Inoculación de Trichoderma longibrachiatum en algodón transgénico: Cambios en compuestos fenólicos y enzimas de estrés oxidativo

 

Inoculation of Trichoderma longibrachiatum in transgenic cotton: change in the phenolics compounds and enzymes of oxidative stress

 

Tania Elisa González-Soto¹, Lizbeth Moreno-Ramírez¹, Rosalba Troncoso-Rojas², Daniel González-Mendoza^1*, Alberto Sánchez-Estrada², Onecimo Grimaldo Juárez¹, Olivia Tzinzun-Camacho¹, Carlos Ceceña-Durán¹

¹ Instituto de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma de Baja California (ICA-UABC). Ejido Nuevo León, Baja California, México.
² Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C., Dirección de Tecnología de Alimentos de Origen Vegetal. Hermosillo, Sonora, México.* Autor por correspondencia: danielg@uabc.edu.mx

RESUMEN

El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad de las enzimas fenilalanina amonio-liasa (PAL), peroxidasa (POX) y la producción de compuestos fenólicos y flavonoides en plantas de algodón transgénico en respuesta a la inoculación con Trichoderma longibrachiatum (ICA-4). Noventa días después de la inoculación con T. longibrachiatum, hojas de las plantas de algodón fueron colectadas y las enzimas PAL, POX y los compuestos fenólicos fueron determinados. Los resultados mostraron que la inoculación aumentó el contenido de compuestos fenólicos y flavonoides en 18% y 45%, respectivamente; comparadas con plantas no inoculadas. La actividad de las enzimas peroxidasa (4,88 Ux10^-5/mg de proteína), y fenilalanina amonia-liasa (0,0176 U/mg de proteína) mostraron diferencias significativas en comparación con la actividad enzimática de plantas no inoculadas (3,48x10^-5 U/mg proteína para POX y 0,01 U/mg de proteína para PAL). Estos resultados sugieren la inducción de una respuesta de resistencia sistémica inducida por la inoculación de las semillas con la cepa Trichoderma ICA-4.

Palabras clave: ruta fenilpropanoide, biocontrol, Trichoderma, enzimas de estrés oxidativo.

ABSTRACT

The objective of the present study was to evaluate the activity of phenylalanine ammonia-lyase (PAL), peroxidase (POX) and the production of phenolic compounds and flavonoids in transgenic cotton plants in response to inoculation with Trichoderma longibrachiatum (ICA-4). Ninety days after inoculation with T. longibrachiatum, leaves of the cotton plants were collected and the enzymes PAL, POX and phenolic compounds were determined. The results showed that inoculation increased the content of phenolic compounds and flavonoids by 18% and 45%, respectively, compared to non-inoculatedplants. The activity of the enzymes peroxidase (4.88 Ux10-5/mg protein), and phenylalanine ammonia-lyase (0.0176 U/mg protein) showed significant differences compared to the enzymatic activity of uninoculated plants (3, 48x10-5 U/mg proteinfor POX and 0.01 U/mg proteinfor PAL). These results suggest the induction of a systemic resistance response induced by seed inoculation with the Trichoderma ICA-4 strain.

Key words: route phenylpropanoid, biocontrol, Trichoderma, enzymes of oxidative stress.

Introducción

El algodón (Gossypium hirsutum L.) es el cultivo de mayor importancia económica utilizado en la industria textil y constituye más de la mitad del consumo de fibra textil en todo el mundo (Karademir et al., 2011). El algodón Bollgard (BG) contiene la toxina Cry 1Ac, la que actúa reduciendo la incidencia de gusano rosado (Pectinophora gossypiella) y el gusano bellotero (Heliothis Virescens), por lo que la siembra de este cultivar de algodón ha aumentado en el valle de Mexicali en los últimos años reduciendo la aplicación de insecticidas y proporcionado mayores rendimientos (Terán-Vargas et al., 2005; Vargas-Bejarano et al., 2012). Sin embargo, en el valle de Mexicali, el crecimiento de algodón puede ser afectado severamente por varios agentes de estrés bióticos (por ejemplo, hongos, virus e insectos). Dentro de estos factores la presencia de la marchitez del tallo, causada por hongos, es una enfermedad generalizada en el cultivo que se produce durante la etapa inicial de crecimiento cuando prevalecen condiciones de alta humedad (Rajendran y Samiyappan, 2008). Estudios recientes muestran que las plantas de algodón transgénicas que contienen la toxina Cry 1Ac, han mostrado ser más susceptibles a las enfermedades fúngicas en comparación con las líneas convencionales (Li et al., 2009). Esto, debido a que los exudados de las raíces de algodón transgénico actúan estimulando la germinación de esporas y el crecimiento micelial de Fusarium oxysporum (Li et al., 2013). En este sentido, las estrategias para el manejo del marchitamiento por Fusarium incluyen el uso de cultivares y prácticas culturales. Sin embargo, la capacidad de sobrevivir de F. oxysporum en el suelo durante años o décadas hacen difícil controlar este microorganismo con el uso de cultivares o prácticas culturales (Zahoor et al., 2012).

