Использование молекулярно импринтированных сорбентов для пробоподготовки при исследовании биологических жидкостей на отдельные группы веществ повышает селективность процедуры анализа на этапе подготовки пробы, а не на этапе регистрации аналитического сигнала [1].
Применение модельных соединений, воспроизводящих физико-химические свойства наркотических средств, психотропных веществ, позволяет получать указанные сорбенты и исследовать их характеристики в лабораторном эксперименте без юридических ограничений. Лекарственное вещество фенилпирацетам воспроизводит физико-химические свойства наркотических средств группы производных пирролидинофенона — α-пирролидиновалерофенона и 3,4-метилендиоксипировалерона, используется для получения молекулярно импринтированного сорбента на основе производных акриловой кислоты, а также функционального мономера диаллиламина. При этом фенилпирацетам не относится к наркотическим средствам и их аналогам [2—4].
Цель исследования — оценка возможности пробоподготовки биологических жидкостей в судебно-химическом анализе с применением молекулярно импринтированного сорбента на основе производных акриловой кислоты.
Материал и методы
Использовали стандартный образец фенилпирацетама (LGC Standards, Великобритания). Модельные образцы крови и мочи готовили путем добавления расчетного количества стандартного образца (в виде этанольных растворов концентрации 1 мкг/мл) к образцам, не содержащим наркотических средств, психотропных и лекарственных веществ. Диапазон концентрации фенилпирацетама выбран на основании данных о токсичных, летальных производных пирролидинофенона в плазме крови 20,0—6000,0 нг/мл [5].
Для модельных образцов крови диапазон концентрации составлял: морфин — 100,0—2000,0 нг/мл; кодеин — 200,0—1500,0 нг/мл; верапамил — 200,0—5000,0 нг/мл; эфедрин — 100,0—5000,0 нг/мл; баклофен — 500,0—2000,0 нг/мл; доксиламин — 200,0—500,0 нг/мл; амитриптилин — 200,0—2000,0 нг/мл; циннаризин — 200,0—500,0 нг/мл.
Твердофазную экстракцию с применением молекулярно импринтированного сорбента на основе производных акриловой кислоты осуществляли в микроколоночном варианте. Методика: 1 мл пробы биологической жидкости пропускали через колонку с сорбентом (100 мг), уравновешенным фосфатным буферным раствором (pH 8,5), с объемной скоростью 1 мл/мин и элюировали 10 мл воды очищенной. Полученный элюат I отбрасывали, колонку высушивали при комнатной температуре. Затем колонку элюировали 2 мл спирта изопропилового, элюат II собирали и упаривали в токе азота при температуре не выше 40 °C, сухой остаток реконструировали 20 мкл этилацетата [6, 7]. При исследовании образцов крови предварительно удаляли форменные элементы и проводили депротеинизацию ацетонитрилом.
Определение степени извлечения фенилпирацетама из биологических жидкостей, правильности и прецизионности (сходимости) производили в соответствии рекомендациями «Руководства по валидации аналитических методик, используемых в судебно-химическом и химико-токсикологическом анализе биологического материала» [8].
Для оценки селективности сорбента определяли коэффициент перекрестного реагирования (ПР) по формуле [9]:
где ∆Аав, ∆Афп — интенсивности сигнала масс-детектора для элюата, полученного для целевого анализируемого вещества, при исследовании лекарственных веществ других химических групп и фенилпирацетама соответственно (площадь ионной хроматограммы в условных единицах).
Определение исследуемых веществ в пробах биологических жидкостей методом хромато-масс-спектрометрии. Использовали газовый хроматограф Agilent Technologies 6890N с масс-селективным детектором Agilent Technologies 5973 с кварцевой капиллярной колонкой HP5-MS (5% фенил-диметилсилоксан) длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Режим программирования температуры колонки: начальная температура 170 °C (выдержка в течение 1 мин), повышение температуры со скоростью 15 °C/мин до 280 °C с выдержкой при конечной температуре 5 мин. В качестве газа-носителя использовали гелий; скорость газа-носителя 1 мл/мин в режиме постоянного потока. Температура инжектора 280 °C, температура аналитического интерфейса 285 °C. Ввод пробы осуществляли с помощью автосамплера в режиме с делением потока 1:15 (split/splitless); объем пробы — 1 мкл. В режиме селективного ионного мониторинга регистрировали по три характеристических иона анализируемых веществ [10].
Результаты и обсуждение
Сравнили величины средней степени извлечения фенилпирацетама (для диапазона концентраций 20,0—6000,0 нг/мл) из водных растворов, образцов крови и мочи. Оказалось, что степень извлечения из модельных образцов крови на 6% ниже по сравнению со степенью извлечения из водных растворов и на 4% ниже по сравнению с образцами мочи (см. рисунок). Степень извлечения фенилпирацетама из образцов мочи статистически достоверно не отличается от степени извлечения из водного раствора. Только для образцов крови наблюдали влияние матрицы на извлечение целевого соединения, а также возможно, что снижение извлечения может быть связано с потерями фенилпирацетама на этапе депротеинизации ацетонитрилом.
Средняя степень извлечения модельного соединения фенилпирацетама из водных растворов и образцов биологических жидкостей (диапазон концентраций 20,0—6000,0 нг/мл).
Mean recovery of the model compound phenylpiracetam from aqueous solutions and biological fluid samples (concentration range 20.0—6000.0 ng/ml).
