Resumo

BIOLOGICAL CONTROL

Juliana R V da Costa^I; Juliana R Rossi^I; Suzana C Marucci^I; Eliane C da C Alves^I; Haroldo X L Volpe^II; Antonio S Ferraudo^III; Manoel V F Lemos^I; Janete A Desidério^I

^IDepto de Biologia Aplicada à Agropecuária

^IIDepto de Fitossanidade;

^IIIDepto de Ciências Exatas. Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - FCAV/Unesp, Campus de Jaboticabal, Rod Prof Paulo Donato Castellane s/nº, 14.884-900,Jaboticabal, SP, Brasil; julcosta@fcav.unesp.br; jurossi@fcav.unesp.br; suzy_marucci@yahoo.com.br; elianea@fcav.unesp.br; hxlvolpe@ig.com.br; fsajago@gmail.com; mvictor@fcav.unesp.br; janete@fcav.unesp.br

ABSTRACT

Aedes aegypti (L.), the main vector of dengue fever in Brazil, has been controlled with the use of massive chemical products, contributing to the development of resistance and decreasing the insect control efficiency. The control of dipterans with bioinsecticides based on Bacillus thuringiensis has been satisfactory, due to the production of insecticidal proteins denominated Cry (crystal), Cyt (cytolytic) toxins and Chi (chitinase), and to the synergistic effects among them. The present work aimed to select B. thuringiensis isolates efficient against A. aegypti larvae. A bacterial collection containing 1,073 isolates of B. thuringiensis, obtained from different locations of Brazilian territory, had the DNA isolated and submitted to PCR amplifications using specific primers for cry4Aa, cry4Ba, cry11Aa, cry11Ba, cyt1Aa, cyt1Ab, cyt2Aa and chi genes. For the LC₅₀ and LC₉₀ determination, the entomopathogenic isolates were evaluated by selective and quantitative bioassays. Only 45 isolates (4.2%) presented amplicons for the cry and cyt genes. The chi gene sequence was detected in 25 (54.3%) of those isolates. From the 45 isolates submitted to the selective bioassays, 13 caused 100% mortality of A. aegypti larvae. The identification of cry, cyt and chi genes of B. thuringiensis and the toxicity analysis on A. aegypti led to the selection of a set of isolates that have the potential to be used in the formulation of new bioinsecticides.

Key words: Biological control, cry, cyt, chitinase, dengue fever

O desenvolvimento de resistência de populações de insetos aos inseticidas químicos afeta diretamente a reemergência de doenças transmitidas por vetores, principalmente aquelas em que não é possível a cobertura vacinal para garantir a proteção da população humana. Aedes aegypti (L.), com ocorrência nas áreas tropicais e subtropicais, está sempre associado ao domicílio humano e proximidades, embora possa ser encontrado longe dos aglomerados urbanos. No Brasil, o controle químico tem sido ineficiente em conter o mosquito, o qual apresenta altíssima capacidade de adaptação ao novo ambiente criado pela urbanização acelerada (Ministério da Saúde 2007), tornando o seu combate uma tarefa difícil (Rey 2002).

Desse modo, são necessários estudos que propiciem métodos alternativos para o seu controle. Podem ser mencionados como métodos de controle biológicos alternativos aqueles produtos onde o ingrediente ativo são microrganismos, os quais são aplicados de maneira similar a um inseticida químico (Melo & Azevedo 1998).

No gênero Bacillus, B. thuringiensis é considerada a espécie de maior interesse, pois é um entomopatógeno de várias ordens de insetos-praga, como Lepidoptera, Coleoptera, além de dípteros vetores de doenças humanas (Cavados et al 2001, De Maagd et al 2003). Bacillus thuringiensis produz, durante sua esporulação, inclusões cristalinas, compostas por proteínas denominadas ´-endotoxinas, codificadas pelos genes cry, as quais são tóxicas contra diferentes hospedeiros. Muitas linhagens de B. thuringiensis possuem um único gene cry, enquanto outras podem apresentar complexas combinações de genes (Bravo et al 1998).