Por lo tanto, es necesaria la búsqueda de alternativas biotecnológicas que permitan ayudar a controlar la marchitez causada por Fusarium. En este contexto, la expresión de resistencia sistémica inducida en plantas por la acción de microorganismos benéficos como bacterias y hongos, podrían ser una alternativa factible en el control de enfermedades vasculares en algodón. Estudios recientes reportan la eficacia de algunas especies del género Trichoderma como inductores de resistencia sistémica contra fitopatógenos (Chowdappa et al., 2013). Trichoderma spp., es un hongo antagonista con acción contra varios patógenos del suelo, tales como Rhizoctonia, Sclerotium, Fusarium y Pythium. Se asocia principalmente con la producción de las proteínas relacionadas con la patogénesis, como β -1,3-glucanasa, compuestos fenilpropanoides y otros mecanismos relacionados con la defensa que se observan en plantas previamente colonizadas por diferentes cepas de Trichoderma (Harman et al., 2004; Nawrocka y Malolepsza, 2013). No obstante, el efecto de T. longibrachiatum en la producción de compuestos fenilpropanoides y enzimas oxidativas en plántulas de algodón transgénico ha sido poco estudiado. De esta forma, el objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la aplicación de Trichoderma longibrachiatum cepa ICA-4 en el contenido de compuestos fenólicos (fenoles y flavonoides totales), así como en la expresión de las enzimas fenilalanina amonio-defensa liasa y peroxidasa (enzimas oxidativas) en plantas de algodón transgénicas.

Materiales y Métodos

Los estudios se hicieron en el sitio experimental del Instituto de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma de Baja California, Baja California, México (32°28'5.63" N, 115°12'11.94" O), en el período de marzo a septiembre de 2014.

Preparación del inóculo de T. longibrachiatum

El inoculante se preparó con la inoculación de cinco mililitros de T. longibrachiatum ICA-4 cepa (GenBank: KJ190162) a una concentración de 1x10⁸ esporas ml^-1 en bolsas del arroz estéril (150 g) incubando por 15 días, período después del que se secó en un horno a 40 °C, durante 24 h. Las esporas se extrajeron y se mezclaron con talco (malla 350 con 95% de blancura) y 1% de sacarosa, hasta obtener una concentración de 1x10⁶ esporas g^-1.

Inoculación de semillas de algodón y experimento de campo

Usando una suspensión del inoculante a una concentración de 1x10⁶ esporas g^-1, se inoculó las semillas del algodón transgénico Bollgard®. El experimento consistió en los siguientes tratamientos: a) semillas sin inocular y b) semillas inoculadas con T. longibrachiatum ICA-4. Cada tratamiento consistió en bloques completamente aleatorizados. Cada unidad experimental fue de 15 x 25 m, con una distancia entre surcos de 1,5 m. La fertilización se hizo de acuerdo a lo sugerido por López-Martínez et al. (2014), para el cultivo de algodón Bollgard®. La emergencia de las plántulas se registró 7 días después de la siembra (DDS). De cada parcela experimental 90 DDS, se colectó de manera aleatoria 50 plántulas inoculadas y 50 no inoculadas, de cada parcela para la determinación de la enzima fenilalanina amonio-liasa (PAL), peroxidasa (POX) y compuestos fenólicos totales.

Determinación de los compuestos fenólicos en plantas hojas

El contenido de compuestos fenólicos totales se determinó usando el método de Folin-Ciocalteu reportado por Núñez-Ramírez et al. (2011) con modificaciones. Para ello, 50 g (hojas de algodón) de cada tratamiento se expusieron a metanol 80% (1/10), se sonicó en un baño ultrasónico (VWR^(R) 50 Hz) durante 3 min y se centrifugó a 4.000 rpm durante 5 min a 4 °C. Posteriormente, 1 mL de la solución del extracto se mezcló con 5 mL de Folin Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) y 4 mL de Na₂ CO₃ (1 M). La mezcla se agitó en vórtex y se incubó a temperatura ambiente en oscuridad durante 30 min. Finalizado el periodo de incubación se midió la absorbancia a 765 nm usando un espectrofotómetro (GENESYS ™ 20). La concentración total de compuestos fenólicos se calculó utilizando una curva estándar de ácido gálico. Los valores totales de fenol se expresaron como mg equivalentes de ácido gálico (GAE) por 100 g de peso fresco (PF).

