Cohen J, Haney AF, Younger JB (eds). Fertility and Reproductive Medicine. Elsevier Science BV, 1998; 735-49.

5. WOLLRATH D, FOOTE S, HILTON A, ET AL. The human Y chromosome. A 43-interval map based on naturally ocurring deletions. Science 1992; 258: 52-9.

6. TIEPOLO L, ZUFFARDI O. Localization of factors controling spermatogenesis in the non-fluorescent portion of the human Y chromosome. Hum Genet 1976; 34: 119-24.

7. KOSTINER DN, TUREK PJ, REIJO RA. Male infertility: analysis of the markers and genes on the human Y chromosome. Hum Rep 1998; 13: 3032-8.

8. MA K, INGLIS JD, SHASRKEY, ET AL. A Y-chromosome gene family with RNA-binding protein homology: candidates for the azo factor AZF controlling human spermatogenesis. Cell 1993; 75: 1287-95.

9. FERLIN A, MORO E, GAROLLA A, FORESTA C. Human male infertility and chromosome deletions: role of the AZF-candidate genes DAZ, RBM and DFFRY. Hum Reprod 1999; 14: 1710-6.

10. CHANG PL, SAUER MV, BROWN S. Y chromosome microdeletion in a father and his four infertile sons. Hum Rep 1999; 14: 2689-94.

11. RUCKER GB, MILENIK A, KING P, ET AL. Preoperative screening for genetic abnormalities in men with nonobstructive azoospermia before testicular sperm extraction. J Urol 1998; 160: 2068-71.

12. KRETSER DM, BAKER HWG. Infertility in men: Recent advances and continuing controversies. JCEM 1999; 84: 3443-50.