Diversas linhagens de B. thuringiensis produzem uma série de outras toxinas que podem participar da ação entomopatogênica. A proteína Cyt, de peso molecular 28 kDa, é uma citolisina de ação inespecífica, produzida, principalmente, pela variedade israelensis, sendo acumulada no cristal, juntamente com as ´-endotoxinas típicas desta variedade. Por não apresentar homologia com as demais proteínas Cry, as toxinas Cyt não são classificadas como ´-endotoxinas (Lereclus et al 1993).

Segundo Regev et al (1996), outras proteínas que vêm sendo estudadas no controle biológico de insetos são as quitinases (Chi) (Arora et al 2003), presentes em isolados de B. thuringiensis. Estudos demonstram que a quitinase hidrolisa a quitina na membrana peritrófica do inseto, formando poros que facilitam o contato entre as ´-endotoxinas e seus receptores no epitélio intestinal, aumentando a toxicidade de B. thuringiensis.

Diversos laboratórios em todo o mundo buscam novos isolados de B. thuringiensis que produzam diferentes toxinas ou que estejam mais adaptados às condições locais, para que tenham melhor eficácia em campo e possam ser usados no manejo da resistência de insetos (Monnerat & Bravo 2000).

A caracterização e a identificação de genes cry de isolados de B. thuringiensis têm sido realizadas por meio da técnica de PCR (Fatoretto et al 2003, Nariman 2007). No entanto, as interações de proteínas produtoras de cristal podem afetar profundamente a toxicidade de um isolado; assim, os testes de toxicidade complementam a caracterização de cada isolado e podem sugerir seu real potencial no controle biológico dos insetos-alvo.

O objetivo deste trabalho foi identificar, por meio da técnica de PCR, a presença de genes cry e cyt (díptero-específicos) e quitinase (chi), a partir de uma coleção de 1073 isolados de B. thuringiensis oriundos de diversas regiões brasileiras para, posteriormente, selecionar aqueles efetivos contra larvas de A. aegypti por meio de bioensaios seletivos e quantitativos, além de correlacionar o efeito das diferentes combinações gênicas com a eficiência dos isolados na mortalidade das larvas do mosquito. Novos isolados apresentando genes com diferentes modos de atuação poderão ser utilizados para o desenvolvimento de bioinseticidas com maior toxicidade e menores chances de o inseto tornar-se resistente.

Material e Métodos

Isolados de Bacillus thuringiensis. Analisaram-se 1073 isolados de B. thuringiensis, provenientes de diversas regiões brasileiras, pertencentes à coleção do Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada (LGBBA) da FCAV/Unesp - Campus de Jaboticabal, os quais foram estocados na forma de fitas de papel filtro, impregnadas com uma suspensão de esporos e mantidas a 10ºC.

Como linhagens padrão foram utilizadas B. thuringiensis var. israelensis T04 001, B. thuringiensis var. alesti T03 001, B. thuringiensis var. sotto T04 001 e B. thuringiensis var. tenebrionis,cedidas pelo "International Entomophatogenic Bacillus Center" do Instituto Pasteur (Paris).

Cultivo e extração de DNA total das bactérias. Os isolados de B. thuringiensis foram cultivados em placas de Petri contendo meio de cultura ágar nutriente (extrato de carne 3 g/l, peptona bacteriológica 5 g/l e ágar 15 g/l) e incubadas a 30ºC por 12h.

