伊班膦酸钠干预骨关节炎模型大鼠丝裂原活化蛋白激酶信号通路的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1911

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (2): 181-186.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1911

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伊班膦酸钠干预骨关节炎模型大鼠丝裂原活化蛋白激酶信号通路的变化

刘静^1，2，孙智路³，周君^1，2，廖源^1，2，孙光华^1，2，伍琦^1，2，周桂娟^1，2，钟培瑞^1，2，成果^1，2，肖豪^1，2，李兰^1，2，廖瑛^1，2

南华大学附属第一医院，¹康复医学科，²康复医学实验室，³急诊科，湖南省衡阳市 421001

收稿日期:2019-04-25 修回日期:2019-05-06 接受日期:2019-06-12 出版日期:2020-01-18 发布日期:2019-12-25
通讯作者: 廖瑛，主任医师，南华大学附属第一医院，湖南省衡阳市 421001
作者简介:刘静，女，1986年生，湖南省衡阳市人，汉族，2011年安徽医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事神经系统及退行性骨关节病康复治疗的基础与临床研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81674045)；湖南省卫健委课题(B2019128)

Effect of ibandronate on mitogen-activated protein kinase signaling pathway in rat models of osteoarthritis

Liu Jing^{1, 2}, Sun Zhilu³, Zhou Jun^{1, 2}, Liao Yuan^1,
2, Sun Guanghua^{1, 2}, Wu Qi^{1, 2}, Zhou Guijuan^1,
2, Zhong Peirui^{1, 2}, Cheng Guo^{1, 2}, Xiao Hao^1,
2, Li Lan^{1, 2}, Liao Ying^{1, 2}

¹Department of Rehabilitation, ²Laboratory of Rehabilitation Medicine, ³Department of Emergency, the First Affiliated Hospital of University of South China, Hengyang 421001, Hunan Province, China

Received:2019-04-25 Revised:2019-05-06 Accepted:2019-06-12 Online:2020-01-18 Published:2019-12-25
Contact: Liao Ying, Chief physician, Department of Rehabilitation, Laboratory of Rehabilitation Medicine, the First Affiliated Hospital of University of South China, Hengyang 421001, Hunan Province, China
About author:Liu Jing, Master, Attending physician, Department of Rehabilitation, Laboratory of Rehabilitation Medicine, the First Affiliated Hospital of University of South China, Hengyang 421001, Hunan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81674045; the Project of Health and Family Planning Commission of Hunan Province, No. B2019128

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

伊班膦酸钠：是最新一代双膦酸盐化合物，对骨骼中的无机盐的具有高度亲和性，能特异性作用于骨组织，通过抑制破骨细胞的活性发挥作用，主要用于治疗骨质疏松、高钙血症。

丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信号通路：是一组能被不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者。

背景：丝裂原活化蛋白激酶信号通路参与成骨细胞与破骨细胞的分化，与软骨下骨重建过程密切相关，在骨关节炎的发生发展中起重要作用。双膦酸盐作为骨吸收抑制剂，主要用于骨质疏松的治疗。

目的：探讨伊班膦酸钠对大鼠骨关节炎的治疗效果，以及其对丝裂原活化蛋白激酶信号通路的影响。

方法：实验方案经南华大学附属第一医院动物实验伦理委员会批准。30只雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、治疗组。模型组和治疗组行双侧去卵巢及前交叉韧带切断术，假手术组大鼠只切除卵巢周围与卵巢大小相仿的脂肪组织，切开双侧膝关节腔，但不切断前交叉韧带。术后1周，治疗组予以腹腔注射伊班膦酸钠10 μg/kg，模型组予以腹腔注射等量生理盐水，假手术组不作干预。12周以后，处死实验动物，进行关节软骨的组织形态学观察及Mankin评分，软骨下骨的Micro-CT扫描及骨组织显微结构定量分析，检测丝裂原活化蛋白激酶信号通路中细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1)和c-Jun氨基酸末端激酶(JNK)的mRNA表达量及蛋白表达水平。

