Resumo

ARTIGO

Blainvillea rhomboidea: constituintes químicos e atividade citotóxica

Blainvillea rhomboidea: chemical constituents and cytotoxic activity

Regina Ferreira Gomes^I; Hélcio Silva dos Santos^I; Maria Rose Jane R. AlbuquerqueI, ^* * e-mail: rjane_7@hotmail.com ; Otília Deusdênia L. Pessoa^II; Leticia V. Costa Lotufo^III; Claudia do Ó Pessoa^III; Manoel Odorico de Moraes^III; Felipe A. R. Rodrigues^III

^ICoordenação de Química, Centro de Ciências Exatas e Tecnologia, Universidade Estadual Vale do Acaraú, CP D-3, 62040-340 Sobral - CE, Brasil

^IIDepartamento de Química Orgânica e Inorgânica, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, CP 12200, 60021-970 Fortaleza - CE, Brasil

^IIIDepartamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do Ceará, CP 3157, 60430-270 Fortaleza - CE, Brasil

ABSTRACT

The phytochemical investigation of the ethanol extract from the aerial parts of Blainvillea rhomboidea (Asteraceae) resulted in the isolation and characterization of 8β-tigloyloxy-grazielia acid, together with the flavonoids derrone, acacetin, luteolin and luteolin 7-methyl ether, and p-(1-methyl-ethan-1-ol)-phenol. The structures of all compounds were determined by spectroscopic methods (¹H and ¹³C NMR and HREIMS) and comparison with published spectral data. The flavonoids luteolin and 7-O-metyl-luteolin, isolated from the active dichloromethane fraction, showed moderate cytotoxic activity.

Keywords:Blainvillea rhomboidea; Asteraceae; flavonoids.

INTRODUÇÃO

O gênero Blainvillea, pertencente à família Asteraceae, tribo Helianteae, subtribo Ecliptinae, é representado por apenas 10 espécies de dispersão pantropical.^1-3 Destas, apenas cinco têm sido investigadas quanto a sua composição química: B. acmella, B. gayana, B. dichotoma, B. latifolia e B. rhomboidea. De acordo com estes estudos, as plantas deste gênero são produtoras em potencial de lactonas sesquiterpênicas de diferentes tipos esqueletais, tais como melampolidos, germacranolidos e guaianolidos.^1-3 Classes de compostos, como diterpenos,⁴ derivados acetilênicos,⁵ triterpenos e esteroides,⁶ também são relatadas.

Blainvillea rhomboidea, conhecida popularmente como erva-palha ou picão grande é uma planta anual, de porte herbáceo com ramos geralmente marrom-avermelhados, medindo cerca de 80 a 160 cm de altura.⁷ Esta espécie, como normalmente se desenvolve em grandes populações, é considerada indesejável, invasora de plantações e pastos. Inicialmente, estudou-se a composição química e a atividade antimicrobiana do óleo essencial das folhas e flores de exemplares desta espécie. Dos 18 componentes identificados nos óleos, 5-indanol (14,5%), p-cimen-8-ol (10,1%), β-cariofileno (9,6%) e óxido de cariofileno (9,6%) foram os principais constituintes.⁸ O óleo essencial das flores, cujo principal componente foi o indanol, ausente no óleo das folhas, mostrou atividade antimicrobiana.⁸ Concluindo o estudo químico de B. rhomboidea, descreve-se neste trabalho o resultado obtido com a prospecção química do extrato etanólico das partes aéreas. Concomitante ao estudo fitoquímico foi investigada a atividade citotóxica dos extratos hexânico e etanólico de frações provenientes dos extratos ativos e de alguns constituintes químicos isolados.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O extrato etanólico da parte aérea de B. rhomboidea foi submetido à partição líquido-líquido utilizando os solventes hexano, CH₂Cl₂ e AcOEt. O fracionamento cromatográfico da fração hexano resultou no isolamento dos flavonoides 5,4'-di-hidroxi-6,6-dimetil-4,5-di-hidropirano-[2,3:7,8]isoflavona (derrona) (1)⁹ e acacetina (2).¹⁰ Da fração CH₂Cl₂ foi isolada uma lactona sesquiterpênica caracterizada como ácido 8β-tigloiloxi-grazielia (4), os flavonoides luteolina (3) e o éter 7-metil-luteolina (6)¹¹, além do derivado fenólico, p-(1-metil-etan-1-ol)-fenol (5). As estruturas desses compostos foram determinadas por métodos espectroscópicos, em particular RMN ¹H e ¹³C, uni- e bidimensionais (COSY, HSQC, HMBC e NOESY) e comparação com dados da literatura.