A extração de DNA total foi realizada utilizando-se o Kit InstaGene Matrix (BioRad), segundo as instruções do fabricante. Uma colônia de cada amostra foi ressuspensa em 1,0 ml de água Milli-Q estéril, centrifugadas por 1 min a 15.294 g e o precipitado ressuspenso em 200 µl da resina InstaGene Matrix - BioRad (em constante agitação em agitador magnético). As suspensões obtidas foram incubadas a 56°C por 25 min, agitadas em vórtex por 10 s e incubadas a 100ºC por 8 min. Em seguida, as amostras foram novamente agitadas em vórtex por 10 s e centrifugadas por 2 min a 15.294 g. O sobrenadante foi transferido para microplacas de polipropileno contendo 96 poços e armazenadas a -20ºC.

Construção dos oligonucleotídeos iniciadores. Os oligonucleotídeos iniciadores (Tabela 1) foram elaborados a partir de regiões conservadas de todas as sequências dos genes cry4Aa, cry4Ba, cry11Aa, cry11Ba, cyt2Aa, cyt1Aa e cyt1Ab para a ordem Diptera, depositadas no GenBank, obedecendo a lista de nomenclatura das ´-endotoxinas de B. thuringiensis (http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html). Para o alinhamento das sequências utilizaram-se os programas ClustalW (Thompson et al 1994) e Gene Runner 3.0 (Hastings Software, Inc.). A síntese dos oligonucleotídeos foi realizada pela MWG e Bio Synthesis. O par de oligonucleotídeo iniciador para o gene da quitinase (chi) foi o descrito por Lin & Xiong (2004) (Tabela 1).

Identificação de genes cry, cyt e chi por PCR. As reações de amplificação dos genes cry e cyt foram otimizadas de acordo com as sequências dos iniciadores e continham solução tampão 1X; 1,0-1,5 mM MgCl₂, 250 µM dNTPs, 0,6-1,0 mM de cada iniciador, 1 U Taq DNA polimerase, 2,0-5,0 µl da amostra de DNA e água destilada previamente esterilizada (q.s.p. 20 µl). Uma solução tampão contendo 0,02% BSA (albumina sérica bovina) foi adicionada à reação de PCR para amplificação dos genes cry11Ba, cyt1Aa e cyt1Ab.

O programa utilizado foi otimizado de acordo com a temperatura de pareamento de cada iniciador (Tabela 1), sendo o passo inicial de desnaturação de 5 min a 95ºC; 30-35 ciclos de 1 min a 95ºC para desnaturação, 1,0-1,5 min a 48-54ºC para pareamento dos iniciadores e 1,0-1,5 min a 72ºC para extensão; um passo final para completa extensão de 5-10 min a 72ºC.

As reações de amplificação do gene da quitinase (chi) foram conduzidas em solução tampão 1X; 1,5 mM MgCl_2; 200 nM dNTP; 200 nM de cada iniciador; 1 U Taq DNA polimerase, 2 µl da amostra de DNA e água destilada previamente esterilizada (q.s.p. 20 µl). O programa utilizado consistiu em um passo inicial de desnaturação de 5 min a 94ºC; 30 ciclos de 1 min a 94ºC, 1 min a 45ºC e 1,5 min a 72ºC; um passo adicional de 10 min a 72ºC para completa extensão. As amplificações foram realizadas em termociclador marca MJ Research, modelo PTC 100, equipado com circuito Hot Bonnet. Os fragmentos amplificados foram analisados em géis de agarose a 1,5% para os genes cry e cyt e 1,0% para o gene da quitinase (chi), contendo brometo de etídeo (0,5 µg/ml) e comparados com o marcador molecular "1kb DNA ladder" (Fermentas). Os géis de agarose foram visualizados sob luz UV e fotodocumentados em equipamento GEL DOC 2000 (BioRad), com o software Quantity-One.

Bioensaios com larvas de A.aegypti. Os isolados de B. thuringiensis positivos para presença dos genes cry e cyt díptero-específicos, além das linhagens padrão B. thuringiensis var. israelensis (controle positivo) e B. thuringiensis var. tenebrionis (controle negativo), foram submetidos às análises de dois tipos de bioensaios: o seletivo ou discriminante, onde se testou a cultura final total da bactéria e que serviu para fazer uma pré-seleção dos isolados determinando quais apresentavam atividade entomopatogênica; e o quantitativo (ou de dose), cujo objetivo foi determinar, entre os isolados pré-selecionados, quais seriam os mais tóxicos. Para isso, foi determinada a concentração necessária para causar mortalidade de 50 e 90% da população (CL₅₀ e CL₉₀).