结果与结论：①模型组软骨结构明显破坏，Mankin评分较假手术组明显增高，而治疗组的Mankin评分较模型组显著降低(P < 0.01)；②与假手术组比较，模型组中的骨密度、骨体积分数、骨小梁数量降低，骨小梁分离度显著增高(P < 0.01)；与模型组相比，治疗组的骨密度、骨体积分数、骨小梁数量增加，骨小梁分离度明显下降(P < 0.01)；③模型组中的ERK1、JNK mRNA表达和蛋白表达较假手术组明显增加(P < 0.05，P < 0.01)；与模型组相比，治疗组中的ERK1、JNK mRNA表达和蛋白表达显著降低(P < 0.05)；④结果说明，伊班膦酸钠可能通过抑制ERK1、JNK 丝裂原活化蛋白激酶信号通路的表达改善膝骨关节炎大鼠的软骨下骨的微结构，抑制软骨的退变。

ORCID: 0000-0003-3433-364X(刘静)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨关节炎, 伊班膦酸钠, 软骨, 软骨下骨, 丝裂原活化蛋白激酶, MAPKs通路

Abstract:

BACKGROUND: Mitogen-activated protein kinase signaling pathway participates in the differentiation of osteoblasts and osteoclasts, closely related to subchondral bone reconstruction and play a key role in the occurrence and development of osteoarthritis. Bisphosphonates as bone resorption inhibitor is used to treat osteoporosis.

OBJECTIVE: To observe the effect of sodium ibandronate on the knee osteoarthritis in rats, and changes of mitogen-activated protein kinase signaling pathway.

METHODS: The study was approved by the Laboratory Animal Ethical Committee of the First Affiliated Hospital of South China University. Thirty female Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham, model, and treatment groups. The rats in the latter two groups underwent ovariectomy bilaterally, and anterior cruciate ligament resection, and rats in the sham group received the fatty tissue surrounding the ovaries removed only. After 1 week of surgery, the rats in the treatment group were given intraperitoneal injection of 10 μg/kg sodium ibandronate, rats in the model group were injected with normal saline, and the sham group received no intervention. Twelve weeks late, the rats were killed to perform histological examination of cartticular cartilage and Mankin scores were detected. Micro-CT of subchondral bone and quantitative analysis of the bone microstructure were conducted. The protein and mRNA expression levels of extracellular signal regulated protein kinase and c-Jun N-terminal kinase in mitogen-activated protein kinase signaling pathway were measured.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The cartilage structure in the model group was significantly damaged, the Mankin score was significantly higher than that in the sham group, and the Mankin score in the treatment group was significantly lower than that in the model group (P < 0.01). (2) The bone mineral density, trabecular bone volume ratio, trabecular number in the model group were significantly lower than those in the sham group (P < 0.01), and trabecular separation was higher than that in the sham group (P < 0.01). Compared with the model group, the treatment group had higher bone mineral density, trabecular bone volume ratio, trabecular number, and lower trabecular separation (P < 0.01). (3) The mRNA and protein expression levels of extracellular signal regulated protein kinase and c-Jun N-terminal kinase in the model group were significantly higher than those in the sham group (P < 0.05, P < 0.01), and the levels in the treatment group were significantly lower than those in the model group (P < 0.05). (4) To conclude, sodium ibandronate may inhibit subchondral bone loss and articular cartilage degeneration in rat models of osteoarthritis by inhibiting extracellular signal regulated protein kinase and c-Jun N-terminal kinase in mitogen-activated protein kinase signaling pathway.

Key words: osteoarthritis, sodium ibandronate, cartilage, subchondral bone, mitogen-activated protein kinases, MAPKs signaling pathway

中图分类号:

R446

R496

R318

刘静, 孙智路, 周君, 廖源, 孙光华, 伍琦, 周桂娟, 钟培瑞, 成果, 肖豪, 李兰, 廖瑛. 伊班膦酸钠干预骨关节炎模型大鼠丝裂原活化蛋白激酶信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(2): 181-186.