Determinación de flavonoides en plantas de hojas

El contenido de flavonoides presentes en las hojas de algodón se determinó cuantitativamente mediante el ensayo colorimétrico de cloruro de aluminio de acuerdo a la metodología propuesta por Chang et al. (2002) usando quercetina como estándar (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). La absorbancia de la mezcla de reacción se midió a 415 nm en un espectrofotómetro (GENESYS™ 20). El contenido de flavonoides totales se expresó como equivalentes de quercetina en mg g^-1 peso fresco (QE mg g^-1 PF).

Determinación de la actividad peroxidasa (POX)

Para la extracción de la enzima, 200 mg de hojas por triplicado, se homogenizaron usando un mortero previamente enfriado en 100 mM de tampón Tris-HCl pH 7. Posteriormente, el homogenizado se colectó y centrifugó a 10.000 rpm durante 15 min a 4°. El sobrenadante se utilizó como extracto enzimático crudo. La actividad de la peroxidasa se evalúo de acuerdo a Koksal y Gulcin (2008). Para tal fin se preparó una mezcla de reacción de 3 mL que consistió de una solución con 50 μL del extracto de enzima, 250 μL de guaiacol al 0,25% en 100 mM Tris-HCl pH 7,0 tampón y 0,125% de H₂O₂. La actividad de la peroxidasa en los extractos se midió como un aumento en la absorbancia a 470 y se calculó usando el coeficiente de extinción molar de guayacol (5,570 x 10-6 mol mL^-1). Una unidad de actividad (UPOX) se definió como el cambio en una unidad de absorbancia por min. La actividad específica se expresó en unidades de actividad por mg de proteína (UPOX/mg proteína).

Determinación de la actividad de la fenilalanina amonio-liasa (PAL)

La actividad PAL se determinó mediante la evaluación de la producción de ácido cinámico-t a 290 nm de acuerdo a Rodríguez et al. (2006), usando 400 mg de hojas que se homogeneizaron en 5 mL de 100 mM de tampón de borato de sodio (pH 8,5). El homogeneizado se centrifugó a 12.000 rpm durante 15 min a 4 °C y el sobrenadante fue utilizado para ensayos enzimáticos. La actividad PAL se evaluó en una solución de reacción (1 mL) compuesta de 50 mM de tampón de borato de sodio (pH 8,5), 20 mM de L-fenilalanina y el extracto de enzima. La muestra se incubó a 35 °C y la reacción se detuvo después de 1 h por adición de 0,5 mL de ácido tricloroacético al 10%. Por último, la absorbancia a A290 nm se midió después de 1 h. Una unidad de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima que causa la disminución de la absorbancia de 0,01 por min. La actividad específica de PAL fue expresada en unidades de actividad por mg de proteína (UPAL/mg proteína).

Determinación de proteínas

La concentración de proteína se cuantificó por el método de Bradford (1976), usando albúmina sérica bovina como estándar.

Análisis estadístico

El análisis de los datos obtenidos se realizó utilizando la prueba t de Student con un nivel de significación del contraste:α ≤ 0,05. Se utilizó el paquete estadístico Statistica AX versión 6.1.