O composto 4 foi isolado como um óleo incolor. O espectro de massas de alta resolução, no modo negativo, forneceu o pico em m/z 359.1495 [M - H]^-, permitindo determinar a fórmula molecular C₂₀H₂₄O₆, indicando 9 insaturações. Seu espectro no infravermelho exibiu uma banda larga centrada em 3505 compatível com deformação axial de grupo -OH de ácido carboxílico, bandas intensas em 1762 e 1711 cm^-1 compatíveis com grupos carboxilas de ácido carboxílico e éster, além de absorções na faixa de 1256 a 1038 cm^-1 características de ligação C-O.

O espectro de RMN ¹H apresentou sinais correspondentes a três grupos metilas ligados a carbono sp², em δ 1,85 (s, 3H-15), 1,75 (s, 3H-5') e 1,73 (d, J = 7,0 Hz, 3H-4'), os quais no espectro HSQC mostraram correlação com os sinais de carbono em δ 17,5; 14,4 e 12,2, respectivamente. Os sinais em δ 6,12 (d, J = 3,0 Hz, H-13a) e 5,63 (d, J = 3,0 Hz, H-13b), ambos correlacionados ao sinal de carbono em δ 120,2, revelaram a presença de uma dupla ligação gem-dissubstituída, enquanto os sinais em δ 5,13 (d, J = 8,0 Hz, H-5), 5,92 (dd, J = 12,8 e 4,3 Hz, H-1) e 6,77 (q, J = 7,0 Hz, H-3'), correlacionados aos sinais de carbono em δ 126,5, 148,9 e 138,3, respectivamente, foram atribuídos a duplas ligações, incluindo a de um grupo tigloíla, corroborando com a feição quarteto exibida pelo sinal em δ 6,77. Os sinais em δ 5,82 (d, J = 6,3 Hz, H-8) e 5,14 (m, H-6) foram compatíveis com hidrogênios oximetínicos. O espectro de RMN ¹³C-CPD apresentou sinais correspondentes a 20 átomos de carbono, cujo padrão de hidrogenação foi determinado através do espectro DEPT 135. Com base nas duas técnicas determinou-se: sete carbonos não hidrogenados, todos com hibridação sp², incluindo os sinais em δ 169,9 (C-12), 168,9 (C-14) e 166,9 (C-1') os quais foram atribuídos às carboxilas conjugadas de lactona, ácido carboxílico e éster, respectivamente. Três carbonos metilênicos, um dos quais em δ 120,2; seis carbonos metínicos, sendo três sp² em δ 148,9; 126,5 e 138,3 e dois oxigenados em δ 76,5 e 71,0, além de três metilas. Estes dados foram compatíveis com a estrutura de uma lactona sesquiterpênica, esterificada com um grupo tigloíla, cuja posição foi definida através da correlação do sinal de hidrogênio em δ 5,82 (H-8) com o carbono em 166,9 (C-1'), no espectro HMBC. A posição do grupo ácido carboxílico foi confirmada através da correlação observada entre o sinal em 5,92 (H-1) com o carbono em 168,9 (C-14). Todos os dados espectrais acima discutidos levaram à estrutura do ácido 8β-tigloiloxi-grazielia, previamente isolado de B. rhomboidea, cuja estrutura foi determinada utilizando-se apenas dados de RMN ¹H. Portanto, este é o primeiro trabalho onde os dados de RMN de C-13 são atribuídos para este composto (Tabela 1).

Paralelo ao estudo fitoquímico, investigou-se o potencial citotóxico das frações resultantes do fracionamento cromatográfico do extrato EtOH (Tabela 2), assim como dos compostos isolados.