Liu Jing, Sun Zhilu, Zhou Jun, Liao Yuan, Sun Guanghua, Wu Qi, Zhou Guijuan, Zhong Peirui, Cheng Guo, Xiao Hao, Li Lan, Liao Ying. Effect of ibandronate on mitogen-activated protein kinase signaling pathway in rat models of osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(2): 181-186.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 30只实验大鼠实验过程中无死亡，全部进入结果分析。 2.2 各组实验大鼠关节软骨的组织形态学观察及Mankin评分比较关节软骨光镜观察：模型组软骨表面缺损，软骨细胞排列紊乱，可见肥大增生，潮线紊乱，番红染色不均匀。治疗组显示软骨表面轻微粗糙，软骨4层结构尚可辨，软骨细胞排列有一定规律，基质增加。模型组Mankin评分较假手术组明显增高，而治疗组的Mankin评分较模型组显著降低，差异均有显著性意义(P < 0.01)，见图1，2。

2.3 各组实验大鼠软骨下骨Micro-CT及显微结构分析比较各组实验大鼠骨组织Micro-CT成像结果如图3所示。

模型组软骨下骨骨小梁稀疏增宽，排列紊乱不均匀，关节边缘可见断裂及致密的骨赘形成，治疗组软骨下骨骨小梁形状规则，网格结构明显。进一步软骨下骨显微结构分析显示：与假手术组比较，模型组中的骨密度、骨体积分数、骨小梁数量显著降低，差异有显著性意义(P < 0.01)，而骨小梁分离度显著增高(P < 0.01)。治疗组的骨密度、骨体积分数、骨小梁数量较模型组显著增加(P < 0.01)，骨小梁分离度明显下降(P < 0.01)，各组间骨小梁厚度差异无显著性意义。详见图4，5。

2.4 各组实验大鼠软骨组织ERK1、JNK mRNA的相对表达量检测 PCR结果显示：与假手术组相比，模型组中的ERK1、JNK mRNA的相对表达量明显升高(P < 0.05，P < 0.01)；与模型组相比，治疗组中的ERK1、JNK mRNA的相对表达量明显降低(P < 0.05)，见表2。

2.5 各组实验大鼠软骨组织ERK1、JNK的蛋白表达水平检测 Western blot结果显示：与假手术组相比，模型组中的ERK1、JNK 蛋白表达水平增高(P < 0.05)；与模型组相比，治疗组中的ERK1、JNK 蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)，见图6。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点实验于2017年7至12月在南华大学实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 3月龄未育雌性SD大鼠30只，由南华大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(湘)2015-0001。实验过程中大鼠处置严格遵守动物福利与伦理准则和指南的相关规定。

1.3.2 药物、实验试剂及仪器伊班膦酸钠注射液(国药准字H20010432，河北医科大学生物医学工程中心)；AceQTMqPCR SYBR^® Green Master Mix(南京，Vazyme公司，批号：7E2B2C8)；Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H)试剂(TAKARA公司，日本，批号：7E203E8)；奥林巴斯光学显微镜(日本，奥林巴斯公司)；FTC2000实时荧光定量基因扩增仪(加拿大枫岭公司)；MSE Micro-Centaur Centrifuge微型台式离心机(日本，Sanyo公司)；Micro-CT(中科恺盛医疗科技有限公司)；兔抗大鼠β-actin单克隆抗体(BA1055博士德)；羊抗大鼠IgG/HPR抗体(AB-M-M001杭州贤至)；兔抗大鼠p-ERK1、p-JNK抗体(美国Cell Signaling Technology公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组与造模实验动物饲养于南华大学动物实验中心，清洁级环境。适应性饲养1周后，按随机数字表法把30只实验大鼠随机均分为假手术组，模型组(卵巢切除+前交叉韧带切断组)，治疗组(卵巢切除+前交叉韧带切断+伊班膦酸钠组)。参照文献[7]模型组、治疗组大鼠施行双侧卵巢切除及前交叉韧带切断，假手术组大鼠只切除卵巢周围与卵巢大小相仿的脂肪组织，切开双侧膝关节腔，但不切断前交叉韧带。术后允许大鼠自由活动。饲养环境：温度22-26 ℃、湿度50%-60%、12 h间隔照明。

1.4.2 各组干预方法术后1周，治疗组予以伊班膦酸钠 10 μg/kg，腹腔注射，1次/周，共12周；模型组予以等剂量生理盐水，腹腔注射，1次/周，共12周，假手术组不作干预。