Insetos. Utilizaram-se larvas de 3º instar de A. aegypti provenientes de ovos cedidos pelo Laboratório de Ecologia Química de Insetos Vetores, Departamento de Parasitologia da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) - Instituto de Ciências Biológicas (ICB), os quais permaneceram no LGBBA, sob as seguintes condições: 27 ± 1ºC, U.R. de 75 a 80% e fotofase de 1h (Eiras 1991). Durante o desenvolvimento, as larvas foram mantidas em cubas plásticas com água sem cloro (aproximadamente 5 cm de profundidade) e alimentadas com ração em pélets para répteis (Reptolife^®) durante todo o ciclo larval.

Preparo das suspensões bacterianas. Para o preparo das suspensões de esporos/cristal, os isolados de B. thuringiensis, incluindo as linhagens padrão, foram cultivados em placas de Petri com meio de cultura ágar nutriente e incubados a 30ºC durante cinco dias, permitindo a completa esporulação e liberação dos cristais. Após esse período, todo o conteúdo bacteriano foi transferido, com auxílio de alça de platina, para tubos de centrífuga (Falcon) contendo 10 ml de água grau Milli-Q autoclavada e 0,05% de TWEEN20^® (espalhante adesivo). A suspensão obtida foi homogeneizada e utilizada na preparação de suspensão 1,5 x 10⁷ esporos-cristal/ml, a qual foi testada no bioensaio seletivo.

Bioensaios seletivos. Os bioensaios seletivos foram realizados distribuindo-se suspensões de 1,5 x 10⁷ esporos-cristal/ml dos isolados de B. thuringiensis positivos para os genes cry e cyt (díptero-específicos), em copos descartáveis contendo 200 ml de água destilada e 20 larvas de 3º ínstar de A. aegypti. O experimento foi conduzido em quatro repetições e, para comparação dos resultados, foram incluídas as linhagens padrão B. thuringiensis var. tenebrionis (controle negativo), B. thuringiensis var. israelensis (controle positivo) e copos sem a cultura bacteriana (testemunha). A condução do experimento foi realizada em condição ambiente (25 ± 1ºC, 75% ± 5% UR, fotofase de 12h), sendo a mortalidade larval avaliada nas quatro primeiras horas, 24h e 48h após aplicação da suspensão bacteriana, sendo consideradas mortas as larvas totalmente inertes.

Para caracterizar a distribuição dos isolados quanto à mortalidade foi utilizada a técnica exploratória de agrupamento por método hierárquico utilizando como medida de semelhança entre os isolados, a distância euclidiana e como algorítimo de agrupamento o método de Ward (Hair et al 2005). Como variáveis foram utilizadas as contagens de mortalidade nos tempos de exposição dos isolados frente às concentrações das suspensões bacterianas. As análises foram processadas pelo software Statistica, versão 7 (Statsoft 2004).

Bioensaios quantitativos (CL₅₀ e CL₉₀). A CL₅₀ e CL₉₀ foram realizadas a partir de treze concentrações: 150,0; 75,0; 37,5; 18,75; 9,37; 4,68; 2,34; 1,17; 0,58; 0,29; 0,14; 0,07 e 0,03 x 10⁵ esporos-cristal/ml da cultura bacteriana de cada isolado, cultivada nas mesmas condições descritas anteriormente. Em seguida, adicionou-se a suspensão bacteriana de cada um dos isolados aos copos, seguindo as mesmas condições dos bioensaios seletivos.