Resultados y Discusión

La protección química es una de las primeras respuestas estructurales de las plantas frente al ataque de patógenos o frente algún tipo de estrés, en donde los compuestos fenólicos juegan un papel importante, ya que estos desempeñan importantes funciones de protección contra patógenos (Bhattacharya et al., 2010). Se observó que el contenido de compuestos fenólicos del tejido foliar de plantas tratadas previamente con T. longibrachiatum cepa ICA-4, presentaron un incremento significativo del 18% de fenoles totales y un 45% en los niveles de flavonoides con respecto a las plantas no tratadas (Tabla 1). El incremento de los compuestos fenólicos en el tejido foliar de las plantas de algodón inoculadas con T. longibrachiatum cepa ICA-4, indica la expresión de una resistencia sistémica inducida (IRS). Similares resultados han sido previamente reportados por Shoresh et al. (2010), quienes indican la importancia del uso cepas de Trichoderma como inductores de resistencia sistémica en un amplio número de plantas de interés agrícola. En el caso de T. longibrachiatum, la información es limitada, ya que esta se ha empleado principalmente como inoculante en mejoras del proceso de fermentación de silos de alfalfa (Nadeau et al., 2000). Aunque trabajos recientes muestran la presencia de un efecto antagónico de T. longibrachiatum en condiciones in vitro sobre algunos aislados de Fusarium verticillioides (Nirenberg) procedentes de raíces de maíz (Sobowale et al., 2010). La inoculación del T. longibrachiatum en algodón generó un incremento significativo en el tejido foliar la actividad de la enzima POX de 4,88x10^-5 (U/mg proteína), con respecto a las plantas no inoculadas (3,48x10^-5 U/ mg proteína). De la misma manera se observó que la actividad de la enzima PAL en el tejido foliar de plantas de algodón previamente inoculadas con T. longibrachiatum presentaron una mayor actividad de PAL mostrando valores de 0,0176 (U/ mg proteína), que fue significativamente mayor cuando se compara con respecto a las plantas testigo (Tabla 2). El incremento de compuestos fenólicos en el tejido foliar de plantas de algodón tratadas con T. longibrachiatum cepa ICA-4, podría tener un efecto bioprotector contra fitopatógenos del suelo. Rodríguez-Maturino et al. (2015), sugieren que el incremento de compuestos fenólicos podría interactuar con la pared celular de los hongos fitopatógenos inhibiendo algunas enzimas fúngicas, afectando el crecimiento del micelio y disminuyendo la severidad de la enfermedad. El incremento de la enzima POX en el tejido foliar de plantas inoculadas con T. longibrachiatum cepa ICA-4, podría favorecer la resistencia mecánica de las paredes celulares, como resultado de una mayor síntesis de lignina, limitando el avance del patógeno. Lo anterior ha sido reportado previamente en plantas de palma datilera (Phoenix dactilifera) que al ser inoculadas con T. harzianum, las que presentaron mayor tolerancia al ataque de patógenos (Khaled et al., 2008). Asimismo, T. longibrachiatum podría activar la presencia de PAL en las plantas, como resultado de la inducción de enzimas como celulasas y otras ligadas al mecanismo de estrés oxidativo que activarían diferentes rutas metabólicas, como la vía de síntesis del ácido salicílico, jasmónico y acumulación de etileno, que estimularían el metabolismo de los fenilpropanoides, reduciendo el daño por patógenos (Martinez et al., 2001; Tucci et al., 2013). Aun cuando la inducción de enzimas relacionadas con mecanismos de defensa de las plantas, como POX y PAL, ha sido previamente reportado, principalmente al emplear cepas de T. harzianum o T. viride (Singh y Singh, 2014). Los estudios de T. longibrachiatum en la activación de enzimas de defensa y antioxidantes en plantas de interés agrícola en México, son escasos. La cepa nativa de T. longibrachiatum estimuló la inducción de POX y PAL, en plantas de algodón transgénico en condiciones de campo, lo que coincide con reportes previos, Esta cepa ha mostrado efecto en el desarrollo vegetativo en plantas de algodón (Vargas-Bejarano et al., 2012), quien muestra el potencial de esta cepa de ser empleada como una herramienta biotecnológica alterna al uso de agroquímicos en el cultivo del algodón en las condiciones semiáridas del valle de Mexicali, Baja California.

Tabla 1. Contenido de compuestos fenólicos y flavonoides en plantas de algodón inoculadas con T. longibrachiatum, a los 90 días después de la siembra.

Valores con letras diferentes en la misma columna son significativamente diferentes (α ≤ 0,05) de acuerdo a la prueba de t de Student. Los resultados son medias ± D.S. de 3 réplicas para cada tratamiento.

Tabla 2. Actividad enzimática de peroxidasa (POX) y fenilalanina amonio-liasa (PAL) en plantas de algodón inoculadas con T. longibrachiatum, a los 90 días después de la siembra.

Valores con letras diferentes en la misma columna son significativamente diferentes (α ≤ 0,05) de acuerdo a la prueba de t de Student. Los resultados son medias ± D.S. de 3 réplicas para cada tratamiento.

Conclusiones

La inoculación de T. longibrachiatum cepa ICA-4 en algodón transgénico induce la producción de compuestos fenólicos en plantas de algodón transgénico, así como una mayor actividad específica de enzimas de relacionadas con la defensa de las plantas a patógenos, tal como PAL y POX, en condiciones de campo.

Son necesarios nuevos estudios para evaluar el impacto de T. longibrechiatum cepa ICA-4 en la inducción de genes de la ruta fenilpropanoide y enzimas relacionadas con la inducción de resistencia sistémica.

Agradecimientos

Se agradece a la Universidad Autónoma de Baja California, por el apoyo otorgado por medio de la 18^a Convocatoria Interna de Proyectos de Investigación.

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Fecha de Recepción: 25 Septiembre, 2016. Fecha de Aceptación: 2 Febrero, 2017.