1.4.3 标本采集干预12周后，所有受试的SD大鼠均用10%水合氯醛以3 mL/kg剂量腹腔注射麻醉。颈椎脱臼法处死大鼠后，立即取右侧股骨髁软骨放入EP管，-80 ℃条件下保存。

1.5 主要观察指标

1.5.1 大鼠关节软骨的组织形态学观察及Mankin评分取左侧胫骨近端进行固定、脱钙、包埋、切片、番红染色，显微镜下观察各组关节软骨的组织形态改变，并进行Mankin评分。

1.5.2 软骨下骨的Micro-CT扫描及骨组织显微结构定量分析取右侧胫骨近端骨组织，固定后放置于Micro-CT的检测工作槽中。Micro-CT的扫描参数为：旋转角保持220°，增量0.60°，分辨率为45.0 μm，曝光时间为3 000 ms，每层的具体间距为16 μm。每个标本可获取约200张图像。并对软骨下骨骨组织进行定量分析，分析参数：骨密度、骨体积分数(Trabecular bone volume ratio，BV/TV)、骨小梁数量(Trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(Trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁分离度(Trabecular separation, Tb.Sp)。

1.5.3 PCR和Western blot检测MAPKs信号通路中细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase 1，ERK1)和c-Jun氨基酸末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)的mRNA及蛋白表达水平将收集的软骨组织研磨后加入裂解液，充分裂解后离心，提取总蛋白，根据BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。用微量进样器吸取30 μL样品进行SDS-PAGE凝胶：用60 V进行浓缩胶电泳，时间25 min，120 V进行分离胶电泳，40 min，电泳至溴酚蓝刚跑出即终止电泳，取下凝胶转膜，室温封闭1 h后分别加入一抗(1∶1 000稀释)、β-actin内参抗体(1∶1 500稀释)、二抗(1∶2 500稀释)孵育，采用ECL发光液凯基生物发光显影，所得条带运用Image J图像分析软件分析。参照Trizol试剂盒说明书从关节软骨中提取总RNA，按照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)试剂说明书进行反转录和实时定量PCR检测，以18SsrRNA基因为内参，利用荧光染料SYBR Green I方法设计特异性的正反向引物，PCR反应条件：95 ℃ 2 min、95 ℃ 10 s、59 ℃ 20 s，共45个循环，于60 ℃ to 95 ℃行溶解曲线分析，靶基因(ERK1、JNK)的相对表达量用2^-∆∆Ct法计算。扩增引物见表1。

1.6 统计学分析应用SPSS 18.0统计软件对资料进行统计分析，计量资料用x(_)±s表示，组间差异采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

在骨关节炎的发展过程中，软骨下骨表现为双向调节及空间结构的变化，早期阶段骨吸收大于骨形成，局部骨质疏松，为代偿生物力学性能下降，软骨下骨反应性增生，随着疾病的进展，软骨下骨出现明显的软骨下骨硬化、骨赘形成^[8]。在骨关节炎发病过程中，软骨下骨的改变早于关节软骨损伤^[9]。抑制软骨下骨骨代谢失衡，可预防及抑制骨关节炎的发展，软骨下骨将成为治疗骨关节炎的新作用靶点^[10]。

前交叉韧带切断造成关节的不稳，机械应力的失衡，引起与人类骨关节炎类似的病理改变，能快速、稳定获得创伤性骨关节炎的模型，是目前骨关节炎研究中常用的造模方法^[11]。绝经后的女性是骨关节炎的高发人群，病程进展快，残疾程度重，是需密切关注的骨关节炎人群。此次研究中采用卵巢切除术+前交叉韧带切断模型，可以有效的模拟绝经后骨关节炎的病理变化过程^[7]。

在此次研究中，采用番红染色进行关节软骨组织形态学观察，发现模型组软骨表面缺损，软骨细胞数量减少，潮线紊乱，番红染色不均匀，模型组的Mankin评分较假手术组明显增高。软骨下骨的Micro-CT及显微结构分析结果显示，模型组软骨下骨骨小梁稀疏增宽，排列紊乱不均匀，关节边缘可见断裂及致密的骨赘形成，与假手术组相比，模型组中大鼠骨组织的骨密度、骨体积分数、骨小梁数量显著降低(均为P < 0.01)，骨小梁分离度显著增高(P < 0.01)，说明模型组骨密度、骨小梁数量及连接密度下降，分离度增加，存在骨质疏松现象。以上结果显示通过卵巢切除+前交叉韧带切断手术后的大鼠呈现出典型的骨关节炎关节软骨及软骨下骨的病理改变，提示造模成功。