Nas quatro primeiras horas e 24h após a aplicação da suspensão foi realizada a contagem do número de larvas mortas, determinando-se a CL₅₀ e CL₉₀, por meio da análise de probit, utilizando-se o programa POLO PLUS (LeOra Software Berkeley, CA) (Finney 1971).

Resultados e Discussão

Presença de genes cry, cyt e chi. A amplificação dos fragmentos de tamanho esperado foi obtida por PCR utilizando-se os pares de oligonucleotídeos iniciadores que detectam os genes cry4Aa, cry4Ba, cry11Aa, cry11Ba, cyt1Aa, cyt1Ab, cyt2Aa. As análises permitiram verificar que, dos 1073 isolados submetidos a PCR, apenas 45 (4,2% do total) apresentaram amplificação para um único gene ou para a combinação deles entre alguns isolados (Tabela 2).

A maioria dos isolados de B. thuringiensis apresentou perfis de genes cry e cyt variados, onde foi possível identificar a presença de um gene em 25 isolados, dois genes em quatro isolados, três em 10 isolados, quatro em quatro isolados e cinco em dois isolados, apresentando 14 diferentes combinações de genes. A identificação dos genes cry e cyt (díptero-específicos), mediada por PCR, revelou que as maiores frequências de perfis gênicos na coleção estudada foram para cry4Ba, cyt1Ab e a combinação dos três genes cry11Aa, cyt1Aa e cyt2Aa.

As porcentagens de isolados de B. thuringiensis que amplificaram para os genes díptero-específicos foram relativamente baixas. Apenas sete (0,7%) isolados apresentaram amplificação para o iniciador cry4Aa, 25 (2,3%) para cry4Ba, 16 (1,5%) para cry11Aa e seis (0,6%) para cry11Ba. Para os iniciadores cyt, 17 (1,6%) amplificaram para o iniciador cyt1Aa, seguidos de sete (0,7%) para cyt1Ab e 12 (1,1%) para cyt2Aa (Fig 1).

A maior frequência obtida foi para o gene cry4Ba, encontrado em 25 isolados, seguido por cyt1Aa (18), cry11Aa (17), cyt2Aa (12), cyt1Ab (8) e cry11Ba (7). Apenas a linhagem padrão B. thuringiensis var. israelensis amplificou para os sete genes estudados (Tabela 2).

Geralmente, a frequência de isolados díptero-específicos em uma coleção de B. thuringiensis é baixa quando comparada à frequência de isolados lepidópteros-específicos. A partir de 38 isolados de B. thuringiensis, Cavaleiro et al (2005) identificaram 14 isolados patogênicos, sendo 13 a insetos da ordem Lepidoptera e um a insetos da ordem Diptera, o qual apresentou perfil protéico semelhante a B. thuringiensis var. israelensis, apresentando os genes cry4A, cry4B, cry10, cry11, cyt1 e cyt2.

Duas coleções de B. thuringiensis, provenientes de ambientes terrestres e aquáticos foram caracterizadas quanto ao conteúdo de genes cry por Martínez & Caballero (2002). A maior frequência encontrada entre os isolados foi para os genes lepidópteros-específicos. Os genes cry4A, cry4B, cry10A e cry11A não foram encontrados nos isolados analisados.

Tendo em vista os casos frequentes de resistência, uma das formas de se manejá-la em populações de campo é a utilização de novos isolados de B. thuringiensis que apresentem perfis diferenciados quanto ao conteúdo de genes cry e cyt, como os encontrados nos isolados deste estudo. A presença de diferentes genes não significa que eles estejam sendo expressos; no entanto, dá um forte indício de que esses isolados poderão ser empregados na formulação de novos bioinseticidas comerciais efetivos para dípteros.

Dos 45 isolados previamente caracterizados como díptero-específicos (Tabela 2), e que foram submetidos a PCR para detecção da presença do gene chi, foram obtidos 25 (54,3%) isolados quitinolíticos, que amplificaram fragmentos de DNA de aproximadamente 2.1 kb.