O resultado da avaliação citotóxica mostrou que na concentração de 50 μg/mL a fração diclorometano apresentou inibição do crescimento celular nas duas linhagens celulares testadas - HCT-8 e MDAMB-435 - correspondentes a 58,75 e 46,65%, respectivamente (Tabela 2). Todas as frações, com exceção da fração MeOH, obtidas com o fracionamento cromatográfico da fração diclorometano ativa apresentaram um forte percentual de inibição sobre as duas linhagens celulares testadas (Tabela 2). A fração MeOH, por sua vez, mostrou inibição somente na linhagem de melanoma (MDA-MB 435). Todos os compostos obtidos das frações ativas foram testados, mas somente os flavonoides luteolina (3) e o éter 7-metil-luteolina (6) apresentaram citotoxicidade. A luteolina apresentou valores de IC₅₀ que variaram de 3,37 μg/mL em HCT-8 a 18,10 μg/mL em MDA-MB-435, enquanto que éter 7-metil-luteolina exibiu valores IC₅₀ variando de 2,71 μg/mL em HCT-8 a 19,06 em SF-295 (Tabela 3). De fato, as propriedades anticâncer da luteolina já são amplamente discutidas na literatura, e seus efeitos citotóxicos já foram descritos para várias linhagens de células tumorais, estando relacionados ao bloqueio do ciclo celular em G2M seguido de apoptose, além de modular a atividade de várias proteínas celulares.^12,13 Além disso, a luteolina mostrou-se capaz de inibir a angiogênese, previnir a carcinogênese e sensibilizar as células tumorais a agentes quimoterápicos.^14,15

PARTE EXPERIMENTAL

Instrumentação e material cromatográfico

Os pontos de fusão foram determinados em equipamento de microdeterminação digital da Mettler Toledo com placa aquecedora FP82HT e uma central de processamento FP90. As determinações foram realizadas a uma velocidade de aquecimento de 2 ºC/min e não foram corrigidas. Os espectros de absorção na região de IV foram registrados em espectrômetro Perkin-Elmer, modelo 1000 com transformada de Fourier, utilizando pastilhas de KBr para amostras sólidas e filmes para substâncias oleosas. Os espectros de RMN ¹H e ¹³C, uni- e bidimensionais, foram obtidos em espectrômetro Bruker, modelo DRX-300 (300 MHz para ¹H e 75 MHz para ¹³C) e Avance DRX-500 (500 MHz para ¹H e 125 MHz para ¹³C). O espectro de massa de alta resolução foi obtido em um LCMS-IT-TOF equipado com fonte de ionização por electronspray da Shimadzu. Nas cromatografias de adsorção utilizou-se gel de sílica 60 da Vetec (Ø μm 70-230 mesh, para cromatografias gravitacionais) e Merck (Ø μm 230-400 mesh, para cromatografias sobre pressão), enquanto nos fracionamentos cromatográficos por exclusão molecular foi empregado Sephadex LH-20. As cromatografias em camada delgada analítica (CCDA) foram realizadas com gel de sílica 60, (Ø μm 5-40, Merck) com indicador de fluorescência na faixa de 254 ηm (F₂₅₄). As substâncias foram reveladas com solução de vanilina/ácido perclórico/EtOH, seguida de aquecimento em estufa (~ 100 ºC), por aproximadamente 5 min.

Material vegetal

Blainvillea rhomboidea foi coletada no período de floração, no Campus da Universidade Federal do Ceará, em junho de 2005. A identificação botânica foi realizada pelo Prof. E. P. Nunes, Departamento de Biologia da UFC. A exsicata da planta, correspondente a coleta, encontra-se depositada no Herbário Prisco Bezerra (EAC) do Departamento de Biologia - UFC, sob o número de registro 33.879.