软骨下骨作为骨与软骨间的交界区，具有负责传导垂直应力、抵抗剪切力及连接骨与软骨等的作用^[12]。软骨下骨微结构的稳态平衡及血管化能力的改善可促进软骨细胞的新陈代谢及组织修复^[13]。双膦酸盐作为骨吸收抑制剂，通过抑制破骨细胞的转化及活性，诱导破骨细胞的凋亡，降低骨转化率，抑制骨吸收^[14]。研究发现，双膦酸盐可以维持软骨下骨骨量，改善骨小梁结构，有效的抑制骨关节炎早期骨质疏松样改变，从而缓冲关节软骨所受压力，抑制骨关节炎的进程^[15]。软骨组织形态学检查结果显示治疗组大鼠的关节软骨4层结构清晰可辨，软骨细胞排列规律，Mankin评分较模型组显著降低，软骨下骨的显微CT及显微结构分析显示治疗组大鼠的骨密度、骨体积分数、骨小梁数量较模型组显著增加，骨小梁分离度明显下降，提示伊班膦酸钠干预后，明显改善模型组大鼠软骨细胞紊乱、变性，细胞外基质降解的状态，延缓了关节软骨的退变，并且有效的抑制了骨关节炎早期大鼠的骨质疏松，促进骨组织显微结构的修复，从而达到治疗或改善骨关节炎的目的，这与既往的研究结果是一致的^[16-17]。

MAPKs信号通路参与细胞增殖、凋亡、炎症和基质代谢等多种病理过程，越来越多的证据提示MAPKs通路可能参与调控软骨细胞的凋亡^[18]、细胞外基质的降解及软骨下骨的重建^[19-21]，与骨关节炎的发展密切相关。研究发现机械损伤后软骨组织MAPKs活性增加，特异性抑制剂能显著减少软骨细胞死亡和细胞外基质的降解^[22]。肿瘤坏死因子诱导的骨关节炎的病理表现与JNK的持续激活呈正相关^[23]。为探索伊班膦酸钠对骨关节炎中MAPKs信号通路的影响，此次研究进一步采用了PCR和Western blot法观察伊班膦酸钠对MAPKs通路中的ERK1和JNK两种蛋白表达的影响。实时定量PCR结果显示：与假手术组相比，模型组ERK1、JNK mRNA相对表达量增高，差异具有统计学意义，而与模型组相比，治疗组的ERK1、JNK mRNA表达水平明显降低，进一步的Western blot结果同样显示，伊班膦酸钠治疗后可明显抑制ERK1、JNK的蛋白表达，提示骨关节炎发生时，MAPKs信号通路被激活，而伊班膦酸钠可能通过抑制ERK1、JNK MAPKs信号通路从而延缓了骨关节炎的软骨及软骨下骨的退变。然而，骨关节炎是一种多信号通介导的退行性疾病，研究发现MAPKs信号通路与Wnt信号通路的交互作用在软骨细胞的发生和发展中起了重要的作用，而且多种细胞因子参与MAPKs信号通路的调控^[24]。所以推测MAPKs信号通路可能不是伊班膦酸钠治疗骨关节炎的唯一调控的信号通路，但是此次研究仅为观察性研究，对伊班膦酸钠干预骨关节炎的治疗机制是否通过其他信号通路网格的交互作用以及对MAPKs信号通路的影响是否通过上游细胞因子介导，需要进一步的深入研究。

综上所述，伊班膦酸钠可以提高去卵巢联合前交叉韧带切断大鼠的骨密度，改善软骨下骨的微结构，抑制软骨的退变，从而达到延缓或治疗骨关节炎的效果，抑制ERK1、JNK MAPKs信号通路可能是其发挥作用的重要机制之一。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

伊班膦酸钠干预骨关节炎模型大鼠丝裂原活化蛋白激酶信号通路的变化

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