Bioensaio seletivo. Dos 45 isolados (díptero-específicos) de B. thuringiensis submetidos aos testes de bioensaios seletivos, 13 (28,9%) representados na Tabela 2, apresentaram 100% de mortalidade contra larvas de A. aegypti, sendo estes submetidos aos bioensaios quantitativos para cálculo da CL₅₀ e CL₉₀.

A relação entre toxicidade e conteúdo de genes dos isolados de B. thuringiensis estudados sugere atuação conjunta das toxinas no controle de A. aegypti. Os isolados que carregam três ou mais genes díptero-específicos (cry e cyt) foram efetivos nos testes dos bioensaios seletivos, ocasionando mortalidade de 100%, igualando-se ao tratamento com a linhagem padrão B. thuringiensis var. israelensis. Alguns isolados (168, 186, 189, 574 e 582) apresentaram três combinações de genes e não apresentaram eficiência de controle contra as larvas dos insetos. Nestas combinações não estavam presentes os genes cry4Aa e cry4Ba e, nos isolados 574 e 582, o gene cry11Aa também não estava presente.

Ibarra et al (2003) identificaram novos isolados de B. thuringiensis com atividade tóxica a A. aegypti. Dentre eles, quatro foram superiores a B. thuringiensis var. israelensis, apresentando perfil protéico similar. Um deles apresentou atividade tóxica similar, mesmo contando com quatro proteínas diferentes (Cry11, Cyt1, Cyt2 e Cry30).

A importância da proteína Cry11Aa1 na toxicidade contra larvas de mosquito é conhecida (Federici et al 1990). Em alguns estudos a toxina Cry11Aa apresenta maior toxicidade em A. aegypti, Anopheles stephensi Liston e Culex pipiens L., enquanto a proteína Cyt1Aa é pouco tóxica, mas sinergisa o efeito tóxico das proteínas Cry (Gould 1998, Promdonkoy & Ellar 2000, Fernández et al 2006). As proteínas Cry4A e Cry4B também têm sido relatadas agindo sinergisticamente em larvas de mosquito (Bravo et al 2007), o que pode explicar a mortalidade causada pelo isolado 177, que não apresentou genes cyt mas apresentou os genes cry4Aa, cry4Ba e cry11Aa.

O gene cry11Aa foi encontrado em todos os isolados que apresentaram eficiência na mortalidade e em todos os períodos avaliados, havendo forte indício de que nos testes de toxicidade, a proteína Cry11Aa atue conjuntamente com, pelo menos, uma das proteínas Cyt. A combinação de pelo menos um gene cry com um dos genes cyt esteve presente nos isolados que apresentaram 100% de mortalidade. Dos três genes cyt (cyt1Aa, cyt1Ab e cyt2Aa), os mais frequentes foram cyt1Aa e cyt2Aa.

As proteínas Cyt são toxinas hemolíticas e citolíticas produzidas por muitas linhagens de B. thuringiensis, particularmente as que demonstram atividade inseticida para mosquitos. A toxicidade de Cyt1Aa às larvas de mosquitos é baixa em comparação com a de Cry4 e Cry11A (Crickmore et al 1995), o que confirma os dados obtidos neste trabalho, onde os isolados 166 e 581 apresentaram apenas o gene cyt1Aa e não foram eficazes no controle do mosquito (Tabela 2). No entanto, quando presentes em bioensaios, as proteínas Cyt adicionam à atividade de muitas toxinas Cry contra mosquitos, incluindo Cry4A, Cry4B e Cry11Aa.

