Adaption to hypoxia and nutrient depletion determines therapy sensitivity of cholangiocarcinoma

Wappler, Jessica; van Dongen, Joost Thomas; Blank, Lars Mathias; Cramer, Thorsten

doi:37609

Adaption to hypoxia and nutrient depletion determines therapy sensitivity of cholangiocarcinoma

Wappler, Jessica^RWTH*

2018

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Jessica Wappler, M. Sc.

ImpressumAachen 2018

Umfang1 Online-Ressource (XVI, 105 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2018

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Cramer, Thorsten (Thesis advisor)^RWTH* ; Blank, Lars Mathias (Thesis advisor)^RWTH* ; van Dongen, Joost Thomas (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2018-11-05

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2018-230209
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/749644/files/749644.pdf
URL: http://publications.rwth-aachen.de/record/749644/files/749644.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Glutamin (frei) ; Hypoxie (frei) ; Metabolismus (frei) ; Therapieresistenz (frei) ; Tumor (frei) ; cancer (frei) ; glutamine (frei) ; hypoxia (frei) ; metabolism (frei) ; therapy resistance (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Ein zentrales Problem bei der Entwicklung effektiver Therapien gegen das Cholangiozelluläre Karzinom (CCC) stellt dessen natürliche anatomische Diversität und molekularbiologische Heterogenität dar. Der Großteil der CCC Patienten wird mit nicht resezierbaren Tumoren vorstellig, deren ‚Gold Standard‘ Therapie aus palliativer Chemotherapie mit Gemcitabine und/oder Cisplatin besteht. Die Ansprechraten sind gering, sodass ein besseres Verständnis zugrundeliegender Resistenz-mechanismen die Entwicklung neuer Therapien erleichtern könnte. Ein Faktor, der die zelluläre Sensitivität für Zytostatika maßgeblich beeinflussen kann ist das Mikromilieu des Tumors. Insbesondere Sauerstoff- und Nährstoffmangel sind ein häufig auftretendes Phänomen in soliden Tumoren und für beide Faktoren wurde ein Aggressivitäts- und Resistenzvermittelnder Effekt auf Tumorzellen nachgewiesen. Da die nicht-essentielle Aminosäure Glutamin eine wesentliche Rolle für den Metabolismus zahlreicher Tumorarten einnimmt, war das Ziel dieser Arbeit, die allgemeine Bedeutung von Glutamin für das CCC zu definieren und deren Effekt auf Chemotherapie im Rahmen zusammentreffender Hypoxie zu analysieren. Eine Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging (MALDI MSI) Analyse zeigte, dass CCC-Patienten häufig Glutaminarme Areale in der Tumorkernregion aufweisen. In-vitro Experimente zeigten zudem, dass die Proliferation von CCC-Ziellinien stark abhängig von der verfügbaren Glutamin-konzentration ist. Durch graduelle Reduktion konnten zwei extrahepatische CCC (eCCC)-Zelllinien (EGI-1 und TFK-1) ihre Glutamin-abhängigkeit überwinden. Die durch den Selektionsprozess etablierten Zelllinien (EGI-1 GD und TFK-1 GD) proliferierten unabhängig von Glutamin. Mithilfe eines extrazellulären Flux Analysers konnte gezeigt werden, dass die mitochondriale Respiration in TFK-1-Zellen stark durch Glutamindepletion beeinflusst wird und möglicherweise eine Verlagerung auf glykolytische Energiegewinnung während des Adaptationsprozesses zur Folge hat. Da der Effekt von Hypoxie und langfristiger Glutamindepletion weitgehend unbekannt ist, wurden eCCA GD-Ziellinien mit Cisplatin oder Gemcitabine in Anhängigkeit von der Sauerstoffverfügbarkeit behandelt. Unter normoxischen Bedingungen führte Glutamindepletion zu einer verringerten Sensitivität gegenüber beiden Chemotherapeutika. Unter Hypoxie (1% O2) zeigten beide parentalen Zelllinien eine induzierte Chemoresistenz, während diese bei den eCCA GD-Zelllinien nach Cisplatinbehandlung nicht auftrat. Untersuchungen der molekularen Antwort der Zelllinien auf Hypoxie ergaben, dass diese durch den Adaptationsprozess nicht verändert wurde und vermutlich nicht für die fehlende Chemoresistenz in eCCA GD-Zelllinien verantwortlich ist. Das Onkoprotein c-Myc spielt eine wichtige Rolle im Glutaminmetabolismus von Tumorzellen und es konnte nachgewiesen werden, dass Glutamindepletion in eCCA-Zellen zu einer Reduktion von c-Myc führt. Interessanterweise zeigten eCCA GD-Zelllinien eine Normalisierung des c-Myc Proteinlevels auf das Level der Glutaminsupplementierten parentalen Zelllinien. Nach Cisplatinbehandlung zeigten beide eCCA-Zelllinien identische c-Myc Proteinlevel unabhängig von der Sauerstoffverfügbarkeit, während Hypoxie eine c-Myc Reduktion in eCCA GD-Zelllinien vermittelte. Diese Ergebnisse zeigen, dass c-Myc Bedeutung für die fehlende Cisplatinresistenz in eCCA GD-Zelllinien haben könnte. Um die anatomische Diversität und damit Heterogenität des CCCs abzubilden, war ein weiteres Ziel dieser Arbeit, die Antwort auf Chemotherapie in Abhängigkeit von der Sauerstoffverfügbarkeit vergleichend in eCCA- und intrahepatischen (iCCA)-Zelllinien zu analysieren. Während beide eCCA-Zelllinien sehr empfindlich auf Hypoxie reagieren, waren bei den untersuchten iCCA-Zelllinien (CC-LP-1 und SNU-1079) abhängig vom Sauerstoffgehalt keine Unterschiede hinsichtlich ihrer Proliferation nachzuweisen. Die Experimente zeigten zudem, dass iCCA-Zelllinien zum Teil eine deutlich geringere Empfindlichkeit gegenüber den getesteten Zytostatika aufweisen und keine Hypoxie-induzierte Cisplatinresistenz zeigen. Interessanterweise demonstrierte eine Analyse der CCC-Patientenkohorte, dass eine signifikante Korrelation zwischen Zytostatikabehandlung und γH2AX-positiven Tumoren, sowie ein Trend zu einer erhöhten Überlebensrate in Klatskin-Tumorpatienten, nicht aber in iCCA-Patienten besteht. Zusammenfassend weisen die Daten darauf hin, dass eine Langzeit-Glutamindeprivation den Resistenz-vermittelnden Effekt von Hypoxie nicht verstärkt, sondern aufhebt. Dies spricht dafür, dass die zellulären Adaptationsmechanismen an ein verändertes Mikromilieu des Tumors möglicherweise komplexer sind, als bisher vermutet. Weiterhin scheint der anatomische Ursprung des Tumors die Abhängigkeit von Sauerstoff zu bedingen. Da beide Subklassen zudem eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Zytostatika zeigen, könnte eine personalisierte Therapie sinnvoll sein.