Аналогично извлечению из водных растворов степень извлечения для образцов крови и мочи на уровне не менее 75% обеспечивается в интервале концентрации фенилпирацетама 100,0—6000,0 нг/мл.
Параметры правильности и прецизионности методики пробоподготовки методом твердофазной экстракции оценили путем анализа модельных образцов крови и мочи для трех уровней концентрации фенилпирацетама: нижний — 50,0 нг/мл, средний — 500,0 нг/мл и верхний — 1500,0 нг/мл. В качестве принятого опорного значения при оценке правильности использовали степень извлечения фенилпирацетама из водного раствора соответствующей концентрации. Сходимость результатов измерений (относительное стандартное отклонение) определили в пяти разных аналитических циклах [8] — между сериями параллельных определений (табл. 1).
Таблица 1. Правильность и прецизионность показателя «степень извлечения фенилпирацетама» методики пробоподготовки биологических жидкостей методом твердофазной экстракции на молекулярно импринтированном сорбенте
Table 1. Accuracy and precision of the phenylpiracetam recovery parameter of the method for biological fluids sample preparation by solid-phase extraction on a molecularly imprinted sorbent
| Анализируемый образец | Уровень концентрации фенилпирацетама, нг/мл | Степень извлечения,% | Правильность,% | Сходимость между сериями параллельных определений,% |
| Кровь (после депротеинизации ацетонитрилом) | нижний 50,0 средний 500,0 высокий 1500,0 | 61,6 84,2 87,6 | 6,5 5,3 11,5 | 16,1 8,3 6,1 |
| Моча | нижний 50,0 средний 500,0 высокий 1500,0 | 66,4 86,6 92,4 | 5,2 3,7 3,5 | 12,6 9,5 5,4 |
Относительные погрешности определения степени извлечения из образцов крови, используемые для оценки правильности методики пробоподготовки, для всех уровней концентрации фенилпирацетама не превышали ±12%. Для верхнего уровня концентрации (1500,0 нг/мл) погрешность составила ±11,5%. Минимальное значение ±5,3% наблюдали на среднем уровне концентрации 500,0 нг/мл.
Относительные погрешности определения степени извлечения из образцов мочи для всех уровней концентрации не превышали ±6%. Для верхнего уровня концентрации (1500,0 нг/мл) погрешность составила около ±4%.
Сходимость результатов определения степени извлечения фенилпирацетама из модельных образцов крови на нижнем уровне концентрации оказалась 16,1%, на верхнем — 6,1%, для образцов мочи — соответственно 12,6 и около 5%.
Селективность пробоподготовки оценивали путем расчета коэффициента перекрестного реагирования на примере модельных образцов крови, содержащих бинарные комбинации фенилпирацетама и ряда лекарственных веществ основного и амфотерного характера. Концентрации лекарственных веществ в модельных образцах крови подобрали таким образом, чтобы они соответствовали терапевтическим, токсическим и летальным уровням этих соединений (табл. 2).
Таблица 2. Коэффициенты перекрестного реагирования ряда лекарственных веществ и фенилпирацетама при пробоподготовке модельных образцов крови методом твердофазной экстракции на молекулярно импринтированном сорбенте
Table 2. Cross-reactivity coefficients of some drugs and phenylpiracetam during sample preparation of model blood samples by solid-phase extraction on a molecularly imprinted sorbent
| Лекарственное вещество + фенилпирацетам | Концентрация в крови, (нг/мл)/ПР, % | ||
| терапевтическая | токсическая | летальная | |
| Морфин | 100,0/3,5 | 400,0/5,2 | 2000,0/5,4 |
| Кодеин | 200,0/4,5 | 400,0/5,1 | 1500,0/5,2 |
| Верапамил | 200,0/3,5 | 800,0/3,1 | 5000,0/3,3 |
| Эфедрин | 100,0/3,2 | 1000,0/5,1 | 5000,0/5,5 |
| Баклофен | 500,0/8,6 | 2000,0/9,0 | — |
| Доксиламин | 200,0/6,4 | — | — |
| Амитриптилин | 200,0/6,7 | 500,0/7,5 | 2000,0/7, |
| Циннаризин | 200,0/8,1 | — | — |
Среди исследованных лекарственных веществ максимальные значения коэффициента перекрестного реагирования на уровне 8—9% имеют циннаризин и баклофен. Для опиатов и эфедрина коэффициент перекрестного реагирования не превышал 5,5%.
Коэффициенты перекрестного реагирования лекарственных веществ, находящиеся в интервале 3,1—9% по сравнению с величиной для фенилпирацетама (100,0%), однозначно доказывают высокую селективность применяемого молекулярно импринтированного сорбента.
Заключение
Предложен вариант пробоподготовки биологических жидкостей (кровь, моча) методом твердофазной экстракции с применением молекулярно импринтированного сорбента на основе акриловой кислоты, который повышает уровень селективности анализа и может быть рекомендован к применению в практике судебно-химической экспертизы. Максимальная степень извлечения из модельных образцов крови и мочи не менее 75% обеспечивается при концентрации фенилпирацетама 100,0—6000,0 нг/мл. Определены метрологические характеристики: правильность определения степени извлечения фенилпирацетама не превышает ±12% для образцов крови и ±6% для образцов мочи, сходимость — не более 16 и 13% соответственно. На основании оценки перекрестного реагирования молекулярно импринтированного сорбента с рядом лекарственных веществ показана селективность методики пробоподготовки.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.