A elevada associação entre as toxinas Cry e Cyt1A pode ser a base das interações sinérgicas para larvas de dípteros (Tabashnik 1992). De fato, o trabalho de Pérez et al (2005) mostrou que as toxinas Cry11Aa e Cyt1A têm a capacidade de se ligar através de epítopos existentes em ambas as moléculas. Em ensaios de interação mostrou também que a ligação de Cry11Aa à BBMF ("Brush Border Membrane Fraction") de A. aegypti foi otimizada pela presença da Cyt1A. O trabalho de Beltrão & Silva-Filha (2007), com ensaios de competição, mostrou que as toxinas Cry11Aa, Cry4Aa e Cry4Ba, unem-se especificamente à BBMF de A. aegypti, sendo alta a afinidade para os sítios de união, sugerindo que o aumento na afinidade de união poderia ter ocorrido por meio da interação sinergística com a toxina Cyt1Aa, a qual não fez parte da análise pelos autores. Esse dado reforça a idéia da necessidade de associação entre as toxinas Cry e a Cyt para a interação com o epitélio intestinal das larvas de A. aegypti.

Estudos realizados com B. sphaericus mostram que seu modo de ação, baseado na presença de uma única toxina, favorece o aparecimento de larvas resistentes de Culex quinquefasciatus Say. Wirth et al (2004) testaram combinações da toxina binária de Bacillus sphaericus, que apresenta duas proteínas (42 kDa e 51 kDa), com as toxinas de B. thuringiensis var. israelensis para larvas de C. quinquefasciatus resistentes e constataram que algumas dessas combinações foram tóxicas para as larvas, fato decorrente da maior complexidade das toxinas em ação. Avaliaram também o potencial de seleção de resistência em larvas de C. quinquefasciatus tratadas com a toxina binária sozinha ou combinada com a toxina Cyt1A do B. thuringiensis var. israelensis, observando que larvas expostas à toxina binária apresentavam resistência, enquanto a mistura da toxina binária e Cyt1A não provocava alteração na suscetibilidade das larvas (Wirth et al 2005).

A comparação da toxicidade com os diferentes genes da família Cry mostra claramente a superioridade, em termos de atividade inseticida, do gene cry11Aa, já que esteve presente nas combinações e, as combinações dos genes cry4Aa e cry4Ba mostraram-se como a segunda contribuição mais importante à toxicidade.

Quanto à importância da detecção do gene chi nos isolados, alguns trabalhos relatam que a co-aplicação de δ-endotoxinas de B. thuringiensis com quitinases bacterianas aumenta o efeito inseticida da bactéria para larvas de insetos. No entanto, não se pode relacionar o aumento da atividade inseticida dos isolados deste trabalho com a presença do gene chi, já que, dos 13 isolados que apresentaram 100% de eficiência na mortalidade, apenas sete apresentavam o gene chi e, cinco isolados, que não apresentaram o gene chi, tiveram 100% de eficiência na mortalidade das larvas, provavelmente pela ação das outras toxinas envolvidas (Tabela 2).

Bioensaio quantitativo (CL₅₀ e CL₉₀). No primeiro período avaliado, após 1h da aplicação da suspensão bacteriana, os isolados 188 e 577 apresentaram os menores valores de CL₅₀ (0,116 e 0,133 x 10⁵ esporos/ml) e CL₉₀ (0,350 e 0,485 x 10⁵ esporos/ml) (Tabela 3). A linhagem padrão B. thuringiensis var. israelensis apresentou 0,332 e 4,975 x 10⁵ esporos/ml para CL₅₀ e CL₉₀ respectivamente, semelhantes ao isolado 107 (0,294 e 3,176 x 10⁵ esporos/ml) (Tabela 3).

No segundo período de avaliação, realizado 2h após a aplicação das suspensões bacteriana, os valores de CL₅₀ para os isolados 102 e 107 foram 0,022 e 0,016 x 10⁵ esporos/ml, respectivamente. Para os isolados 188 e 577, os valores da CL₉₀ foram (0,169 e 0,113 x 10⁵ esporos/ml, respectivamente). O isolado 178 (CL₅₀ = 0,078 e CL₉₀ = 0,351 x 10⁵ esporos/ml) foi o que mais se aproximou dos valores da linhagem padrão (Tabela 3).