Extração e isolamento

A parte aérea (1,5 kg) de B. rhomboidea foi seca à temperatura ambiente, triturada e, em seguida, submetida à extração (3 x 8 L) com etanol a frio. As soluções obtidas foram destiladas sob pressão reduzida, resultando no extrato etanólico (85,9 g) o qual foi dissolvido em 150 mL da mistura MeOH/H₂O (7:3) e submetido à partição com os solventes hexano, CH₂Cl₂ e AcOEt (5 vezes 100 mL de cada solvente). As frações obtidas foram secas com sulfato de sódio anidro (Na₂SO₄), filtradas e concentradas sob pressão reduzida, fornecendo as frações hexanica (3,9 g), CH₂Cl₂ (29,0 g) e AcOEt (1,9 g), além do resíduo (6,9 g). A fração hexano (3,9 g) foi submetida à cromatografia sobre 40 g de gel de sílica utilizando os solventes hexano e AcOEt, puros ou em misturas binárias, seguido por MeOH. Deste fracionamento foram obtidas as frações hexano/AcOEt 9,5:0,5 (1,4 g), 9:1 (0,48 g), 8:2 (0,40 g), 7:3 (0,69 g), 6:4 (0,43 g), 3,5:6,5 (0,30 g), AcOEt (0,03 g) e MeOH (0,093 g). A fração hexano/AcOEt 8:2 (0,40 g) foi submetida a uma cromatografia sobre pressão e eluída com a mistura binária de hexano/AcOEt 9:1 fornecendo 125 frações de 8 mL. Após monitoramento em CCD, estas frações foram reunidas em 5 grupos: (A-I a A-V). O grupo A-IV (Frações 73-121, 72,0 mg) após cromatografia em gel de sílica (5,0 g) utilizando misturas de hexano e AcOEt em gradiente crescente de polaridade resultou no isolamento de 1 (6,0 mg; p. f. 220-223 ºC; lit. 216-218 ºC)⁹. A fração hexano/AcOEt 7:3 (0,69 g) foi sujeita à cromatografia em gel de sílica (2,0 g) e eluída com a mistura binária hexano/CHCl₃ em gradiente de polaridade, seguido de AcOEt. Foram obtidas 69 frações de 10 mL que, após serem analisadas por CCD, foram reunidas em 6 grupos (B-I a B-VI). O grupo IV (Frações 35-46, 61,0 mg) após cromatografia por exclusão molecular, em Sephadex LH-20 empregando acetona/MeOH 1:1 como fase móvel, culminou no isolamento de 2 (11,0 mg ; p. f. 256-257 °C; lit. 254-256 °C)¹⁰. A fração CH₂Cl₂ (29,0 g), oriunda do fracionamento cromatográfico inicial, foi fracionada sobre 47,0 g de gel de sílica utilizando os solventes hexano e AcOEt puros ou em misturas binárias, seguido de MeOH. Ao final foram obtidas as seguintes frações: hexano/AcOEt 9:1 (0,02 g); 8:2 (0,33 g); 7:3 (0,96 g), 1:1 (2,0 g), 3,5:6,5 (6,8 g); AcOEt (9,1 g) e MeOH (9,2 g). A fração hexano/AcOEt 1:1 (2,0 g) foi submetida à cromatografia em gel de sílica (41,0 g) e eluída com os solventes CHCl_3, AcOEt e MeOH, puros ou em gradiente de polaridade, resultando em 9 frações de 100 mL, as quais após concentradas sob pressão reduzida e analisadas por CCD foram reunidas em 7 grupos (C-I a C-VII). A fração C-IV (frações CHCl₃-AcOEt 1:1, 370,0 mg) foi submetida a fracionamento cromatográfico sobre Sephadex LH-20 e eluída com acetona/MeOH 1:1, resultando no isolamento de 3 (15,0 mg; p.f. 322-324; lit. > 320 °C)¹¹. A fração hexano/AcOEt 3,5:6,5 (6,8 g) foi sujeita à cromatografia sobre gel de sílica (44,0 g) utilizando um sistema binário constituído de CHCl₃/AcOEt, aumentando-se a concentração de 20 em 20%, seguido de AcOEt e MeOH. As frações obtidas após concentração do solvente resultaram nas frações CHCl₃ (3,7 g), CHCl₃/AcOEt 8:2 (1,0 g), 6:4 (650,0 mg), 4:6 (642,0 mg), 2:8 (410,0 mg), AcOEt (191,0 mg) e MeOH (320,0 mg). A fração CHCl₃ (3,7 g) foi submetida à cromatografia sobre 42,3 g de gel de sílica, empregando os solventes hexano e AcOEt, puros ou em misturas binárias seguido de MeOH. Foram coletadas 27 frações as quais após análise em CCD foram reunidas em 11 grupos (D-I a D-XI). Os grupos D-III (frações 8-9, 151,9 mg) e D-VI (frações 10-11, 465,1 mg), após comparação em CCD, mostrou conter as substâncias 1 e 2, respectivamente. A fração D-V (fração 12, 691,0 mg) foi submetida à cromatografia sobre gel de sílica (7,9 g) utilizando os solventes hexano, AcOEt e MeOH, em gradiente de polaridade. Desta coluna obtiveram-se 110 frações, as quais após análise por CCD foram reunidas em 10 grupos (E-I a E-10). O grupo E-II (frações 24-30, 209,0 mg) após cromatografias por exclusão molecular sobre Sephadex LH-20, empregando o sistema de solvente acetona/MeOH 1:1, culminou no isolamento de 4 (57,4 mg). A fração CHCl₃/AcOEt 8:2 (1,0 g), foi acondicionada sobre 16,5 g de gel de sílica e submetida a fracionamento cromatográfico, utilizando um gradiente constituído de hexano/AcOEt (8:2 a 2:8) seguido de AcOEt, resultando em 82 frações de 8 mL. A análise por CCD permitiu reuni-las em 7 grupos (F-I a F-VII). O grupo F-III (frações 36-52, 65,0 mg) após fracionamento cromatográfico sobre Sephadex LH-20 utilizando o sistema de solvente acetona/MeOH 1:1, forneceu a substância 5 (7,4 mg). O grupo F-V (430,0 mg) após ser submetido a procedimento cromatográfico semelhante ao anterior resultou no isolamento da substância 6 (11,0 mg) (Figura 1).