A key challenge in the development of effective therapies for cholangiocarcinoma (CCA) is the natural anatomic diversity and molecular heterogeneity of the tumor. The majority of CCA patients present with unresectable tumors and palliative chemotherapy with gemcitabine and/or cisplatin is the current gold standard at this stage. A better understanding of the underlying resistance mechanisms is mandatory to improve therapy strategies. One factor known to profoundly influence susceptibility to anti-cancer drugs is the tumor microenvironment. A co-occurrence of oxygen and nutrient deprivation is a common phenomenon in core regions of solid tumors and both are known to stimulate aggressiveness and treatment resistance. As the non-essential amino acid glutamine plays a central role for the metabolism of a variety of solid tumors, the aim of this thesis was to investigate its general importance for CCA as well as its effect on cytostatic drug therapy in a setting with coincident hypoxia. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging (MALDI-MSI) analysis revealed glutamine to be strongly depleted in CCA patient tissue. Moreover, in vitro experiments showed that CCA cell lines are highly dependent on glutamine supply. By using gradual reduction of external glutamine, two extrahepatic CCA (eCCA) cell lines (EGI-1 and TFK-1) were able to overcome glutamine addiction. The glutamine-deprived cell lines obtained in the selection process (termed EGI-1 GD and TFK-1 GD) were capable of glutamine-independent growth. Bioenergetic analysis showed that glutamine deprivation affected mitochondrial respiration of TFK-1 cells, suggesting a shift to glycolysis during the adaption process. Since the effects of coincident hypoxia and long-term glutamine starvation remain broadly unknown, GD cell lines were treated with cisplatin or gemcitabine under normoxia and hypoxia. Under normoxic conditions, GD cells displayed decreased sensitivity to both drugs. Under hypoxia, both parental cell lines showed enhanced chemoresistance, a phenomenon well in line with published literature. Strikingly, hypoxia was not able to increase therapy resistance in GD cells. These results argue for an interconnection between the molecular mechanisms that govern adaptation to glutamine deprivation and the hypoxic response that was not previously appreciated.The oncoprotein c-Myc plays an important role in glutamine metabolism of cancer cells and glutamine deprivation resulted in a reduction of c-Myc protein levels in eCCA cell lines. Glutamine-deprived GD cells showed normalisation of c-Myc to the level of glutamine-supplemented parental cells. When treated with cisplatin, both parental cell lines showed equal levels of c-Myc independent of oxygen availability, whereas distinct hypoxia-mediated downregulation was observed in both GD cell lines. These findings indicate, that c-Myc could be involved in the different cisplatin-induced DNA damage response between cells adapted to glutamine deprivation and their parental counterparts.Given the challenging anatomic diversity of CCA, another aim was to comparatively analyse the response of eCCA and intrahepatic CCA (iCCA) cell lines to cytostatic drug treatment. Whereas both eCCA cell lines showed significant susceptibility to hypoxic conditions, the tested iCCA cell lines (CC-LP-1 and SNU-1079) showed no difference in proliferation. The experiments also revealed a higher tolerance to cisplatin and gemcitabine treatment in iCCA compared to eCCA cell lines with two to ten times higher IC50 values. Moreover, hypoxia-mediated resistance to cisplatin was not detectable in iCCA cell lines. γH2AX is a DNA damage marker which can help to predict tumor response particularly to cisplatin treatment. Analysis of a CCA patient cohort revealed a significant correlation between cytostatic drug treatment and γH2AX-positive tumors as well as a trend towards an improved survival rate in patients with Klatskin tumors that was not detectable in iCCA patients. In summary, the findings suggest that long-term glutamine deprivation does not intensify the resistance-mediating effect of hypoxia, indicating that the adaption to tumor microenvironmental changes might be more complex for therapy outcomes than expected. Moreover, the results indicate that the reliance on oxygen might be dependent on the anatomic origin of the CCA. Since both subclasses showed different susceptibility to anti-cancer drugs, it is reasonable to expect that personalised treatment options are able to improve outcomes.

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