No terceiro período avaliado, 3h após a aplicação da suspensão bacteriana, não foi possível determinar os valores de CL₅₀ e CL₉₀ dos isolados 102, 107, 115, 188 e 577, pois os mesmos apresentaram índices de mortalidade superiores a 50%, mesmo utilizando baixas concentrações de esporos/cristal, não permitindo os cálculos. Dois isolados (106 e 531) apresentaram baixos valores (0,015 e 0,024 x 10⁵ esporos/ml) para CL₅₀ e (0,087 e 0,083 x 10⁵ esporos/ml) para CL₉₀, respectivamente. Os isolados cujos valores assemelharam-se à linhagem padrão foram 147, 154 e 576 e, nesste período, os isolados 177 e 575 apresentaram os maiores valores de CL₅₀ e CL₉₀.

O isolado 575 pode ser considerado o de menor eficiência tóxica, pois apresentou CL₅₀ e CL₉₀ elevadas nos três períodos avaliados em comparação com os outros isolados e a linhagem padrão B. thuringiensis var. israelensis.

Foram determinadas a CL₅₀ e CL₉₀ nos três períodos de avaliação dada a importância do manejo da resistência em populações de insetos, no qual é necessário que se utilizem as menores concentrações de esporos/cristal necessárias ao controle do vetor. A baixa concentração de aplicação viabiliza economicamente os custos operacionais, que normalmente são mais expressivos devido à falta de atividade residual da bactéria.

Não foi possível estimar a CL₅₀ e CL₉₀ no período de 4h e 24h após a aplicação da suspensão bacteriana pelos altos índices de mortalidade das larvas apresentados, os quais foram superiores a 50%.

A linhagem padrão B. thuringiensis var. tenebrionis utilizada como controle negativo e a testemunha, as quais não apresentaram eficiência de controle, formaram um grupo à parte quanto à mortalidade induzida em larvas do mosquito (Fig 2a). O isolado 575 foi o menos tóxico (Fig 2c). Os demais isolados 102, 106, 107, 115, 147, 154, 178, 188, 531, 576 e 577 formam um grupo conjunto com B. thuringiensis var. israelensis (Fig 2b), que apresentou melhor eficiência de controle às larvas, utilizando-se as menores concentrações de esporos-cristal/ml.

Os ensaios conduzidos neste trabalho mostraram que os isolados entomopatogênicos de B. thuringiensis provenientes de diversas regiões do território brasileiro são bastante distintos. Os isolados apresentaram diferentes combinações de genes cry e cyt (díptero-específicos) e também chi, o qual foi amplamente encontrado nos isolados de B. thuringiensis e que, atuando conjuntamente com os demais, pode aumentar a toxicidade dos isolados.

Foi possível selecionar isolados de B. thuringiensis altamente tóxicos às larvas de A. aegypti com potencial inseticida similar ao da linhagem padrão B. thuringiensis var. israelensis. A alta toxicidade desses isolados pode ser consequência da ação conjunta das toxinas Cry11Aa e Cyt1Aa identificadas, que representam uma alternativa eficiente no controle de A. aegypti, com vantagens significativas como segurança humana, baixo desenvolvimento de resistência e a possibilidade de seu uso como fonte de genes para as toxinas inseticidas, tanto para produção de novos bioinseticidas, como para transferência em diversos microrganismos aquáticos, que são fontes de alimentos para larvas de A. aegypti. Essas possíveis estratégias tornam o entomopatógeno bastante promissor no controle biológico do inseto.

Agradecimentos

Ao Prof Álvaro Eduardo Eiras e a Renata Antonaci Gama, do Laboratório de Ecologia Química de Insetos Vetores do Departamento de Parasitologia da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) e ao CNPq pelo apoio financeiro.

Received 08/I/09.

Accepted 05/II/10.

Edited by Ítalo Delalibera Jr - ESALQ/USP

Datas de Publicação

Histórico