Avaliação da atividade citotóxica

A citotoxicidade dos compostos foi avaliada em 4 linhagens tumorais, usando a análise de redução do 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-brometo tetrazolina (MTT)¹⁶ (Sigma Aldrich Co. - St. Louis, USA). Para o experimento, as células foram distribuídas em placas de 96 poços (10⁵ células/poço para células aderentes ou 3 x 10⁵ células/poço para células em suspensão em 100 μL de meio). As frações foram testadas em concentração única de 50 μg/mL para determinação do percentual de inibição do crescimento celular, enquanto os compostos puros foram diluídos em concentrações que variaram de 0.09 a 50 μg/mL em DMSO 1%. Cada composto foi adicionado em cada poço usando-se HTS (high-throughput screening, biomek 3000, Beckman Coulter, Inc. Fullerton, California, USA) e posteriormente incubado por 72 h. O grupo controle negativo recebeu a mesma quantidade de DMSO. Depois de 69 h de incubação, o sobrenadante foi aspirado e acrescentado à solução do MTT (0,5 mg/mL). Três horas depois, o produto formado do MTT, o formazan, foi dissolvido em 150 μL de DMSO e a absorbância foi lida a 595 nm (DTX 880 Multimode Detector, Beckman Coulter, Inc. Fullerton, California, USA). Como controle positivo usou-se a doxorrubicina (0,01 a 5 μg/mL) obtida da Sigma Aldrich Co. - St. Louis, MO/USA.

CONCLUSÃO

A prospecção química de B. rhomboidea culminou no isolamento de quatro flavonoides e de uma lactona sesquiterpênica. Embora flavonoides sejam bastante comuns em plantas superiores, inclusive na família Asteraceae, este é o primeiro relato sobre o isolamento deste tipo de composto em uma planta do genêro Blainvillea, por outro lado, as lactonas sesquiterpênicas são os constituintes mais comuns no gênero, inclusive em plantas de origem brasileira.

MATERIAL SUPLEMENTAR

Os espectros e RMN e EM estão disponíveis em http://quimicanova.sbq.org.br, em arquivo .PDF, com acesso livre.

AGRADECIMENTOS

À FUNCAP e PRONEX pelo apoio financeiro, ao CNPq pelas bolsas de estudo e de pesquisa, ao Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear (CENAUREMN) e Laboratório de Espectrometria de Massa do Nordeste (LEMANOR) pela obtenção dos espectros.

Recebido em 13/9/09; aceito em 21/1/10; publicado na web em 3/5/10

MATERIAL SUPLEMENTAR

Figura 1S - Clique para ampliar

Figura 2S - Clique para ampliar

Figura 3S - Clique para ampliar

Figura 4S - Clique para ampliar

Figura 5S - Clique para ampliar

Figura 6S - Clique para ampliar

Figura 7S - Clique para ampliar

Figura 8S - Clique para ampliar

Datas de Publicação

Histórico